背景非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是全球发病率和死亡率较高的癌症类型,其中男性的发病率和死亡率均位居第一位,女性的发病率和死亡率分别位居第三位和第二位。尽管对NSCLC的诊断和治疗已取得很大进展,但由于其发病机制复杂,目前仍无法彻底治愈,患者的总体预后仍然很差。WNT4是WNT蛋白家族中的重要成员,通过激活或抑制经典WNT信号通路和非经典WNT信号通路,在胚胎发育、细胞分化和组织再生等过程中发挥重要的调节作用,因此其表达或功能异常也参与癌症的发生和进展。然而,WNT4基因在NSCLC中的作用机制尚不清楚。目的本文旨在研究WNT4基因在人类NSCLC中的表达及其作用机制,为其临床诊断和治疗提供新的策略。方法1.分析WNT4基因与NSCLC进展的相关性挖掘TCGA数据库,分析WNT4基因在NSCLC组织及癌旁组织中的m RNA水平,确定NSCLC患者中WNT4基因m RNA水平与患者临床病理分期、发病年龄、复发、生存状态和总生存期等之间的相关性。2.检测过表达或敲低WNT4基因对NSCLC细胞表型的影响(1)通过q RT-Pselleck NMRCR和Western blot验证A549和H1299细胞中WNT4基因的过表达和敲低。(2)通过CCK8比色法、集落形成实验、伤口愈合实验和transwell实验检测过表达或敲低WNT4基因对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。(3)通过q RT-PCR检测过表达或敲低WNT4基因对NSCLC细胞中增殖和迁移相关基因m RNA水平的影响。(4)通过异种移植肿瘤检测过表达或敲低WNT4基因对裸鼠体内成瘤能力的影响。3.检测过表达或敲低WNT4基因对NSCLC细胞耐药性的影响用不同浓度的顺铂处理过表达或敲低WNT4基因的NSCLC细胞,通过CCK8比色法检测其活性,通过q RT-PCR和Western blot检测促凋亡相关基因表达的变化。4.检测WNT4基因是否通过激活经典WNT信号通路发挥致癌作用(1)通过单荧光素酶报告检测过表达或敲低WNT4基因对经典WNT信号通路的影响。(2)通过q RT-PCR和Western blot检测过表达或敲低WNT4基因对经典WNT信号通路组成分子和靶基因表达的影响。(3)通过Western blot检点击此处测过表达或敲低WNT4基因对经典WNT信号通路组成分子和靶基因的核质定位与表达水平的影响。5.检测经典WNT信号通路靶基因c-Myc对BCAT1的影响(1)通过TCGA数据库挖掘,分析NSCLC组织中c-Myc与WNT4或BCAT1等基因m RNA水平之间的相关性。(2)通过Western blot分析过表达或敲低WNT4基因对细胞中c-Myc和BCAT1蛋白水平的影响。(3)通过Western blot分析NSCLC组织及其癌旁组织中WNT4和BCAT1的蛋白表达水平。结果1.WNT4基因的m RNA水平与NSCLC患者临床病理参数之间的相关性NSCLC组织的WNT4基因的m RNA水平比癌旁组织水平高;NSCLC患者WNT4基因的m RNA表达水平与其临床病理分期呈正相关;年龄大于60岁的NSCLC患者组织中WNT4基因的m RNA水平较高;易复发和未存活的NSCLC患者癌组织中WNT4基因的m RNA水平较高;WNT4基因m RNA水平较高的NSCLC患者总生存期较低。2.过表达或敲低WNT4基因增强或抑制NSCLC细胞在体内外的恶性表型(1)过表达或敲低A549和H1299细胞中的WNT4基因后,WNT4基因的m RNA和蛋白水平升高或降低。(2)过表达WNT4基因能够增强NSCLC细胞在体外的增殖、迁移和侵袭能力,敲低则起相反作用。(3)过表达或敲低WNT4基因后,NSCLC细胞中CCNE1、CDK2、CDK6、Snail和RHOA等增殖和迁移相关基因的m RNA水平升高或降低。(4)过表达或敲低WNT4基因能够加快或抑制A549在裸鼠体内肿瘤的生长。3.过表达或敲低WNT4基因降低或增强NSCLC细胞对化疗药物的敏感性(1)过表达或敲低WNT4基因提高或降低了顺铂处理后细胞的存活率。(2)过表达WNT4基因能够降低促凋亡相关基因CASP3、CYCS、P21和BAX等的m RNA水平以及Cleaved PARP和Cleaved Caspase3的蛋白水平;敲低WNT4基因则发挥相反的作用。4.过表达或敲低WNT4基因激活或抑制经典WNT通路的信号转导(1)过表达WNT4基因能激活ICRT3抑制的经典WNT信号通路;敲低WNT4基因则能抑制WNT3基因激活的经典WNT信号通路。(2)过表达或敲低WNT4基因能够上调或降低CTNMedical GeneticsNB1(编码β-catenin)以及经典WNT信号通路靶基因c-Myc和CCND1的m RNA水平,Active-β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的蛋白水平。(3)过表达或敲低WNT4基因能够上调或降低细胞质和细胞核中Active-β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的蛋白水平。5.WNT4/β-catenin信号通路可能通过c-Myc调控BCAT1的表达(1)NSCLC组织中c-Myc基因与WNT4或BCAT1基因的m RNA水平呈正相关。(2)过表达或敲低WNT4基因能够上调或下调c-Myc和BCAT1的蛋白水平。(3)NSCLC组织中WNT4和BCAT1的蛋白水平高于癌旁组织。结论1.WNT4基因在NSCLC组织中高表达,并与癌症分期、发病年龄、复发和生存状态以及生存时间等临床病理参数相关。2.过表达WNT4基因能够显著增强NSCLC细胞在体外的增殖、迁移、侵袭能力以及体内的成瘤能力,而敲低WNT4基因则发挥相反作用。3.过表达WNT4基因通过抑制促凋亡基因的表达降低NSCLC细胞对顺铂的敏感性;敲低WNT4基因则发挥相反的作用。4.WNT4基因的促癌作用归因于其表达水平升高所致的经典WNT信号通路激活和靶基因c-Myc和CCND1等表达水平的升高。5.WNT4/β-catenin信号通路激活可能通过c-Myc上调BCAT1的表达,WNT4/β-catenin/c-Myc/BCAT1轴激活可能是NSCLC发生的一种新机制。