【目的】通过探索Treg细胞在1型糖尿病(Type one diabetes mellitus,T1DM)小鼠和正常小鼠中,细胞数量及功能的差异,应用体外诱导扩增培养的Treg细胞治疗T1DM,观察治疗后小鼠体内Treg细胞数量、亚型及功能的变化,以及Treg治疗的效果及安全有效剂量,正常对照组、T1DM未治疗组和T1DM治疗组(三个治疗剂量)小鼠胰腺行HE染色和免疫组化,研究Treg细胞移植后对T1DM小鼠胰岛的修复作用,检测TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-17进行差异性分析,探索Treg细胞治疗T1DM的分子机制。研究Treg细胞移植后对T1DM小鼠胰岛的修复作用。【方法】1、获取健康正常小鼠脾脏CD4~+CD25~+Treg细胞,扩增培养后检测第3、5、7、9、11、13、15天Treg细胞上清IL-10、IL-35、TGF-β含量,检测细胞活性;2、将饲养的45只8周龄体重在18-22g的C57BL/6雄性小鼠,随机分成2组:正常对照组(Control)9只;T1DM组36只。T1DM小鼠建模成功当天记为Day 0,Day0分别取Control和T1DM各3只小鼠脱颈处死测血糖、体重、饮水量、尿糖、胰岛素、C肽、Treg细胞变化及胰腺HE染色和免疫组化染色。Day1对照组6只小鼠,24只T1DM小鼠根据不同治疗剂量的Treg细胞数,随机分为4组:T1DM(6只,PBS),T1DM+Treg(6只,1×10~6/kg),T1DM+Treg(6只,5×10~6/kg),T1DM+Treg(6只,10×10~6/kg)。在Day 1和Day 14分别进行尾静脉注射PBS和Treg细胞。在Day0、Day4、Day7、Day10、Day14、Day 18、Day25、Day32、Day34天,测空腹血糖、体重、饮水量、尿糖。在Day0、Day14、Day34,检测血清中胰岛素、C肽含量;通过流式细胞术测,检测脾细胞内PBMC的Th1、Th2、Th17、TreHIV phylogeneticsg水平;取小鼠胰腺石蜡组织切片HE染色和免疫组化切片并进行胰腺炎性评分。记录不良事件和并发症,观察Treg细胞对T1DM的疗效及安全性和可能的免疫机制研究。3、实验结果采用SPSS16.0分析软件,多组间比较使用One way ANOVA进行分析,两组间应用t检验进行统计学分析:P<0.05为具有统计学意义。【结果】1、Treg细胞上清IL-10、IL-35、TGF-β含量检测:成功获取CD4~+CD25~+Treg细胞,且细胞长势良好。2、各组指标对比:(1)各组间空腹血糖(mmol/l)、STM2457配制尿量(ml)、饮水量(ml)、体重(g)比较:与对照组相比:T1DM组空腹血糖明显升高,尿量及饮水量明显增多,体重下降明显,且差异均有统计学意义;与T1DM组比较:注射Treg细胞后,治疗组血糖明显下降,多尿及多饮情况较未治疗组少,体重下降幅度小,Treg中剂量组(5×10~6/kg)及高剂量组(10×10~6/kg)均有效,高剂量组效果更明显。(2)血清中胰岛素、C肽含量检测:Day 0时,Control与对照组比较,T1DM组胰岛素、C肽含量下降明显(P<0.001)。注射Treg细胞后,Day14时,T1DM组和Treg细胞治疗组胰岛素和C肽下降明显,差异有统计学意义,P<0.001;与T1DM组进行比较,Treg细胞治疗组胰岛素、C肽水平稍有升高,但差异无统计学意义。Day34时,与Control组比较,T1DM组和Treg细胞治疗组胰岛素和C肽下降明显,差异有统计学意义,P<0.01;注射Treg细胞后,和未治疗T1DM组比较,Treg中剂量组和高剂量组C肽水平高,差异有统计学意义,P值均<0.05;高剂量组C肽水平为最高,接近正常组,P<0.001;注射Treg细胞后,Treg高剂量组胰岛素水平较T1DM组高,差异有统计学意义,P<0.05;Treg低、中剂量组胰岛素水平稍高,差异无统计学意义,Treg细胞治疗可以改善胰岛细胞功能,高剂量组效果最佳。(3)各组小鼠胰腺HE染色、胰腺炎性评分结果:与正常组相比,T1DM小鼠随着病程的延长胰腺面积逐渐减小;注射Treg细胞治疗后,胰腺面积有不同程度的增加,高剂量组(10×10~6)14d有较好的治疗效果,HE染色胰岛炎评分低。(4)免疫组化:胰岛细胞的抗胰高血糖素抗体(α细胞)表达和抗胰岛素抗体(β细胞)表达情况分析:与正常对照组进行比较,随着病情发展T1DM组α细胞面积占比逐渐增加,β细胞面积占比逐渐减小;注射Treg细胞后,β细胞面积占比较未治疗组高,α细胞面积占比较未治疗组低,且高剂量组(10×10~6)恢复最佳。(5)各组小鼠Th1、Th2、Th17、Treg水平变化情况:Day 0时,T1DM组与正常对照组进行分析,T1DM组小鼠脾细胞内Th1、Th2、Th17水平低于正常对照组,Treg高于正常对照组,但变化均无统计学差异。Day 14时,与对照组进行比较:T1DM组小鼠脾细胞内Th1、Th2水平下调,差异有统计学意义Etoposide MW,P<0.05;Th17水平下调,Treg水平上调,但差异均无统计学意义;注射Treg细胞后,与T1DM组比较,Th1、Th2细胞水平有所恢复,Th17水平有所上调,Treg水平在低、中剂量有所上调,且中剂量组Th1、Treg水平为高,低剂量组Th2水平高,高剂量组Th17水平高。Day 34时,与正常对照组比较,T1DM组较正常对照组Th2、Th17、Treg水平高,Th1较正常对照组水平低,但差异均无统计学意义;注射Treg细胞后,与T1DM组比较,低剂量治疗组Th1水平较T1DM组水平低,Th2、Th17较T1DM组水平高;中剂量治疗组Th1、Th2、Th17较T1DM组水平高;高剂量组Th1、Th2、Th17较T1DM组水平低;低、中、高剂量组Treg水平均较T1DM组水平低,差异均无统计学意义。Treg细胞对小鼠体内Th1细胞影响无规律;一定程度上Treg细胞可以调节Th2细胞占比,Day14时低剂量组为佳;Treg细胞对Th17细胞的影响各组间未见明显差异;Treg细胞可以升高小鼠体内Treg比例,Day14时中剂量组为佳。【结论】1.Treg细胞在调控T1DM病情发生发展中起着关键的作用;2.Treg细胞能有效降低T1DM小鼠的血糖、改善多饮、多尿、体重减轻症状,且高剂量组治疗效果更佳,为T1DM治疗开辟一条新的途径;3.与未治疗组比较,Treg细胞治疗组T1DM小鼠的胰岛素、C肽水平较未治疗组高,对T1DM小鼠胰岛有修复和保护作用;4.与未治疗组比较,Treg细胞治疗组的胰岛面积较未治疗组大,胰腺炎评分严重程度较未治疗组低,β细胞面积所占比例高,α细胞面积所占比例低,Treg细胞可以减缓β细胞的面积缩小和胰岛功能衰退速度,Treg治疗后胰岛炎症损伤程度降低;5.Treg细胞治疗后,可以调节Th1/Th2细胞比例水平,可以上调小鼠体内Treg细胞的比例。