目的:了解脑缺血再灌注早期24小时内血脑屏障破坏、铁死亡以及细胞凋亡的变化,筛选在再灌注早期24小时内差异表达miRNA,深入研究其调节损伤的机制,为研发多靶点脑保护药物提供参考。方法:1、评估MCAO/R模型损伤:设立再灌注2小时、4小时、8小时、12小时和24小时实验组。(1)进行Longa评分以及HE、NISSL和TTC染色;(2)灌流DiI染料观察血管灌注,灌流伊文思蓝和2000k Da FITC-Dextran观察血脑屏障渗漏;(3)进行普鲁士蓝染色;检测脑组织Fe~(2+)、MDA及GSH含量,WB测定脑组织FPN1、GPX4、TF及TFR蛋白表达。(4)同时进行TUNEL染色和IF检测EBA,WB测定BCL2、BAX和CASP3表达。2、筛选差异表达的miRNA及其靶基因(1)利用芯片对I/R2h和I/R24h组进行差异表达的miRNA筛选;RT-q PCR验证部分芯片筛选结果,选定与损伤相关的目标miRNA进行后续研究。(2)利用Target Scan及DAVID生物信息学软件预测并分析rno-miR-92a-1-5p的靶基因。(3)为了在筛Blebbistatin采购选靶基因时有更为精准的依据,利用蛋白组学技术筛选I/R2h模型中差异表达蛋白,将差异表达蛋白与靶基因相关分析结果进行比对。IHC和WB验证差异蛋白Erb B3表达。(4)利用IF和WB实验验证靶基因NRG1蛋白在脑组织细胞表达定位;在MCAO/R模型中验证其m RNA与蛋白表达趋势。3、在MCAO/R模型中验证rno-miR-92a-1-5p对血脑屏障渗漏、铁死亡以及细胞凋亡的影响(1)过表达和抑制rno-miR-92a-1-5p后,WB检测MCAO/R2h模型NRG1蛋白表达;灌流Evans Blue和2000k Da FITC-Dextran染料;进行普鲁士蓝染色。(2)过表达和抑制rno-miR-92a-1-5p后,对MCAO/R24h模型进行TUNEL染色;WB检测NRG1、BCL2、BAX以及CASP3蛋白。(3)过表达和抑制rno-miR-92a-1-5p后,检测MCAO/R24h模型Fe~(2+)、MDA及GSH含量;WB测定FPN1、GPX4、TF以及TFR蛋白表达。4、在OGD/R模型中研究rno-miR-92a-1-5p对血管内皮细胞通透性、神经细细胞铁死亡及细胞凋亡的影响和机制(1)IF鉴定原代神经元和PC12细胞。(2)对神经元以及PC12细胞设定不同OGD处理时间,于再灌注24小时后进行CCK8检测,确定OGD处理时间。(3)过表达和抑制rno-miR-92a-1-5p后,ELISA测定神经元模型培养基中NRG1蛋白含量,在RBMECS的OGD/R模型中检测不同神经元模型培养基对RBMECS模型通透性的影响。(4)在神经元和PC12细胞OGD/R模型中验证NRG1蛋白表达趋势;在星型胶质细胞、RBMECS及神经元OGD/R模型中验证Erb B3蛋白表达趋势;对RBMECS的OGD/R模型进行鬼笔环肽染色;设立不同处理组,检测经不同处理组神经元培养基共培养的RBMECS的OGD/R模型Erb B3蛋白表达并进行鬼笔环肽染色。(5)过表达和抑制rno-miR-92a-1-5p后,CCK8检测OGD/R模型的细胞活力;对神经元OGD/R模型铁死亡的研究分别进行DCFH-DA探针染色,检测Fe~(2+)、MDA及GSH含量,检测NRG1蛋白和FPN1、GPX4、TF及TFR蛋白表达。(6)过表达和抑制rno-miR-92a-1-5p后,分别利用Hochst33258检测神经元凋亡,流式细胞技术检测PC12细胞凋亡,WB检测两种细胞模型的NRG1、BCL2、BAX以及CASP3蛋白。(7)双荧光素酶报告基因实验验证rno-miR-92a-1-5p与Nrg1的结合位点。(8)在抑制rno-miR-92a-1-5p的基础上,转染sh RNA抑制NRG1,WB检测PI3K/AKT/m TOR通路蛋白、FPN1、GPX4、TF、TFR、BCL2以及BAX蛋白变化。结果:1、随着再灌注时间的延长,脑组织损伤形态逐渐明显,I/R12h和I/R24h组梗死体积最大;各组Longa评分无统计学差异;在病变侧,DiI染料灌注阳性的血管在I/R2h组明显减少,Evan Blue在I/R2h组渗漏最明显;普鲁士蓝染色和脑组织Fe~(2+)检测发现从I/R2h组开始明显出现铁离子聚集和Fe~(2+)含量增加;I/R2h和I/R4h组MDA含量明显增高;GSH从再灌注2小时起含量逐渐减少;TF和TFR分别从再灌注2小时和8小时开始明显升高;GPX4和FPN1分别从再灌注4小时及24小时开始明显降低;从再灌注4小时开始明显出现细胞凋亡;EBA阳性比例从再灌注2小时开始逐渐减少;BCL2表达从再灌注2小时开始下降;CASP3和BAX表达分别从再灌注4小时和8小时开始明显升高。2、rno-miR-92a-1-5p表达在I/R2h组明显升高。差异蛋白ErAdavosertib半抑制浓度b B3在I/R2h组表达升高。Erb B3与NRG1富集在所预测靶基因的Erb B信号通路中。3、过表达rno-miR-92a-1-5p降低MCAO/R模型中NRG1蛋白,增加微血管渗漏,增加Fe~(2+)、MDA含量、TF和TFR表达,降低GSH含量、FPN1、GPX4和BCL2表达,增加TUNEL染色阳性细胞及BAX和CASP3表达,抑制rno-miR-92a-1-5p表达后,上述结果相反。4、过表达rno-miR-92a-1-5p的神经元OGD/R2h模型培养基加重RBMECS模型通透性。敲减rno-miR-92a-1-5p后神经元OGD/R2h培养基减轻RBMECS模型的通透性,减少Erb B3蛋白表达和F-actin的集聚现象。5、过表达rno-miR-92a-1-5p降低神经元与PC12模型细胞活力,敲降后细胞活力升高。过表达rno-miR-92a-1-5p后神经元OGD/R24h模型Fe~(2+)、ROS、MDA含量、TF及TFR表达升高,GSH含量、FPN1和GPX4表达降低。而抑制rno-miR-92a-1-5p后,上述结果变化相反。6、过表达rno-miR-92a-1-5p增加神经元和PC12模型凋亡,降低BCL2表达,升高BAX与CASP3蛋白表达。而抑制rno-miR-92a-1-5p后,上述结果相反。7、NRG1与rno-miR-92a-1-5p的结合位点是Nrg1 3’UTR区的Position 978-984。8、抑制rno-miR-92a-1-5p并转染sh RNA-NRG1后,细胞模型中NRG1、p’PI3K、p’AKT、p’m TOR、FPN1、GPX4和BCL2表达下降,TF、TFR和BAX表达升高。结论:1、再灌注早期血脑屏障可逆性开放,血脑屏障渗漏和铁Chinese traditional medicine database死亡先于凋亡出现。2、rno-miR-92a-1-5p下调NRG1蛋白表达,加重再灌注2小时血脑屏障渗漏和再灌注24小时铁死亡和凋亡。3、抑制rno-miR-92a-1-5p能上调NRG1蛋白表达减轻RBMECS的OGD/R模型F-actin集聚,进一步降低其通透性,促进PI3K/AKT/m TOR通路磷酸化影响细胞铁死亡和凋亡相关蛋白表达。