研究背景:Ras相关蛋白(Rab,Ras-related protein)是小GTP酶Ras超家族中目前已知最大成员分支,主要参与细胞内膜类结构的转运、加工过程,如囊泡的出芽、形成、输运、融合以及膜结构形态的维持等。Rab家族的蛋白结构具有较高的相似性,均包含4个与GDP/GTP结合,并发挥GTP酶活性的结构域(switch Ⅰ到switch Ⅳ)以及位于C端的P结构域。在switch Ⅱ结构域中存在一段较为保守的序列,其中的丝氨酸、苏氨酸可以被帕金森病(Parkinson’s disease,PD)相关蛋白激酶——富亮氨酸重复激酶2(Leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)磷酸化修饰,从而引发神经元内囊泡转运、自噬、溶酶体功能和纤毛形成等细胞过程的障碍,参与到疾病发病机制当中。在众多的Rab家族分子中,Rab10显得格外与众不同。首先,Rab蛋白一般具有较为固定的细胞内定位和相对单一的功能,但是Rab10几乎在细胞内所有的膜类细胞器上均有分布,功能十分复杂,可以参与调节内质网动力学、神经元轴突发育、纤毛形成及纤毛内转运、溶酶体管状化和胞外分泌及细胞自噬等多个过程;其次,Rab10在不同细胞、组织和发育阶段中发挥的作用不尽相同;此外,Rab10的磷酸化与多种神经退行性疾病密切相关。有研究报acute alcoholic hepatitis道,无论是在散发性PD还是家族性PD患者脑内,均可检测到LRRK2激酶活性及Rab10磷酸化水平的异常升高。而在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者脑内同样可以检测到Rab10磷酸化水平显著增高,并且这些异常磷酸化的Rab10与AD特征性神经病理改变——tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结,具有高度的共定位。此外,Rab10还是Rab家族中与LRRK2亲和力最高的激酶底物。目前有已多项研究关注PD相关突变的LRRK2对Rab10异常磷酸化产生的效应。首先,LRRK2对Rab10的过度磷酸化会抑制细胞纤毛的发生,而促进纤毛的解聚。此外,LRRK2可以将Rab10、Rab8a和Rab35募集到发生应激的溶酶体上,并在此对它们进行磷酸化,从而促进溶酶体管状化和胞外分泌。当线粒体发生损伤时,Rab10可以在PINK1和PRKN的作用下,聚集到去极化的线粒体上,并招募自噬受体OPTN,促进线粒体自噬;而当LRRK2发生突变,激酶活性异常升高时,被磷酸化的Rab10无法再被募集到这些线粒体上,从而引发线粒体自噬障碍。但是,以上研究大多在LRRK2致病突变的体外细胞模型中展开,而Rab10磷酸化在体内,尤其是在脑内发挥的生理作用,仍亟待研究。研究目的:1.探讨Rab10 Thr73位点磷酸化对小鼠行为学表型的影响;2.探讨Rab10 Thr73位点磷酸化影响的主要脑区和细胞类型;3.探讨Rab10 Thr73位点磷酸化对脑内神经元形态、功能的影响及其分子机制。研究方法:1.构建模拟Rab10持续非磷酸化和持续磷酸化状态的小鼠模型利用CRISPR/Cas9技术,分别构建模拟Rab10持续非磷酸化状态和持续磷酸化状态的Rab10 T73V和T73D突变小鼠模型,并利用DNA测序、免疫蛋白印迹(Western Blot,WB)对Rab10的突变和表达水平进行了验证。2.检测Rab10突变小鼠的行为学表型对3月龄Rab10T73V/T73V小鼠和3月龄、5月龄、7月龄和9月龄Rab10T73D/+小鼠及同窝Rab10+/+小鼠进行一系列的行为学检测,包括:旷场试验、高架十字迷宫试验、明暗箱试验、Y迷宫试验、○迷宫试验、T迷宫试验、藏宝试验、筑巢试验、巴恩斯迷宫、加速旋转杆试验、悬尾试验、强迫游泳试验、条件性恐惧试验、代谢笼和新物体识别试验,用以检测小鼠自发活动度、焦虑样行为、重复性强迫样行为、学习记忆、抑郁样行为、运动协调能力和能量代谢等方面的表型。3.检测Rab10突变小鼠突触结构和功能的改变提取Rab10+/+及Rab10T73V/T73V小鼠纹状体、杏仁核、背侧海马、腹侧海马和前额叶皮层这5个与焦虑行为相关的脑区蛋白,WB检测VAMP1、VAMP2、Syntaxin 1、SHANK2、Synaptophysin、PSD95等突触蛋白的表达水平,确定Rab10 T73V突变影响的主要脑区。再对实验中确定的责任脑区——纹状体进行针对性检测:利用脑片膜片钳,记录中型棘突神经元(medium spiny neuron,MSN)微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic current,mIPSC)和微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC),以检测突触功能;利用透射电镜观察突触密度、突触小泡的密度和直径、突触后致密斑的长度和宽度;对纹状体脑区进行抑制性突触前、后标志物GAD67和Gephyrin,兴奋性突触前、后标志物VGLUT1和PSD95的免疫荧光染色,分析抑制性突触和兴奋性突触的密度。4.检测Rab10突变小鼠神经元和胶质细胞的密度对3月龄实验小鼠进行尼氏染色,全景扫描小鼠皮层、背侧海马及纹状体脑区切片,计数这些脑区中神经元的密度。再对小鼠进行小胶质细胞标志物Iba1和星形胶质细胞标志物GFAP的免疫组化染色,统计纹状体脑区中小胶质细胞的密度和GFAP的表达情况。5.检测Rab10突变小鼠的神经元分支及树突棘发育情况对3月龄实验小鼠进行冠状位切片及高尔基染色,使用20倍镜沿z轴多层扫描小鼠纹状体、背侧海马、腹侧海马及杏仁核脑区的全景图像,计数、测量神经元树突分支数目及长度。再对小鼠进行树突标志物MAP2的实时荧光定量PCR和免疫荧光染色,分别检测MAP2 mRNA和蛋白表达水平。此外,体外培养胚胎16.5天小鼠原代神经元,培养3天后,进行神经元轴突标志物neurofilament和树突标志物MAP2的免疫荧光染色,测量、统计神经元轴突和小神经突的数目及长度。随后使用63倍油镜,沿z轴拍摄高尔基染色切片,统计树突棘密度及各类树突棘的占比情况。6.检测Rab10突变体的差异相互作用蛋白使用天然细胞裂解液提取3月龄Rab10+/+及Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区总蛋白,利用Rab10抗体将组织中的Rab10蛋白免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)下来,应用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)定量蛋白质组学,分析野生型Rab10和Rab10 T73V突变体之间的差异相互作用蛋白,并对这些蛋白进行生物信息学分析,找到其中涉及的关键分子信号通路。研究结果:第一部分Rab10 T73V突变对小鼠的影响1.Rab10 T73V突变小鼠表现出特征性的焦虑样行为改变Rab10T73V/T73V小鼠较Rab10+/+小鼠,在旷场中央区活动的时间明显缩短。在高架十字迷宫和○迷宫中,Rab10T73V/T73V小鼠在开放臂或开放区域中活动的时间也呈现显著降低。在明暗箱试验中,Rab10T73V/T73V小鼠在明箱中活动的时间明显缩短,进入明箱的次数减少。此外,Rab10T73V/T73V小鼠在筑巢试验中撕碎的棉花相对较少,在藏宝试验中埋藏的玻璃珠数目也明显减少。而针对小鼠自发活动度、学习记忆、抑郁样行为、运动协调能力和能量代谢等方面的试验中,两组小鼠间未检测出显著差异。上述结果表明Rab10 T73V突变导致小鼠出现了焦虑样行为改变及重复性强迫样行为的损害。2.Rab10 T73V突变小鼠纹状体脑区突触蛋白表达谱发生改变,抑制性突触信号传递障碍在检测的5个与焦虑相关的脑区中,仅在纹状体脑区中检测到Rab10T73V/T73V小鼠突触蛋白表达的改变。其中,3个构成突触前SNARE复合物的蛋白VAMP1、VAMP2和Syntaxin 1及突触后膜蛋白SHANK2在Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区中表达升高。进一步检测Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区MSN突触电生理功能,发现mIPSC的频率显著降低,但波幅未出现明显改变;而mEPSC的频率和波幅均未表现出明显差异。此外,免疫荧光染色和透射电镜结果显示,抑制性突触和兴奋性突触的密度、突触后致密斑长度和宽度、突触前囊泡的密度及直径在两组小鼠间未见显著差别。这些结果提示Rab10 T73V突变损害了纹状体抑制性突触信号传导,但未对突触的结构产生显著影响。3.Rab10 T73V突变小鼠神经元密度、星形胶质细胞和小胶质细胞未出现明显改变尼氏染色并未检测到Rab10T73V/T73V小鼠与Rab1 0+/+小鼠在皮层、海马和纹状体脑区中神经元密度的差异。同时,Iba1标记的小胶质细胞和GFAP标记的星形胶质细胞在两组小鼠同样未见明显差别。因此,Rab10 T73V突变并不会对小鼠脑内神经元和胶质细胞的密度产生明显影响。4.Rab10 T73V突变小鼠纹状体脑区MSN树突分支增多高尔基染色显示,Rab10T73V/T73V小鼠纹状体MSN树突分支增多,总树突长度增长,但平均树突长度并不受影响。而背侧海马、腹侧海马及杏仁核中神经元形态均未见明显改变。进一步研究发现,与Rab1 0+/+小鼠相比,Rab10T73V/T73V小鼠纹状体脑区树突标志物MAP2的mRNA和蛋白表达水平均出现显著升高。因此,Rab10 T73V突变可以特异性地促进纹状体MSN树突的过度分支,引发神经元功能障碍。5.Rab10 T73V突变小鼠纹状体脑区MSN树突棘成熟度升高针对Rab1 0+/+和Rab10T73V/T73V小鼠不同脑区神经元树突棘进行比较、分析发现,T73V突变并不会影响脑内神经元树突棘的密度。进一步对这些树突棘进行分类比较发现,Rab10T73V/T73V小鼠纹状体MSN中成熟树突棘(短粗型、蘑菇型和分叉型)增多,占比更高;而未成熟的树突棘(丝状伪足型、细长型和细型),尤其是细型树突棘的比例显著降低。而背侧海马、腹侧海马和杏仁核神经元的树突棘成熟度未受明显影响。因而,Rab10 T73V突变可以特异性地促进纹状体MSN中树突棘过度成熟。6.T73V突变改变了 Rab10与细胞骨架组装相关的互作蛋白网与野生型Rab10相比,共有89个蛋白与Rab10 T73V突变体的结合发生改变,其中62个蛋白与Rab10 T73V突变体亲和力升高,另有27个蛋白与之亲和力降低。GO富集分析发现,这些差异结合蛋白大多定位于细胞骨架、突触、树突棘等细胞组分,与神经丝束的组装、肌动蛋白丝加帽和组装、突触囊泡的内吞、轴突发育和神经元投射的形成等生物过程密切相关。以上信息提示Rab10 T73V突变对神经元树突分支、树突棘和突触功能的影响,可能与神经元细胞骨架有关。第二部分Rab10 T73D突变对小鼠的影响1.Rab10 T73D纯合突变小鼠脑、肺和肾脏发育异常,出生时或出生后不久死亡大部分Rab10T73D/T73D小鼠在出生时或出生后1天内死亡,至断乳时,在获得的77只小鼠中仅发现1只Rab10T73D/T73D小鼠。此外,Rab10T73D/T73D新生鼠与Rab10T73D/+和Rab10+/+新生鼠相比,脑和肾脏重量明显降低,肺脏重量明显增加。HE染色发现,Rab10T73D/T73D新生鼠肺组织局部存在肺泡塌陷和肺不张,可能因此导致了新生鼠的死亡。2.Rab10 T73D杂合突变小鼠至9月龄未出现明显行为学改变3月龄、5月龄、7月龄和9月龄Rab10T73D/+小鼠在旷场试验、高架十字迷宫、Y迷宫、新物体识别试验和T迷宫中与Rab10+/+小鼠表现基本无异。因此至9月龄时,Rab10T73D/+小鼠尚未表现出焦虑和认知功能方面的行为学表型。3.Rab10 T73D突变抑制了脑内神经元树突分支的形成对仅存的一只3月龄Rab10T73D/T73D小鼠与同窝野生型对照小鼠进行高尔基染色分析发现:Rab10T73D/T73D小鼠背侧海马CA1区锥体神经元顶树突复杂度明显降低,分支减少,总树突长度缩短,但是平均树突长度并未发生显著改变;CA1区锥体神经元的基树突的分支数和总树突长度同样分别降低了 13.68%和16.68%,尽管并未达到统计学差异;Rab10 T73D突变的纹状体MSN的分支数较野生型明显减少,但平均树突长度和树突总长度并未发生改变。Rab10 T73D突变同样抑制了小鼠原代神经元轴突的发育,与Rab1 0+/+神经元相比,Rab10T73D/T73D神经元轴突数目减少,但轴突的总长度并未发生明显改变;Rab10T73D/T73D神经元小突获悉更多起数目不变,而总长度增加。以上结果提示,Rab10 T73D突变会限制神经元树突分支发育,并且这种影响不具有明显的脑区特异性。4.Rab10 T73D突变降低了脑内神经元树突棘的密度与Rab1 0+/+小鼠相比,Rab10T73D/T73D小鼠背侧海马CA1区锥体神经元和纹状PCI-32765说明书体MSN的树突棘密度均出现了显著降低。对这些树突棘进行分类统计发现,尽管Rab10 T73D突变神经元成熟和非成熟树突棘的密度均出现了降低,但各类树突棘的占比,并未发生显著改变。因此,Rab10 T73D突变主要降低了神经元树突棘的密度,但是对树突棘的成熟过程影响不大。结论及创新性:1.Rab10 Thr73位点磷酸化对纹状体参与的焦虑情绪相关神经环路至关重要,模拟Rab10持续非磷酸化状态会诱导小鼠出现焦虑样行为学改变。2.Rab10 Thr73位点磷酸化可能通过调节纹状体脑区SNARE复合物的功能,影响抑制性神经元神经递质的释放过程。3.Rab10 Thr73位点磷酸化对神经元树突分支和树突棘的发育起到重要调节作用,模拟Rab10持续磷酸化状态会阻碍神经元树突分支和树突棘的形成,而模拟Rab10持续非磷酸化状态则会特异性地诱导纹状体MSN树突分支增多、树突棘过度成熟。4.非磷酸化状态的Rab10是小鼠脑、肺和肾脏等重要组织器官发育所必须的,模拟Rab10持续磷酸化状态会导致小鼠出生时或出生后不久死亡。5.本研究利用模拟Rab10持续非磷酸化和持续磷酸化状态的小鼠模型,深入探究了Rab10 Thr73位点磷酸化在脑内的生理功能,揭示了 LRRK2对Rab10磷酸化修饰的重要生理意义,为基于LRRK2的各项治疗方案可能引发的副作用提供了实验证据支持。