Achr receptor

目的：分析综合发热门诊护理干预在HCV hepatitis C virus预防小儿热性惊厥中的应用效果。方法：选取2022年1月—2023年3月泰安市妇幼保健院selleckchem发热门诊收治的82例高热患儿作为研究对象，采用随机数字表法分为对照组和观察组，各41例。对照组实施常规门诊护理干预，观察组实施综合发热门诊护理干预。比较两组护理效果。结果：护理后，观察组热性惊厥发生率低于对照组，差异有统计学意义(P=0.023)。观察组就诊等待时间、诊治时间、退热时间均短于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。护理后30 min、1 h、6 h，观察组体温低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组血钾、血钠水平高于对照组，血糖水平低于对照组，差异有RP56976统计学意义(P<0.05)。结论：综合发热门诊护理干预措施预防小儿热性惊厥效果好，可降低患儿热性惊厥发生率，缩短治疗时间，促进体温下降，改善生化指标。

目的牙周炎是一种以牙菌斑生物膜为始动因素的慢性炎症感染性疾病,如果炎症持续存在,最终会导致牙槽骨的破坏。已知牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)在患者中的检出率较高,并且与牙周炎疾病密切相关。然而,目前还不清楚慢性牙周炎与P.gingivalis感染的病理相关性,特别是炎症反应中的相关性。了解由P.gingivalis诱导炎症应答的分子机制,可以为牙周炎的治疗提供新的思路。环状GMP-AMP合酶(Cyclic GMP-AMP synthasec,cGAS)-干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)通路是机体固有免疫信号的重要组成部分,在宿主抵御外来病原生物感染或触发自身炎症反应中发挥重要作用。本研究通过细胞水平及动物模型研究,分析P.gingivalis对cGAS-STING通路活化及牙周炎发病的影响,以探寻P.gingivalis感染引发牙周炎的可能机制。方法(1)使用P.gingivalis侵染人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblasts,HGFs),通过检测人牙龈成纤维细胞存活率的影响,活性氧水平,cGAS通路中关键分子(cGAS、STING),炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β),破骨细胞相关分子RANKL的表达变化。(2)构建P.gingivalis感染的实验性牙周炎小鼠模型。观察牙槽骨形态变化和破骨细胞阳性率的改变,检测破骨细胞相关基因(核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)、组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)),检测干扰素-β(Interferon-β,IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及其他炎症相关基因表达水平;(3)在实验性牙周炎动物模型中使用Micro-CT扫描分析牙槽骨吸收情况,检测P.gingivalis关键蛋白酶(RgpA、KGP)、Ⅰ 型干扰素基因(IFN-β)、RANKL 水平,cGAS、STING 蛋白表达,炎性因子。(4)在STING功能缺陷(StingGt)牙周炎小鼠中,检测牙槽骨炎症细胞浸润情况,炎症因子、IFN-β、RANKL、以及各组小鼠牙龈组织中巨噬细胞极化水平以及趋化因子的变化情况,探究P.gingivalis感染与cGAS-STING通路的活化情况以及Ⅰ型干扰素基因的表达变化。(5)使用STING抑制剂(SN-011)和STING激动剂(SR-717),检测其对P.gingivalis感染诱导的牙周炎In Silico Biology小鼠病情的影响及炎症细胞因子的变化情况。结果(1)细胞水平结果显示:P.gingivalis侵染HGFs 6 h后ROS水平明显高于0 h和4 h;P.gingivalis感染HGFs后,cGAS和STING基因和蛋白表达水平明显上调;同样的,P.gingivalis侵染6h后IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的表达水平显著高于0h和4h;RANKL mRNA水平相比未处理细胞提高了 1.3倍,但没有显著性差异;进一步用Western检测RANKL的表达,结果显示RANKL蛋白的表达水平升高。上述研究结果表明,P.gingivalis的确能够促进HGFs中cGAS-STING通路的活化,并诱导炎性细胞因子的表达。(2)在牙周炎动物模型中,牙周炎小鼠牙龈组织出现炎症,固有层中炎症细胞高度浸润,以及牙槽骨高度的降低和吸收增加均较明显。此外,牙周炎一侧的牙槽骨中,TRAP阳性的破骨细胞数量明显增加;破骨细胞相关基因(CTSK、MMP-ICI 46474配制9、RANKL)及炎症相关基因(IL-1β、IL-6、TNF-α、IF)的表达较对照侧升高(P<0.05);牙周炎模型小鼠的颊侧显示牙槽骨吸收增加,呈筛网状,牙根暴露,牙槽嵴的高度下降,从釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离距离增加(P<0.05);P.gingivalis毒力因子(RgpA和KGP)的mRNA表达水平显著升高;牙周炎小鼠牙龈细胞ROS的产生增加;cGAS和STING蛋白的表达明显升高;血清中促炎细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β)的表达水平显著升高;IFN-β的表达水平增加了 5倍;RANKL mRNA水平是对照组的2倍。这些结果表明,P.gingivalis感染激活了 cGAS-STING途径,导致Ⅰ型IFN基因和多种炎症细胞因子的产生,这些炎症因子有助于破骨细胞的分化和激活。(3)在WT和STING功能缺陷(StingGt)小鼠构建牙周炎动物模型。WT牙周炎小鼠有大量的炎症细胞浸润,而STING功能缺陷小鼠只有轻微的反应;STING功能缺陷小鼠分泌的炎症因子水平降低;IFN-β的表达水平降低,降低了 1.6倍;F4/80+巨噬细胞浸润明显增强,CD206+(M2标志物)细胞增加,CD11c+(M1标志物)细胞减少;趋化因子(CCR2和CCL2)水平明显下降;牙槽骨吸收减少;RANKL的表达减少。以上结果表明,在P.gingivalis感染诱导的cGAS-STING信号通路中,STING功能缺失会降低Ⅰ型干扰素基因的表达。(4)用STING抑制剂(SN-011)或激动剂(SR-717)治疗牙周炎小鼠,相较PBS组,SN-011可显著降低炎症细胞因子的产生和破骨细胞的形成(P<0.01);SR-717组牙周炎小鼠STING蛋白的表达水平升高,而SN-011组STING蛋白的表达水平下降;SR-717治疗组的炎症细胞因子水平显著升高(P<0Ferrostatin-1.01),而SN-011治疗组的炎症细胞因子水平显著降低(P<0.01);此外,SN-011治疗组小鼠炎症细胞数量减少,而SR-717治疗组小鼠牙周组织有大量炎症细胞浸润,组织学评分均有明显差异(P<0.01);SR-717治疗组的M1巨噬细胞(CD11c+F4/80+)数量明显增加,M2巨噬细胞(CD206+F4/80+)数量减少,而SN-011治疗组表现出抑制M1巨噬细胞极化和促进M2巨噬细胞极化;SR-717治疗组的趋化因子(CCR2和CCL2)水平明显增加,而SN-011治疗组的趋化因子水平明显下降。以上结果表明,STING抑制剂SN-011可减少P.gingivalis诱导的牙槽骨吸收。结论:以上结果共同证实了我们的假设,即P.gingivalis激活cGAS-STING信号通路,导致随后的促炎症细胞因子和Ⅰ型IFN基因的表达,这些促炎细胞因子增强了巨噬细胞的激活和破骨细胞的生成,从而促进了牙周炎的发病机制。STING的小分子抑制剂SN-011可以减少巨噬细胞的激活,缓解牙槽骨的破坏。这些发现可能有助于我们更好地理解P.gingivalis诱导的牙周炎的发病机制,并为牙周炎的预防和治疗提供线索。

目的牙周炎是一种以牙菌斑生物膜为始动因素的慢性炎症感染性疾病,如果炎症持续存在,最终会导致牙槽骨的破坏。已知牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)在患者中的检出率较高,并且与牙周炎疾病密切相关。然而,目前还不清楚慢性牙周炎与P.gingivalis感染的病理相关性,特别是炎症反应中的相关性。了解由P.gingivalis诱导炎症应答的分子机制,可以为牙周炎的治疗提供新的思路。环状GMP-AMP合酶(Cyclic GMP-AMP synthasec,cGAS)-干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)通路是机体固有免疫信号的重要组成部分,在宿主抵御外来病原生物感染或触发自身炎症反应中发挥重要作用。本研究通过细胞水平及动物模型研究,分析P.gingivalis对cGAS-STING通路活化及牙周炎发病的影响,以探寻P.gingivalis感染引发牙周炎的可能机制。方法(1)使用P.gingivalis侵染人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblasts,HGFs),通过检测人牙龈成纤维细胞存活率的影响,活性氧水平,cGAS通路中关键分子(cGAS、STING),炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β),破骨细胞相关分子RANKL的表达变化。(2)构建P.gingivalis感染的实验性牙周炎小鼠模型。观察牙槽骨形态变化和破骨细胞阳性率的改变,检测破骨细胞相关基因(核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)、组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)),检测干扰素-β(Interferon-β,IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及其他炎症相关基因表达水平;(3)在实验性牙周炎动物模型中使用Micro-CT扫描分析牙槽骨吸收情况,检测P.gingivalis关键蛋白酶(RgpA、KGP)、Ⅰ 型干扰素基因(IFN-β)、RANKL 水平,cGAS、STING 蛋白表达,炎性因子。(4)在STING功能缺陷(StingGt)牙周炎小鼠中,检测牙槽骨炎症细胞浸润情况,炎症因子、IFN-β、RANKL、以及各组小鼠牙龈组织中巨噬细胞极化水平以及趋化因子的变化情况,探究P.gingivalis感染与cGAS-STING通路的活化情况以及Ⅰ型干扰素基因的表达变化。(5)使用STING抑制剂(SN-011)和STING激动剂(SR-717),检测其对P.gingivalis感染诱导的牙周炎In Silico Biology小鼠病情的影响及炎症细胞因子的变化情况。结果(1)细胞水平结果显示:P.gingivalis侵染HGFs 6 h后ROS水平明显高于0 h和4 h;P.gingivalis感染HGFs后,cGAS和STING基因和蛋白表达水平明显上调;同样的,P.gingivalis侵染6h后IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的表达水平显著高于0h和4h;RANKL mRNA水平相比未处理细胞提高了 1.3倍,但没有显著性差异;进一步用Western检测RANKL的表达,结果显示RANKL蛋白的表达水平升高。上述研究结果表明,P.gingivalis的确能够促进HGFs中cGAS-STING通路的活化,并诱导炎性细胞因子的表达。(2)在牙周炎动物模型中,牙周炎小鼠牙龈组织出现炎症,固有层中炎症细胞高度浸润,以及牙槽骨高度的降低和吸收增加均较明显。此外,牙周炎一侧的牙槽骨中,TRAP阳性的破骨细胞数量明显增加;破骨细胞相关基因(CTSK、MMP-ICI 46474配制9、RANKL)及炎症相关基因(IL-1β、IL-6、TNF-α、IF)的表达较对照侧升高(P<0.05);牙周炎模型小鼠的颊侧显示牙槽骨吸收增加,呈筛网状,牙根暴露,牙槽嵴的高度下降,从釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离距离增加(P<0.05);P.gingivalis毒力因子(RgpA和KGP)的mRNA表达水平显著升高;牙周炎小鼠牙龈细胞ROS的产生增加;cGAS和STING蛋白的表达明显升高;血清中促炎细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β)的表达水平显著升高;IFN-β的表达水平增加了 5倍;RANKL mRNA水平是对照组的2倍。这些结果表明,P.gingivalis感染激活了 cGAS-STING途径,导致Ⅰ型IFN基因和多种炎症细胞因子的产生,这些炎症因子有助于破骨细胞的分化和激活。(3)在WT和STING功能缺陷(StingGt)小鼠构建牙周炎动物模型。WT牙周炎小鼠有大量的炎症细胞浸润,而STING功能缺陷小鼠只有轻微的反应;STING功能缺陷小鼠分泌的炎症因子水平降低;IFN-β的表达水平降低,降低了 1.6倍;F4/80+巨噬细胞浸润明显增强,CD206+(M2标志物)细胞增加,CD11c+(M1标志物)细胞减少;趋化因子(CCR2和CCL2)水平明显下降;牙槽骨吸收减少;RANKL的表达减少。以上结果表明,在P.gingivalis感染诱导的cGAS-STING信号通路中,STING功能缺失会降低Ⅰ型干扰素基因的表达。(4)用STING抑制剂(SN-011)或激动剂(SR-717)治疗牙周炎小鼠,相较PBS组,SN-011可显著降低炎症细胞因子的产生和破骨细胞的形成(P<0.01);SR-717组牙周炎小鼠STING蛋白的表达水平升高,而SN-011组STING蛋白的表达水平下降;SR-717治疗组的炎症细胞因子水平显著升高(P<0Ferrostatin-1.01),而SN-011治疗组的炎症细胞因子水平显著降低(P<0.01);此外,SN-011治疗组小鼠炎症细胞数量减少,而SR-717治疗组小鼠牙周组织有大量炎症细胞浸润,组织学评分均有明显差异(P<0.01);SR-717治疗组的M1巨噬细胞(CD11c+F4/80+)数量明显增加,M2巨噬细胞(CD206+F4/80+)数量减少,而SN-011治疗组表现出抑制M1巨噬细胞极化和促进M2巨噬细胞极化;SR-717治疗组的趋化因子(CCR2和CCL2)水平明显增加,而SN-011治疗组的趋化因子水平明显下降。以上结果表明,STING抑制剂SN-011可减少P.gingivalis诱导的牙槽骨吸收。结论:以上结果共同证实了我们的假设,即P.gingivalis激活cGAS-STING信号通路,导致随后的促炎症细胞因子和Ⅰ型IFN基因的表达,这些促炎细胞因子增强了巨噬细胞的激活和破骨细胞的生成,从而促进了牙周炎的发病机制。STING的小分子抑制剂SN-011可以减少巨噬细胞的激活,缓解牙槽骨的破坏。这些发现可能有助于我们更好地理解P.gingivalis诱导的牙周炎的发病机制,并为牙周炎的预防和治疗提供线索。

背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一。铁死亡是一个依赖铁的细胞死亡过程,有别于自噬、细胞凋亡、坏死一种新型细胞程序性死亡方式。此外,驱动HCC发展和进展的长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的异常表达也越来越受到关注。本课题旨在通过铁死亡相关lncRNAs差异基因初步建立一个可以反映肝细胞癌患者生存情况的预后模型,并对3个铁死亡相关lncRNAs在肝细胞癌中的作用在细胞水平上进行初步探索。材料和方法:从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和Ferr Db数据库中收集了与铁死亡相关的lncRNAs表达谱以及临床病理情况。通过对总生存期(overall survival,OS)的共表达分析,探究了铁死亡相关lncRBLZ945使用方法NAs(FRlncRNAs)与HCC患者生存期的关系。对所筛选的lncRNAs进行GO和KEGG富集分析探索其生物学功能。利用LASSO算法和Cox回归分析,最终获得了由22个差异表达的lncRNAs构建的预后模型。使用ss GSEA量化高低风险组之间的肿瘤浸润免疫细胞亚群,并评估其免疫功能。使用q RT-PCR对MIR4435-2HG、PRRT3-AS1、SNHG4的差异表达在HCC患者和健康人群的PBMC中,以及3种肝癌细胞系中进行验证。并进一步探究铁死亡诱导剂Erastin、RSL3和抑制剂lip-1对这3个lncRNAs的影响。结果:Kaplan-Meier分析显示,高风险的lncRNAs与HCC的不良预后有关。我们的风险评估模型在预测HCC的预后方面优于传统的direct immunofluorescence临床数据。GSEA揭示了高风险组和低风险组个体的免疫和肿瘤相关通路。此外,TCGA显示T细胞功能,其中包括细胞溶解、B细胞、辅助T细胞、中性粒细胞、NK细胞、巨噬细胞、MHC-I类、肥大细胞、I型-IFN和II型-IFN,在高风险组和低风险组之间有明显差异。免疫检查点如TNFSF18、IDO2、CD276、NRP1和TNFSF4在两个风险组之间也有不同表达。而比较高低风险组之间m6A相关的m RNA表达表明,RBM15、HNRNPC、YTHDC1、YTHDStaurosporine分子量F1、WTAP、METTL3、ALKBH5、YTHDF2、FTO的表达有统计学意义。选取MIR4435-2HG、SNHG4、PRRT3-AS1在HCC患者PBMC和肝癌细胞系中验证,结果显示这3个lncRNAs表达均上调。接下来,在肝癌细胞系中加入铁死亡诱导剂Erastin、RSL3,显示3个lncRNAs均表达降低,再加入铁死亡抑制剂Liproxstatin-1(lip-1)后表达呈回升趋势。结论:1.通过生物信息学软件构建了由22个铁死亡相关lncRNAs组成的用于预测肝癌预后的模型;2.在这22个lncRNAs中选取了3个lncRNAs进行Kaplan-Meier生存分析,结果显示,其均在肝癌组织中高表达且预后较差;3.对上述3个lncRNAs在HCC患者和健康人群的PBMC中进行实验验证,证明其在HCC患者PBMC中高表达,这与生存分析中它们在肝癌组织中高表达的结果基本一致;4.进一步在肝癌细胞中验证,证明这3个lncRNAs在肝癌细胞系中高表达,结果与PBMC中结果一致;5.通过铁死亡相关性检测,发现这3个lncRNAs在肝癌细胞中对铁死亡敏感;6.这些lncRNAs可以影响肝细胞癌患者预后,并有望为肝细胞癌诊断、靶向治疗及预后评估提供新的研究方向。

目的 分析股骨头坏死ARCO 2期CT征象对新发骨质吸收区的预测价值。方法 回顾性分析2011年至2017年进行髋关节CT检查国际骨微循环研究协会(Association ResearchBMN 673浓度 Circulation Osseous,ARCO)2期的股骨头坏死94例患者(F/M=24/70,中位年龄41.0(33.3-54.0)岁)。评估初次CT检查的征象,包括骨质坏死的位置、ARCO分期范围、密度和增生反应区的形态。根据随访3年有无骨质吸收区将病例分为新发骨质吸收组和无骨质吸收组。对比两组CT征象的差异,并MDV3100半抑制浓度分析单一和CT征象组合对新发骨质pneumonia (infectious disease)吸收区的预测价值。结果 骨质坏死位于中外侧柱或内中外侧柱、坏死范围大于30%及增生反应区呈横行在新发骨质吸收组显著多于无骨质吸收组。CT征象组合2(骨质坏死位置、坏死范围及增生反应区呈横行形态)对新发骨质吸收区的预测价值最大,曲线下面积(Area Under Curve,AUC)为0.79,敏感性和特异性分别为89.13%和62.50%,阈值>1。结论 如果骨质坏死区位于中外侧柱或内中外侧柱,坏死范围大于30%,且增生反应区呈横行,则易发生骨质吸收区,应密切随访。

【目的】深度学习方法能够从大量数据中识别出有用的特征的特性适用于高维和稀疏的单细胞转录组数据中，已被广泛应用于细胞分型，拟时序构建和发育轨迹分析。自编码器作为一种深度学习算法，在单细胞转录组数据降维和插补分析上，有着独特优势。本研究旨在评LXH254分子量估自编码器AutoClass应用在猪早期胚胎单细胞转录组数据中的可行性，以及探究不同胚胎激活方式对关键基因和信号传导通路的影响。【方法】本研究收集了3种不同激活方式（体内受精、体外授精和孤雌）的猪早期胚胎单细胞转录组数据，采用AutoClass进行数selleck化学据质控和插补分析，结合下游分析评估AutoClass性能。此外，通过差异表达基因（Differential expression genes， DEGs）和功能富集分析，深入比较了3种类型胚胎的关键基因和信号通路。【结果】经过数据质控和自编码器数据插补，聚类分析精度提高，不同激活方式的早期胚胎聚类清晰。单独质控只筛选出1287个DEGs，而自编码器插补后，DEperiprosthetic infectionGs数目增加至11523个。功能富集分析进一步挖掘出3种不同类型胚胎间显著差异的关键生物学过程和信号通路，如体内受精胚胎的基础生物学过程和细胞代谢；体外授精胚胎的性腺发育和性别决定；以及孤雌生殖胚胎的免疫防御和分泌途径调节。【结论】本研究采取自编码器提高单细胞转录组数据的分析精度，揭示了3种胚胎激活方式影响早期胚胎发育的关键基因和信号通路，为深入研究猪早期胚胎发育的分子机制提供了新见解和新思路。

目的 探讨基于消融指数(AI)的射频消融(RFA)术对心房颤动(AF)患者血小板活化、心脏自主神经功能的影响。方法 选取2020年1月至2022年5月南阳市中心医院80例AF患者，根据治疗方案分组，各40例。对照组基于接触压力参数行RFA术，观察组基于消融指数行RFA术。两组手术相关指标、AF复发率、手术前后血小板活化指标[血小板α颗粒膜蛋白(GMP-140)及血小板膜CD62P、CD63]、24 h内窦性RR间期总体标准差(SDNN)、左心房前后径(LAD)、24 h内5 min RR间期平均值的标准差(SDANN)、左心房容积(LAV)、左心室射血分数(LVEF)、相邻RR间期差值的均方根(RMSSD)及高频/低频(HF/LE)。结果 观察组PVI单圈隔离率高于对照组，X线透视、消融及手术总时间短于对照组(P<0.05),两组电复律使用率差异无统计学意义(P>0.05)。术后1～3 d,两组GMP-140、CD62P、CD63先升高后下降，且观察组低于对照组(P<0.05);两组术后即刻、术后1个月LAD、LAV、HF/LE较术前下降(P<0.05),SDNN、SDANN、LVEF、RMSSD水平较术前升高(P<0.05),组间差异无统计学意义(P>0.05)。观察组AF复发率低于对照组(P<0.05)。结论 基于AI行RFA术治疗AF患者，有效缩短了消融及手术总时间，提高PVI单圈隔离FG-4592溶解度率，抑制血小板活化，降低复发风险，促进左心房结构及心脏自Non-HIV-immunocompromised patients主神经功能恢复，且不会提高电复律使用率，有益PF-07321332于术者安全、高效地完成手术。

红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)和须癣毛癣菌(T.mentagrophytes)是皮肤癣菌病最常见的致病菌,这种疾病影响到全世界数百万人。分泌性蛋白酶是皮肤癣菌侵袭宿主的重要毒力因子。皮肤癣菌拥有多拷贝的分泌性蛋白酶编码基因,这些分子在不同条件(如底物、pH等)下呈现差异性表达。研究目的:选取最具有代表性的红色毛癣菌和须癣毛癣菌作为实验菌株,探讨两种癣菌的生长特性,研究M35家族在两种癣菌中的表达差异,并且构建了其中恒定高表达的Np IIc和Np IId两个分子基因敲除模型,初步探讨其在癣菌侵袭宿主过程中的作用。实验方法:主要包含以下六部分,简述如下:1.真菌培养与鉴定通过宏观表型、微观结构以及分子生物学技术对红色毛癣菌和须癣毛癣菌进行鉴定,并对这两种真菌的菌落形态以及镜下结构进行比较分析。2.不同营养成分对红色毛癣菌和须癣毛癣菌生长特性的影响将红色毛癣菌和须癣毛癣菌接种于不同营养成分(氨基酸、葡萄糖、角质粉)的培养基上,动态观察菌落的生长速率、菌落形态和颜色等变化并拍照记录。3.筛选刺激红色毛癣菌和须癣毛癣菌分泌蛋白酶的培养体系以Tr1(毛癣菌琼脂培养1号)培养基为基本对照,增减其他营养成分(氨基酸、葡萄糖、角质粉)为实验组,并向培养基中加入天青角蛋白,动态检测各培养体系蛋白酶分泌情况并拍照记录。4.不同pH条件红色毛癣菌和须癣毛癣菌M35家族的基因表达变化建立刺激分泌蛋白酶的培养体系,并将pH值调至4,6和8,收获菌丝进行总RNA提取和反转录获得c DNA,并采用实时荧光定量PCR技术检测在不同pH值下M35家族中各基因的表达情况。5.CRISPR/Cas9技术构建红色毛癣菌NpⅡc和NpⅡd基因突变株针对基因特异性片段,设计引物;体外转录得到sgRNA,将sgRNA和Cas9蛋白以及Ura3片段一同转化至菌株STRB18(ΔURA3)原生质体中,随着对目的DNA的定位和切割形成双链缺口,细胞通过外源性Ura3片段对缺口进行修复造成基因突变,并通过双向营养筛选方式选出目的转化子,对其提取DNA进行PCR扩增验证及测序验证。6.野生型与基因突变型菌株角蛋白酶分泌的动态测量通过添加天青角蛋白(keratin-azure)结合分光光度法,对红色毛癣菌野生型,基因突变型SCNB19(ΔNpⅡc)和SCNB20(ΔNpⅡd)分泌的角蛋白酶进行测定。实验结果:按以下六部分进行简述1.真菌培养与鉴定TDirect genetic effectsr1培养基上红色毛癣菌正面表现为蓬松至绒毛状的红色菌落;须癣毛癣菌正面则表现为颗粒状至粉状的淡黄色菌落,生长速度较红色毛癣菌快。显微镜下观察红色毛癣菌的菌丝为间隔状,典型直角分枝。须癣毛癣菌可观察到圆形或卵圆形小分生孢子,呈葡萄串样排列。2.不同营养成分对红色毛癣菌和须癣毛癣菌生长特性的影响红色毛癣菌和须癣毛癣菌在培养基中均呈放射性生长,红色毛癣菌在未经改良的Tr1培养基和SC培养基上生长最为旺盛。在只含有氨基酸的培养基上生长水平稍差。在角质粉培养基中菌落密度最稀疏。红色毛癣菌在加葡萄糖培养基中可产生色素,不加时无法产生色素。须癣毛癣菌生长状态与红色毛癣菌基本相似,除了在SC基础培养基中,须癣毛癣菌生长速率明显较其他培养基慢,但产生色素最丰富。3.筛选刺激红色毛癣菌和须癣毛癣菌分泌蛋白酶的培养体系第2周时,在角质粉培养基中可以明显观察到蓝色,提示外泌性蛋白酶的分泌。而在其他培养基中均未出现颜色改变。4.不同pH条件红色毛癣菌和须癣毛癣菌M35家族的基因表达变化在红色毛癣菌和须癣毛癣菌中,M35家族中的NpⅡa、NpⅡb和NpⅡe在不同pH值下表达相对稳定且表达量较低。NpⅡc在红色毛癣菌中具有高水平表达,而在须癣毛癣菌中,NpⅡd表达量较其他M35家族蛋白酶高。除此之外,还可以发现M35家族基因表达在酸性及偏中性条件较碱性条件活跃。5.CRISPR/Cas9技术构建红色毛癣菌NpⅡc和NpⅡd基因突变株通过双向营养筛选选出目的转化子,对其提取DNA进行PCR扩增验证并测序比对,结果提示URA3基因片段成功插入NpⅡc和NpⅡd基因中,成功获得ΔNpⅡc突变菌株SCNB19和ΔNpⅡd突变菌株SCNB20。6.野生型与基因突Z-VAD-FMK试剂变型菌株角蛋白酶分泌的动态测量在所有检测时间点中GW-572016,野生型的蛋白酶活性均高于基因突变型菌株。在第5天时,野生型菌株与SCNB20的蛋白酶活性到达了一个高峰期,SCNB19则在第7天。在第15天时,红色毛癣菌野生型和基因突变型产酶几乎一致随后逐渐上升并在第20天时再次达到一个高峰。结论1.通过在不同营养成分对红色毛癣菌和须癣毛癣菌生长特性的影响实验中,发现:1)仅有碳源(葡萄糖)而没有氮源的情况下,皮肤癣菌无法生长;2)若无碳源(葡萄糖)的情况下,氮源可以同时作为碳源与氮源;3)氮源的种类(氨基酸或角质粉)不同,皮肤癣菌生长形态也随之不同,在氨基酸营养条件下皮肤癣菌生长更好;4)葡萄糖可能对皮肤癣菌色素的产生起重要作用。2.酸性环境和角质粉均有助于诱导M35家族蛋白酶的表达。3.NpⅡc和NpⅡd对溶解角质、激活癣菌致病具有重要意义,但是推测其生物学功能不止角质溶解作用,其更多的分子功能需要进一步探索。4.皮肤癣菌中蛋白酶基因的富集允许对蛋白酶的分泌进行复杂的调节,以应对外界环境的不断变化。

烷基糖苷作为新一代非离子、无毒、低刺激性和可生物降解的表面活性剂,具有广泛的用途。烷基糖苷可通过化学法和酶法合成。其中,化学法合成须在极端的条件下进行,并且需要保护和去保护过程,使用有毒的催化剂,反应的产物是烷基多糖苷的复杂混合物。酶法合成能克服化学合成的缺点,获得结构明确的烷基糖苷。糖苷酶易于生产,经济实惠,兼具底物特异性和高立体选择性,是合成烷基糖苷优异的候选酶源。来源于嗜热菌Thermotoga naphthophila RUK 10的β-半乳糖苷酶Tn1577可在75℃以上的高温下催化烷基糖苷的合成,且在有机溶剂中具有较好的稳定性。但是,由于糖苷酶同时具有水解和转糖基活性,导致转糖基化反应的产率降低,限制了糖苷酶在转糖基化反应中的应用。为此,本文通过对Tn1577进行分子改造,期望提高Tn1577的转糖基/水解比,从而提高烷基半乳糖苷的产率,并拓宽酶的底物特异性。通过酶与底物的分子对接、序列比对,以提高烷基糖苷产率为目标设计了9个定点突变体,R012V、https://www.selleck.cn/products/r-gne-140.htmlR102W、W183F、W183G、H271S、E314I、R353Q、E362G和E362D。利用全质粒PCR进行定点突变构建了突变体VX-765分子量蛋白表达菌株。经热处理、Ni-NTA亲和层析得到纯化酶,对突变体基本酶学性质进行表征并用于合成烷基糖苷。结果显示,H271S和R353Q水解o-NPG的活力是野生酶2.0和1.3倍,H271S和R102V对乳糖水解活力有所提高,其余突变体水解乳糖活力均低于野生酶。大多数突变体的最适温度与最适p H未发生明显变化。H271S合成丁基、己基半乳糖苷和辛基半乳糖苷的活力分别为野生酶的1.6倍、1.8倍和2.7倍。R102W和R353Q合成辛基半乳糖苷的产量为野生酶1.7倍和1.4倍,其转糖基/水解比为野生酶的2.3倍和3.1倍。通过定点突变,获得immune exhaustion了转糖基活力提高及对长链脂肪醇活力提高的单点突变体。W183F和R353Q合成的己基半乳糖苷的产率与野生酶持平,但其水解乳糖的活力只有野生酶的12.8%和45.7%,可减少对原料乳糖的水解,持续合成烷基糖苷,降低生产成本。GH42家族糖苷水解酶已解析11个三维结构,但都未能揭示结构域C的功能,本文设计了删除结构域C的截短突变体V594,经酶学性质表征,对结构域C的功能进行初步探究。结果显示,V594水解o-NPG和乳糖的最适温度和p H没有变化,但水解o-NPG的活力比野生酶提高了近1倍,对乳糖的水解活力损失了约20%。DSC分析和稳定性实验表明,V594的热稳定性和p H稳定性明显降低,表明结构域C对酶的水解活力影响较小,对维持酶的稳定性具有重要作用。综上所述,我们成功获得了转糖基/水解比升高的定点突变体,并且提高了合成烷基糖苷的产率,拓宽了酶对长链脂肪醇的活力,对烷基糖苷的生物合成具有重要价值。探索发现结构域C可能与酶的稳定性相关,也为GH42家族β-半乳糖苷酶的结构-功能关系研究提供依据,为其未来改造提供新思路。

近年来,磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate,TPHP)及其肝脏代谢产物磷酸二苯酯(Diphenyl phosphate,DPHP)、全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonic acid,PFOS)及其替代品全氟壬烯氧基苯磺酸钠(Sodiumρ-perfluorous nonenoxybenzene sulfonate,OBS)是环境介质及人体中最常检出的有机磷酸酯(Organophosphate esters,OPEs)和全(多)氟烷基化合物(Per-and poly-fluoroalkyl substances,PFASs)。已有研究表明,肝脏是OPEs及PFASs的主要富集或代谢器官,但目前OPEs及PFASs对肝细胞的毒性效应和分子机制的相关研究还很匮乏。本实验以人正常肝细胞(L02)为实验对象,Medicare savings program从细胞水平研究TPHP、DPHP、PFOS及OBS对肝细胞的损害,并通过转录组测序(RNA sequence,RNA-seq)全面分析并比较目标污染物对肝细胞造成的系统毒性。此外,在活体水平上验证Captisol纯度了TPHP对肝脏的毒性及机制。研究得出如下主要结论:(1)TPHP比DPHP表现出更强的肝细胞毒性。胰岛素抵抗是TPHP引起肝细胞最显著的毒性之一,TPHP暴露后能够显著降低胰岛素刺激下的葡萄糖摄取与糖原合成,并且使内质网应激标志基因的m RNA显著上调,而DPHP暴露后没有显著变化。内质网应激的特异性抑制剂4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)可明显逆转TPHP引起的毒性效应。与DPHP相比,TPHP暴露可通过内质网应激诱导更强的胰岛素抵抗。(2)高浓度(80 mg/kg)的TPHP能够显著降低C57BL/6J小鼠体重及肝糖原的含量,并且导致小鼠餐后血糖显著上升,干扰机体内的糖代谢;同时TPHP暴露可引起实验小鼠肝脏的内质网应激相关基因m RNA显著上调。添加4-PBA后会逆转TPHP暴露引起的毒性效应,所以TPHP暴露能够诱导小鼠肝脏内质网应激和胰岛素抵抗。(3)OBS具有与PFBYL719体外OS不完全相同的肝细胞毒性机制。PFOS和OBS诱导的肝细胞毒性分别集中在类固醇合成和ECM-受体相互作用等相关通路,PFOS暴露后胆固醇(Total Cholesterol,TC)水平显著下降,而OBS暴露后细胞外基质标志基因m RNA水平显著升高。OBS比PFOS造成的L02细胞凋亡、铁死亡水平以及促炎细胞因子的含量更高。这些均表明OBS具有比PFOS更强的肝细胞毒性,并不是理想的PFOS替代品。