第一部分 青蒿琥酯新型眼内缓释制剂的稳定性研究目的以辅料对青蒿琥酯(artesunate,ART)进行包含,分别制备三种不同浓度的青蒿琥酯新型眼内缓释制剂,并考察其在高温、强光照射、冻融、加速以及长期存放条件下的稳定性。方法1.采用特殊辅料对青蒿琥酯进行包含,制备低(30%)、中(40%)、高(50%)浓度青蒿琥酯眼内缓释制剂。2.建立高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography,HPLC)考察三浓度的青蒿琥酯眼内缓释制剂在高温、强光照射、冻融、加速以及长期存放条件下的稳定性。结果低、中、高三浓度的青蒿琥酯缓释制剂在高温及光照条件下不稳定,温度越高,含量下降和有关物质增加的现象越明显;在常温避光条件下稳定性良好。结论通过辅料包合技术制备的青蒿琥酯眼内缓释制剂在常温避光PCI-32765 molecular weight条件下稳定性良好。第二部分青蒿琥酯新型眼内缓释制剂视网膜毒性评价目的观察三种浓度的ART新型眼内缓释制剂兔眼玻璃体腔注射后对视网膜的影响,以评估该药物在兔眼内的生物相容性,为后续实验提供初步的眼部用药安全性信息。方法1.将筛选出的符合实验要求的青紫蓝兔分为正常对照组、空白基质组、ART眼内缓释制剂低、中、高浓度组,于玻璃体腔给药前和给药后第7、14、21、28天行裂隙灯显微镜检查、眼前节照相、眼底照相、视网膜光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)检查,对眼部情况进行评价。2.于玻璃体腔给药后第7、14、21、28天行视网膜铺片以及视网膜苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE),观察给药后视网膜病理组织变化。结果裂隙灯检查、眼前节照相、眼底照相检查均未见明显的眼部异常改变,视网膜OCT检查、视网膜铺片、视网膜HE染色未见视网膜颜色、厚度、各层形态结构的异常改变。结论空白基质和ART新型眼内缓释CP-456773体外制剂兔眼单次玻璃体腔注射后没有眼刺激性,未造成明显视网膜毒性,具有良好的眼内生物相容性。第三部分青蒿琥酯新型眼内缓释制剂对青紫蓝兔实验性自身免疫性葡萄膜炎的抑制作用和机制研究目的通过DAPT阻断Notch信号通路,探究Notch信号通路在葡萄膜炎发生发展过程中的作用;评估ART新型眼内缓释制剂对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)青紫蓝兔炎症的抑制作用并探讨潜在作用机制,为ART治疗葡萄膜炎提供体内实验依据。方法1.通过对青紫蓝兔皮下注射弗氏完全佐剂(freund’s complete adjuvant,FCA)-结核分枝杆菌H37Ra混悬液(FCA H37Ra)及玻璃体腔注射H37Ra建立EAU模型,将青紫蓝兔分为正常对照组、EAU模型组、ART缓释制剂低浓度组、ART缓释制剂中浓度组、ART缓释制剂高浓度组、曲安奈德混悬液(Triamcinolone acetonide,TA)组、DAPT阻断组,于造模完成后第1、4、7、12、21天行裂隙灯显微镜、眼前节照相、眼前节OCT、眼底照相、眼B超检查,对眼部炎症进行临床评分。2.于造模完成后第12天、第21天制作青紫蓝兔眼组织病理学标本并进行视网膜HE染色,观察不同组别视网膜病理组织变化并进行组织学评分。3.于造模完成后第12天、第21天进行视网膜电图(electroretinogram,ERG)检测,评估各组青紫蓝兔的视觉功能。4.于造模完成后第12天、第21天获取视网膜组织样本,利用蛋白质印迹法(Western-blot,WB)检测不同组别 Notch1、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-17、IL-13、IL-4 蛋白水平。结果1.眼部炎症临床评分:造模完成后第1、4、7、12、21天根据临床表现记录进行炎症评分,EAU模型组青紫蓝兔眼部炎症临床评分显著高于正常对照组(P<0.05),TA组青紫蓝兔在造模完成后第4、7、12、21天眼部炎症临床评分显著低于EAU模型组(P<0.05);ART缓释制剂高浓度组青紫蓝兔在造模完成后第4、7、12天眼部炎症临床评分显著低于EAU模型组(P<0.05);DAPT阻断组青紫蓝兔在造模完成后第12天眼部炎症临床评分显著低于EAU模型组(P<0.05);余各组与EAU模型组比较,差异均无统计学意义(P≥0.05)。2.视网膜组织学评分:EAU模型组青紫蓝兔在造模完成后第12、21天视网膜组织学评分显著高于正常对照组(P<0.05),TA组青紫蓝兔在造模完成后第12、21天视网膜组织学评分显著低于EAU模型组(P<0.05),ART高浓度组在造模完成后第12天视网膜组织学评分显著低于EAU模型组(P<0.05);余各组与EAU模型组比较,差异均无统计学意义(P≥0.05)。3.ERG检测:造模完成后第12天ERG检测结果显示:EAU模型组、ART缓释制剂低浓度组、ART缓释制剂中浓度组及DAPT阻断组每组随机选取的3只青紫蓝兔右眼ERG均为熄灭型,ART缓释制剂高浓度组及TA组ERG均为降低型且峰时延长。与正常对照组比较,ART缓释制剂高浓度组及TA组暗适应0.01ERG b波、暗适应3.0ERG a波、暗适应3.0ERG b波、暗适应3.0震荡电位P2波、明适应3.0ERG a波、明适应3.0闪烁光反应P1波振幅差异具有统计学意义(P<0.05)。ART缓释制剂高浓度组及TA组暗适应0.01ERG b波、暗适应3.0ERG a波、明适应3.0ERG a波、明适应3.0ERG b波峰时延长,与正常对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。造模完成后第21天ERG检测结果显示:除正常对照组及TA组外,其余各组随机选取的3只青紫蓝兔右眼ERG均为熄灭型,TA组ERG为降低型,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),且峰时延长,部分结果具有显著差异(P<0.05)。4.Western-blot检测:与正常对照组相比,造模完成后第12d EAU模型组TNF-α蛋白水平显著升高(P<0.05);ART缓释制剂中、高浓度组浓度依赖性降低蛋白表达,均显著低于EAU模型组(P<0.05);阳性药TA组和DAPT阻断组均显著低于EAU模型组(P<0.05);造模完成后第21d EAU模型组与各组蛋白水平比较均无统计学差异。造模完成后第12d EAU模型组IL-17蛋白水平显著高于正常对照组(P<0.05);ART缓释制剂高浓度组和TA组均显著低于EAU模型组(P<0.05);余组间比较未见统计学差异;造模完成后第21d EAU模型组显著高于正常对照组(P<0.05);TA组显著低于EAU模型组(P<0.05);余组间比较未见统计学差异。造模完成后第12d EAU模型组IL-13蛋白水平显著高于正常对照组(P<0.05);ART缓释制剂高浓度组和TA组均显著低于EAU模型组(P<0.05);余组间比较未见统计学差异。造模完成后第21d EAU模型组显著低于正常对照组(P<0.05);TA组显著高于EAU模型组(P<0.05);余组间比较未见统计学差异。造模完成后第12d EAU模型组IL-4蛋白水平显著高于正常对照组(P<0.05);ART缓释制剂高浓度组和TA组均显著低于EAU模型组(P<0.05);余组间比较未见统计学差异。造模完成后第21d EAU模型组显著低于正常对照组(P<0.05);ART缓释制剂中浓度组和TA组显著高于EAU模型组(P<0.05);余组间比较未见统计学差异。造模完成后第12d和21d EAU模型组Notch1蛋白水平均显著高于正常对照组(P<0.05);ART缓释制剂高浓度组、TA组和DAPT阻断组均显著低于EAU模型组(P<0.05);余组间比较未见统计学差异。结论1.结核分枝杆菌H37Ra诱导的青紫蓝兔EAU模型具有操作简便、特异性高、稳定性好和可重复性强等优点。2.低、中浓度的ART缓释制剂对EAU青紫蓝兔的炎症抑制作用不明显,而高浓度的ART缓释制剂可以显著抑制EAU青紫蓝兔的炎症反应并对视功能有保护作用,且未出现明显副作用。3.DAPT通过阻断Notch信号通路而显著抑制葡萄膜炎的炎症反应,证明Notch信号通路活化在葡萄膜炎的发生发展过程中发挥重要作用。4.ART能够显著降低Notch1、TNF-α、IL-17、IL-13和IL-4蛋白表达水平,促进M1/M2巨噬细胞极化平衡,其抗炎作用机制可能与抑制Notch信号通路和巨噬细胞活化有关。第四部分青蒿琥酯新型眼内缓释制剂兔血浆和眼组织分布以及代谢研究目的考察玻璃体腔注射ART眼内缓释制剂后,ART在眼组织的药代动力学特征,为药效实验提供基础数据支持。方法1.将青紫蓝兔随机分为15组,相应组别分别右眼玻璃体腔注射低、中、高三种浓度的ART眼内缓释制剂10μL,于注药后3h、5h、17h、1d、3d取血后空气栓塞处死,采集兔血浆和右眼虹膜-睫状体、房水、玻璃体、视网膜/脉络膜。2.将生物样品进行处理,采用经过验证的超高效液相色谱-串联质谱法(ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定兔血浆及眼组织中青蒿琥酯和双氢青蒿素(dihydroartemisimin,DHA)的浓度。结果1.建立测定兔血浆和眼组织中ART和DHA浓度的UPLC-MS/MS法,定量范围分别为 20.0～4000ng/g 或 2.00～400ng/mL、40.0～8000ng/g 或 4.00～800 ng/mL。并对方法的系统适用性、专属性、干扰系数、残留、线性范围、稳定性、精密度、准确度、灵敏度、基质效应和回收率进行验证,均符合化学药物临床前药代动力学研究的参数。2.低、中、高浓度的ART眼内缓释制剂玻璃体腔注射后ART在眼组织中分布情况为:玻璃体>房水>视网膜/脉络膜>虹膜-睫状体,在血浆中未见其分布。ART的活性代谢产物DHA在眼组织中分布情况为:虹膜-睫状体>视网膜/脉络膜>玻璃体>房水,在血浆中未见其分布。3.ART和DHA在玻璃体、房水、视网膜/脉络膜、虹膜-睫状体中曲线下面积(areaunder curves,AUC)0-3d分布均呈剂量相关性增加。二者在眼组织中的达峰时间基本一致,DHA在虹膜-睫状体和房水中的消除时间晚于ART。结论1.玻璃体腔注射ART缓释制剂后,ART在玻璃体腔中被逐渐吸收,达峰迅速,消除缓慢;部分可代谢成其活性产物DHA,逐渐消除;ART和DHA约3天可完全消除。2.ART和DHA在玻璃体、房水、虹膜-睫状体、视网膜/脉络膜中AUC0-medicines reconciliation3d分布均呈剂量相关性增加,几乎不入体循环。3.DHA在虹膜-睫状体和房水中的消除时间晚于ART。
番茄红素通过上调Nrf2-Ho-1/Nqo1蛋白表达治疗幽门螺杆菌相关慢性萎缩性胃炎
目的 探讨番茄红素（LYC）对慢性萎缩性胃炎（CAG）的治疗作用及其潜在作用机制。方法 通过网络数据库筛选出CAG致病靶点与LYC作用靶点并取交集，通过String数据库构建蛋白互作网络，并使用Cytoscape进行可视化分析。最后通过对LYC治疗CAG可能核心靶点基因进行GO功能和KEGG通路富集分析筛选关键通路进行实验验证。构建CAG实验小鼠模型，在LYC干预后通过H&E染色、ELISA、免疫组织化学染色、RT-qPCR检测及Western Blot等实验方法评估LYC对CAG的治疗作用及其可能作用机制。结果 LYC与CAG共同靶点77个，通过GO功能和KEGG通路富集分析发现主要涉及的通路有氧化应激反应、对活性氧的反应等。使用KEGG Pathview绘制Chemianimal pathologycal carcinogenesis-reactive oxygen species通路途径，发现ROS-Nrf2-Ho-1/Nqo1通路作用较为显著。H&E染色和血清胃泌素结果提示CAG小鼠模型构建成功；与模型组S63845体外相比，LYC干预后小鼠血清胃泌素水平较模型组显著下降，胃黏膜萎缩程度显著减轻，小鼠胃组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶抗氧化蛋白水平显著上调，丙二醛水平显著下降；免疫组化、RT-qPCR检测及Western Blot结果共同提示与模型组相比，LYC干预后小鼠胃组织中Nrf2、Ho-1、Nqo1 m获悉更多RNA和蛋白水平显著上调。结论 LYC可通过提高小鼠胃黏膜抗氧化应激能力以及上调ROS-Nrf2-Ho-1/Nqo1通路蛋白表达从而发挥治疗CAG的目的。
培土清心颗粒治疗特应性皮炎的蛋白质组学研究
目的 采用血清蛋白质组学方法探讨培土清心颗粒（白术、连翘、白茅根、太子参等）治疗特应性皮炎的作用靶点。方法 选择特应性皮炎患者5GSK J4例，以培土清心颗粒治疗12周，并以健康志愿者5例作为对照。对特应性皮炎患者治疗后的临床核心评价指标包括病情严重程度评分（EASI、SCORAD）、瘙痒程度评分、患者自评（POEM）、生活质量指数等进行评估。采用数据非依赖采集质谱（DIA-MS）技术检测血清样本，并根据P<0.05、变化倍数（Fold Change）>1.2筛选出特应性皮炎患者与健康人群的血清差异蛋白，以及培土清心颗粒治疗前后特应性皮炎患者的血清差异蛋白。对差异蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果（1）与治疗前比较，特应性皮炎患者治疗后的临床核心评价指标包括病情严重程度评分（EASI、SCORAD）、瘙痒程度评分、患者自评（POEM）、生活质量指数等均得到明显改善，差异均有统计学意义（P<asymbiotic seed germination0.05,P<0.01）。（2）健康对照组selleck激酶抑制剂及特应性皮炎组共分析出28个差异性蛋白，其中12个蛋白表达水平上升，16个蛋白表达水平下降，包括ALAD(δ-氨基乙酰丙酸脱水酶)、LTA4H（白三烯A-4水解酶）、CA1（碳酸酐酶1）、F11（凝血因子XI）、LCP1（淋巴细胞胞浆蛋白1）等。主要涉及PI3K-AKT信号通路、脂质与动脉粥样硬化、ECM-受体相互作用、血小板活化、NF-κB信号通路、中性粒细胞外陷阱形成等信号通路。（3）特应性皮炎患者经培土清心颗粒治疗前后共分析出12个差异蛋白，其中8个蛋白表达水平上升，4个蛋白表达水平下降，包括ALAD、FGA（纤维蛋白原α链）、IGHV3-64D及IGHV3-38等。主要涉及脂质与动脉粥样硬化、补体途径、金黄色葡萄球菌感染、NF-κB信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化等信号通路。（4）ALAD、FGA、IGHV3-64D等3个蛋白靶点在特应性皮炎患者中的表达显著下调，而在培土清心颗粒治疗后显著上调。结论 差异表达蛋白ALAD、FGA、IGHV3-64D可能是培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用靶点，为进一步实验验证奠定了基础。
川芎多糖对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响
目的:研究川芎多糖对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)Crizotinib体内实验剂量的影响及机制。方法:将144只大鼠随机分为假手术组、模型组、维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组，造模前14 d开始1次/d灌胃给药。通过夹闭冠状动脉左前降支构建MIRI大鼠模型，再灌注2 Erastinh后，通过超声心动图检测大鼠心功能，计算心肌梗死面积，HE、TUNEL染色观察心肌组织病变和细胞凋亡，ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)含量，分光光度法检测丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性，Western blot法检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达。结果:与模型组比较，维拉帕米组和川芎多糖低、中、高剂量组心功能指标明显改善(均P<0.05);心肌组织病变和细胞凋亡明显改善，病理评分和凋亡指数降低(均P<0.05);心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量降Anti-cancer medicines低，SOD、CAT活性升高，HMGB1表达量降低(均P<0.05)。川芎多糖上述效应呈现剂量依赖性。结论:川芎多糖具有改善MIRI大鼠心功能、减轻心肌组织病变和细胞凋亡的作用，其机制可能与抑制氧化应激、炎症反应以及抑制HMGB1表达有关。
外泌体介导抗氧化酶递送治疗神经退行性疾病的研究
随着人口老龄化比例的增长,神经退行性疾病已成为社会主要健康问题之一。神经退行性疾病主要包括阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化症等。这些疾病伴随衰老而产生渐进性的神经细胞死亡,导致患者的认知、情绪和运动功能逐渐退化。氧化应激在神经退行性疾病的发展中起着至关重要的作用,当患者处于氧化应激状态时,体内氧化与抗氧化作用失衡,中性粒细胞炎性浸润,蛋白酶分泌增加,产生大量氧化中间产物。为了对抗氧化性细胞损伤,通过清除活性氧恢复氧化还原平衡的抗氧化治疗被认为是一点击此处种极具前景的方法。内源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶能够有效清除活性氧,其中超氧化物歧化酶(SOD)是金属酶,广泛存在于生物体内,能够特异性地将超氧阴离子转化为O_2和H_2O_2,保护机体免受氧化损伤。然而,超氧化物歧化酶的高免疫原性、不稳定性和低半衰期限制了其在生物医学应用范围。为了解决这些问题,研究人员开发了一系列的化学修饰方法和递送系统。化学修饰能够提高酶的稳定性,但化学修饰可能会改变酶的结构,造成酶活性的丧失。一系列的合成载体如脂质、聚合物和无机纳米颗粒成功开发并用于超氧化物歧化酶的递送,然而合成载体体内应用需要克服诸多障碍,包括循环系统及肝肾中吞噬细胞系统的捕获及快速清除作用等。因此,开发超氧化物歧化酶递送体系,以延长体内循环时间、降低免疫原性和提高疗效,是一项极具挑战性的研究课题。外泌体是CX-5461生产商粒径为30-150 nm的内源性囊泡,通过大多数哺乳动物细胞的细胞膜融合释放,其具有良好的生物相容性、低免疫原性和生理条件下的高稳定性,已经作为药物递送系统备受关注。此外,外泌体具有透过血脑屏障的能力,因此,以外泌体为载体,担载超氧化物歧化酶递送,有望在神经退行性疾病的抗氧化治疗中发挥积极的作用。本论文的主要研究内容及结果如下Immune activation:1.SOD@EXO的构建及抗氧化活性评价活性氧(ROS)是具有未配对电子的原子团,通常参与氧化还原反应,并表现出强烈的氧化特性。适度的活性氧促进细胞增殖,刺激吞噬细胞杀死细菌,而过量的活性氧能够诱发脂质过氧化和DNA变性。本研究中,我们以HEK293细胞作为外泌体供体细胞,通过超速离心法分离外泌体;通过机械挤出结合皂素渗透的方式将超氧化物歧化酶担载进外泌体,制备纳米递送体系SOD@EXO。透射电镜结果表明,SOD@EXO纳米复合物呈现均一规则的球形结构,粒径均一。在1-甲基-4-苯基吡啶(MPP~+)诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型中,MTT实验和Live/dead细胞染色实验表明SOD@EXO能够有效提升细胞存活率;DCFH-DA探针检测胞内ROS实验表明SOD@EXO具有胞内抗氧化作用效果,清除胞内过量ROS;Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡实验表明SOD@EXO能够抑制细胞凋亡,保护SH-SY5Y细胞免受损伤。同时,以N2野生型秀丽隐杆线虫为模型,SOD@EXO在线虫体内半衰期更长,显著延长线虫的寿命;线虫体内SOD活性和ROS含量检测验证了SOD@EXO的处理提升线虫体内SOD酶活性,清除过量ROS;线虫对热应激和氧化应激的抗性实验证明了SOD@EXO的处理提升线虫在恶劣环境下的生存率;油红O染色实验表明SOD@EXO的处理能够有效地减少线虫中的脂肪累积,改善线虫的健康状况。最后,q PCR实验验证了SOD@EXO对生长激素/胰岛素样生长因子-1信号通路介导的基因表达表现出更有效的调节作用,进而促进了线虫寿命的延长。总之,外泌体介导超氧化物歧化酶递送能够清除活性氧并延缓线虫的衰老,为治疗ROS相关疾病提供了理论依据。2.外泌体介导SOD和纳米酶鼻内递送治疗帕金森病的研究帕金森病是最常见的中枢神经系统运动障碍疾病,它的发生和发展与活性氧的过量产生高度相关。因此,利用抗氧化酶降低细胞内的活性氧水平缓解神经元的退化和损伤,有望成为治疗帕金森病的有力工具。除天然酶SOD外,许多纳米酶具有良好的抗氧化活性、高稳定性和低成本的特点,其中Ce O_2纳米酶具有良好的过氧化氢酶活性备受学者的广泛关注。因此,SOD和Ce O_2纳米酶能够以级联方式清除活性氧,有望产生更为显著的抗氧化活性及疾病治疗效果。本研究中,我们通过水热法制备了Ce O_2纳米酶。高分辨率透射电镜图片显示,合成的Ce O_2纳米酶呈现均一的球形结构。我们将Ce O_2纳米酶与上一章制备的SOD@EXO混合,构建SOD@EXO+Ce O_2给药系统。结果显示,透射电镜下SOD@EXO+Ce O_2的Ce O_2纳米酶附着在SOD@EXO周围,也同时游离在SOD@EXO外。SOD@EXO+Ce O_2在体外具有良好的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,蛋白免疫印迹实验表明SOD载药量为12.18%;体外血脑屏障模拟实验证明FITC-SOD@EXO能够穿过内皮细胞单层,说明其具备穿过血脑屏障的能力;激光共聚焦显微镜分析表明,外泌体能够有效介导SOD被神经细胞充分摄取。以MPP~+诱导SH-SY5Y细胞构建PD模型,MTT实验和Live/dead细胞染色实验表明SOD@EXO+Ce O_2的抗氧化作用显著提升细胞存活率;DCFH-DA探针检测胞内ROS实验表明外泌体介导SOD与CAT的级联催化能够有效清除活性氧;线粒体膜电位检测实验表明表明SOD@EXO+Ce O_2的递送能够有效缓解由MPP~+所诱导的线粒体膜电位下降现象,保护线粒体功能;细胞蛋白免疫印迹实验表明SOD@EXO+Ce O_2处理后上调线粒体凋亡途径相关蛋白和酪氨酸羟化酶表达水平,降低了α-突触核蛋白表达水平。同时,与静脉注射相比,该体系经鼻内给药后能够更好地绕过血脑屏障,实现酶分子在脑部的分布。在MPTP诱导的PD小鼠模型中,该体系能够改善小鼠运动障碍。在小鼠组织层面上,该体系缓解神经炎症,抑制相关氧化应激指标,有效恢复了PD相关酪氨酸羟化酶的表达水平,继而提高纹状体内多巴胺的含量,最终对帕金森病产生良好的治疗效果。3.外泌体介导SOD和硫酸软骨素酶ABC鼻内递送治疗多发性硬化症的研究多发性硬化症是最常见的中枢神经系统自身免疫性疾病,以不可逆的神经轴突损伤为特征,其病理特征包括神经炎症、脱髓鞘、胶质细胞增生和免疫系统失调。为了研究多发性硬化症的发病机制和治疗方法,研究人员构建了病理特征相似的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE模型)。在实验性自身免疫性脑脊髓炎的进展中,脑部被激活的小胶质细胞产生过量的ROS、促炎症细胞因子和趋化因子。此外,被激活的星形胶质细胞和少突胶质细胞分泌硫酸软骨素蛋白多糖,形成胶质瘢痕,进而导致轴索神经病变和脱髓鞘。因此,抑制神经炎症和促进髓鞘再生是治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的有效策略。本研究中,我们将SOD和硫酸软骨素酶ABC(Ch ABC)担载进外泌体,制备纳米递送体系SOD/Ch ABC@EXO。结果表明,纳米粒径电位仪检测SOD/Ch ABC@EXO纳米复合物的水合动力学直径为101.2±0.6 nm;SOD担载量及包封率检测证明外泌体成功实现了两种酶分子的共担载,SOD/Ch ABC@EXO具有良好的超氧化物歧化酶和硫酸软骨素酶活性。激光共聚焦显微镜表明BV2细胞在6 h时能够有效摄取SOD/Ch ABC@EXO;在脂多糖刺激BV2细胞构建的炎症细胞模型中,SOD/Ch ABC@EXO能够高效清除ROS并抑制细胞凋亡。鼻内给药后,SOD/Ch ABC@EXO能够在脊髓和大脑中大量分布。在EAE小鼠模型中,SOD/Ch ABC@EXO显著下调了EAE小鼠的神经功能评分,改善小鼠的神经功能。脊髓组织层面上,SOD/Ch ABC@EXO通过上调抗氧化酶SOD活性和抑制脂质过氧化,有效降低了EAE小鼠的氧化应激损伤;病理切片水平上SOD/Ch ABC@EXO表现出良好的神经炎症调节活性及再髓鞘化,减轻了脊髓炎性细胞浸润现象。最后,q PCR实验验证SOD和Ch ABC的联合递送降低了脊髓组织炎症细胞因子表达,升高了抗炎细胞因子表达。总之,SOD/Ch ABC@EXO纳米复合物在实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗中具有广阔的前景。综上,本研究以天然来源的外泌体为载体,构建了一类高效、安全的抗氧化酶递送体系,同时鼻内给药的方式使该体系能够有效绕过血脑屏障实现抗氧化酶在中枢神经系统的分布,在神经退行性疾病的动物模型中获得了良好的治疗效果。以上研究,为抗氧化酶的组装与递送搭建了良好的平台,进而为基于酶分子构建重大疾病纳米递送体系提供了新的设计思路。
外泌体介导抗氧化酶递送治疗神经退行性疾病的研究
随着人口老龄化比例的增长,神经退行性疾病已成为社会主要健康问题之一。神经退行性疾病主要包括阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化症等。这些疾病伴随衰老而产生渐进性的神经细胞死亡,导致患者的认知、情绪和运动功能逐渐退化。氧化应激在神经退行性疾病的发展中起着至关重要的作用,当患者处于氧化应激状态时,体内氧化与抗氧化作用失衡,中性粒细胞炎性浸润,蛋白酶分泌增加,产生大量氧化中间产物。为了对抗氧化性细胞损伤,通过清除活性氧恢复氧化还原平衡的抗氧化治疗被认为是一点击此处种极具前景的方法。内源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶能够有效清除活性氧,其中超氧化物歧化酶(SOD)是金属酶,广泛存在于生物体内,能够特异性地将超氧阴离子转化为O_2和H_2O_2,保护机体免受氧化损伤。然而,超氧化物歧化酶的高免疫原性、不稳定性和低半衰期限制了其在生物医学应用范围。为了解决这些问题,研究人员开发了一系列的化学修饰方法和递送系统。化学修饰能够提高酶的稳定性,但化学修饰可能会改变酶的结构,造成酶活性的丧失。一系列的合成载体如脂质、聚合物和无机纳米颗粒成功开发并用于超氧化物歧化酶的递送,然而合成载体体内应用需要克服诸多障碍,包括循环系统及肝肾中吞噬细胞系统的捕获及快速清除作用等。因此,开发超氧化物歧化酶递送体系,以延长体内循环时间、降低免疫原性和提高疗效,是一项极具挑战性的研究课题。外泌体是CX-5461生产商粒径为30-150 nm的内源性囊泡,通过大多数哺乳动物细胞的细胞膜融合释放,其具有良好的生物相容性、低免疫原性和生理条件下的高稳定性,已经作为药物递送系统备受关注。此外,外泌体具有透过血脑屏障的能力,因此,以外泌体为载体,担载超氧化物歧化酶递送,有望在神经退行性疾病的抗氧化治疗中发挥积极的作用。本论文的主要研究内容及结果如下Immune activation:1.SOD@EXO的构建及抗氧化活性评价活性氧(ROS)是具有未配对电子的原子团,通常参与氧化还原反应,并表现出强烈的氧化特性。适度的活性氧促进细胞增殖,刺激吞噬细胞杀死细菌,而过量的活性氧能够诱发脂质过氧化和DNA变性。本研究中,我们以HEK293细胞作为外泌体供体细胞,通过超速离心法分离外泌体;通过机械挤出结合皂素渗透的方式将超氧化物歧化酶担载进外泌体,制备纳米递送体系SOD@EXO。透射电镜结果表明,SOD@EXO纳米复合物呈现均一规则的球形结构,粒径均一。在1-甲基-4-苯基吡啶(MPP~+)诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型中,MTT实验和Live/dead细胞染色实验表明SOD@EXO能够有效提升细胞存活率;DCFH-DA探针检测胞内ROS实验表明SOD@EXO具有胞内抗氧化作用效果,清除胞内过量ROS;Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡实验表明SOD@EXO能够抑制细胞凋亡,保护SH-SY5Y细胞免受损伤。同时,以N2野生型秀丽隐杆线虫为模型,SOD@EXO在线虫体内半衰期更长,显著延长线虫的寿命;线虫体内SOD活性和ROS含量检测验证了SOD@EXO的处理提升线虫体内SOD酶活性,清除过量ROS;线虫对热应激和氧化应激的抗性实验证明了SOD@EXO的处理提升线虫在恶劣环境下的生存率;油红O染色实验表明SOD@EXO的处理能够有效地减少线虫中的脂肪累积,改善线虫的健康状况。最后,q PCR实验验证了SOD@EXO对生长激素/胰岛素样生长因子-1信号通路介导的基因表达表现出更有效的调节作用,进而促进了线虫寿命的延长。总之,外泌体介导超氧化物歧化酶递送能够清除活性氧并延缓线虫的衰老,为治疗ROS相关疾病提供了理论依据。2.外泌体介导SOD和纳米酶鼻内递送治疗帕金森病的研究帕金森病是最常见的中枢神经系统运动障碍疾病,它的发生和发展与活性氧的过量产生高度相关。因此,利用抗氧化酶降低细胞内的活性氧水平缓解神经元的退化和损伤,有望成为治疗帕金森病的有力工具。除天然酶SOD外,许多纳米酶具有良好的抗氧化活性、高稳定性和低成本的特点,其中Ce O_2纳米酶具有良好的过氧化氢酶活性备受学者的广泛关注。因此,SOD和Ce O_2纳米酶能够以级联方式清除活性氧,有望产生更为显著的抗氧化活性及疾病治疗效果。本研究中,我们通过水热法制备了Ce O_2纳米酶。高分辨率透射电镜图片显示,合成的Ce O_2纳米酶呈现均一的球形结构。我们将Ce O_2纳米酶与上一章制备的SOD@EXO混合,构建SOD@EXO+Ce O_2给药系统。结果显示,透射电镜下SOD@EXO+Ce O_2的Ce O_2纳米酶附着在SOD@EXO周围,也同时游离在SOD@EXO外。SOD@EXO+Ce O_2在体外具有良好的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,蛋白免疫印迹实验表明SOD载药量为12.18%;体外血脑屏障模拟实验证明FITC-SOD@EXO能够穿过内皮细胞单层,说明其具备穿过血脑屏障的能力;激光共聚焦显微镜分析表明,外泌体能够有效介导SOD被神经细胞充分摄取。以MPP~+诱导SH-SY5Y细胞构建PD模型,MTT实验和Live/dead细胞染色实验表明SOD@EXO+Ce O_2的抗氧化作用显著提升细胞存活率;DCFH-DA探针检测胞内ROS实验表明外泌体介导SOD与CAT的级联催化能够有效清除活性氧;线粒体膜电位检测实验表明表明SOD@EXO+Ce O_2的递送能够有效缓解由MPP~+所诱导的线粒体膜电位下降现象,保护线粒体功能;细胞蛋白免疫印迹实验表明SOD@EXO+Ce O_2处理后上调线粒体凋亡途径相关蛋白和酪氨酸羟化酶表达水平,降低了α-突触核蛋白表达水平。同时,与静脉注射相比,该体系经鼻内给药后能够更好地绕过血脑屏障,实现酶分子在脑部的分布。在MPTP诱导的PD小鼠模型中,该体系能够改善小鼠运动障碍。在小鼠组织层面上,该体系缓解神经炎症,抑制相关氧化应激指标,有效恢复了PD相关酪氨酸羟化酶的表达水平,继而提高纹状体内多巴胺的含量,最终对帕金森病产生良好的治疗效果。3.外泌体介导SOD和硫酸软骨素酶ABC鼻内递送治疗多发性硬化症的研究多发性硬化症是最常见的中枢神经系统自身免疫性疾病,以不可逆的神经轴突损伤为特征,其病理特征包括神经炎症、脱髓鞘、胶质细胞增生和免疫系统失调。为了研究多发性硬化症的发病机制和治疗方法,研究人员构建了病理特征相似的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE模型)。在实验性自身免疫性脑脊髓炎的进展中,脑部被激活的小胶质细胞产生过量的ROS、促炎症细胞因子和趋化因子。此外,被激活的星形胶质细胞和少突胶质细胞分泌硫酸软骨素蛋白多糖,形成胶质瘢痕,进而导致轴索神经病变和脱髓鞘。因此,抑制神经炎症和促进髓鞘再生是治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的有效策略。本研究中,我们将SOD和硫酸软骨素酶ABC(Ch ABC)担载进外泌体,制备纳米递送体系SOD/Ch ABC@EXO。结果表明,纳米粒径电位仪检测SOD/Ch ABC@EXO纳米复合物的水合动力学直径为101.2±0.6 nm;SOD担载量及包封率检测证明外泌体成功实现了两种酶分子的共担载,SOD/Ch ABC@EXO具有良好的超氧化物歧化酶和硫酸软骨素酶活性。激光共聚焦显微镜表明BV2细胞在6 h时能够有效摄取SOD/Ch ABC@EXO;在脂多糖刺激BV2细胞构建的炎症细胞模型中,SOD/Ch ABC@EXO能够高效清除ROS并抑制细胞凋亡。鼻内给药后,SOD/Ch ABC@EXO能够在脊髓和大脑中大量分布。在EAE小鼠模型中,SOD/Ch ABC@EXO显著下调了EAE小鼠的神经功能评分,改善小鼠的神经功能。脊髓组织层面上,SOD/Ch ABC@EXO通过上调抗氧化酶SOD活性和抑制脂质过氧化,有效降低了EAE小鼠的氧化应激损伤;病理切片水平上SOD/Ch ABC@EXO表现出良好的神经炎症调节活性及再髓鞘化,减轻了脊髓炎性细胞浸润现象。最后,q PCR实验验证SOD和Ch ABC的联合递送降低了脊髓组织炎症细胞因子表达,升高了抗炎细胞因子表达。总之,SOD/Ch ABC@EXO纳米复合物在实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗中具有广阔的前景。综上,本研究以天然来源的外泌体为载体,构建了一类高效、安全的抗氧化酶递送体系,同时鼻内给药的方式使该体系能够有效绕过血脑屏障实现抗氧化酶在中枢神经系统的分布,在神经退行性疾病的动物模型中获得了良好的治疗效果。以上研究,为抗氧化酶的组装与递送搭建了良好的平台,进而为基于酶分子构建重大疾病纳米递送体系提供了新的设计思路。
分子改造羰基还原酶CpCR提高其催化合成2-苯乙醇能力
该研究对近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR进行分子改造，以提高其催化合成2-苯乙醇的能力。通过易错PCR构建突变文库，利用2,4-二硝基苯肼高通量筛选阳性突变株，测序确定氨基酸突变位点。再通过蛋白质半理性设计进行虚拟饱和突变，采用定点突变技术进行构建和评价。筛选获得突变体T171F具有更强的催化能力和热稳定性。进一步考察了催化时间、温度、pH值和底物浓度对wtCpCR和T171F催化合成2-苯乙醇的影响。研究表明，酶最适催化合成2-苯乙醇的温度为30℃;T171F最适催化合成2-苯乙醇的pH为6.5;苯乙醛的质量浓度为1 000 mg/L时T171F产率NSC125066半抑制浓度可达91.24%,是wtCanimal models of filovirus infectionpCR的2.8倍。此外，突变体T171F相比wtCpCR催化时间由10 h降低到4 h,催化效率得到很大的提高。该研究为羰基还LXH254采购原酶催化合成2-苯乙醇提供科学基础，同时具有一定的应用价值。
青少年情绪障碍患者与家长亲密关系现状及影响因素分析
目的 探讨青少年情绪障碍患者与家长亲密关系现状及影响因素。方法 选择2019年5月—2020年10月就诊于英德市人民医院的70例青少年情绪障碍患者作为研究对象，收集资料，分析其与家长亲密关系现状及影响因素。结果青少年情绪障碍患者依恋回避评分为（64.12±10.96）分，依恋焦虑评分为（62.31±7.5https://www.selleck.cn/products/Etopophos.html4）分；单因素分析显示：性别、父母陪伴时间与青少年Burn wound infection情绪障碍患者依恋焦虑有关（P<0.05），精神疾病家族史、人际信任、父母陪伴时间与青少年情绪障碍患者依恋回避有关（P<0.05）；年龄、GW4869居住地、学习成绩与青少年情绪障碍患者与家长亲密关系无关，且年龄与依恋回避评分无关，精神疾病家族史、人际信任与依恋焦虑评分无关（P>0.05）。多因素分析显示：性别、父母陪伴时间是影响青少年情绪障碍患者依恋焦虑的高危因素（P<0.05）；精神疾病家族史、人际信任、父母陪伴时间是影响青少年情绪障碍患者依恋回避的高危因素（P<0.05）。结论 青少年情绪障碍患者与家长亲密关系有待提高，其依恋焦虑受性别、父母陪伴时间影响，依恋回避受精神疾病家族史、人际信任、父母陪伴时间影响。
天麻钩藤饮加减联合降压药治疗肝阳上亢型高血压眩晕的效果观察
目的：探讨肝阳上亢型高血压眩晕应用天麻钩藤饮加减联合降压药治疗的效果。方法：收集2021年1月—2022年1月我院及中国人民解放军联勤保障部队天PF-07321332说明书津康复疗养中心86例肝阳上亢型高血压眩晕患者作为研究对象，采用随机数表法分为对照组（43例）与观察组（43例）。对照组采用常规降压药治疗，观察组在此基础上加天麻钩藤饮加减治疗，对两组疗效、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）、血流动力学水平及眩晕症状进行比较。结果：观察组治疗后总有效率health resort medical rehabilitation（95.35%,41/43）高于对照组（81.40%,35/43）(P<0.05)；观察组治疗后中医证候积分较对照组低（P<0.05）；观察组治疗后PRA较对照组高，ALD、AngⅡ指标水平较对照组低（P<0.05）。结论：天麻钩藤饮加减VP-16使用方法联合降压药治疗肝阳上亢型高血压眩晕疗效显著，可有效调节RAAS，并改善临床症状，值得推广。
布拉氏酵母菌散联合胶体果胶铋四联疗法对幽门螺杆菌感染消化性溃疡患者血清炎症因子及胃肠激素的影响
目的 探讨幽门螺杆菌感染消化性溃疡采用布拉氏酵母菌散联合胶体果胶铋四联疗法治疗对炎症因子、胃肠激素的影响。方法 将2022年3月～2023年6月惠安县医院收治的92例符合入组标准的幽门螺杆菌感染消化性溃疡Religious bioethics患者按随机数字表分为对照组(n=46例)和观察组(n=46例),分别采取胶体果胶铋四联疗法、布拉氏酵母菌散联合胶体果胶铋四联疗法治疗,两组均连续治疗8周,治疗前及治疗8周结束时进行电子胃镜检查以评价内镜疗效,采用~(14)C尿素呼气试验对治疗后幽门CL13900螺杆菌根除率R428 MW进行评价,两组患者治疗前后的血清炎症因子(肿瘤坏死因子-α、C反应蛋白)以及胃肠激素(胃泌素、胃动素)水平均采用酶联免疫吸附法测定,记录不良反应发生情况。结果 观察组内镜总有效率和幽门螺杆菌根除率为97.83%(45/46)和91.30%(42/46),明显高于对照组的86.96%(40/46)和76.09%(35/46),χ~2=8.785和3.903,P<0.05。观察组治疗后肿瘤坏死因子-α(44.30±8.46)pg/ml、C反应蛋白(8.05±2.54)mg/L、胃泌素(58.58±6.53)ng/L、胃动素(96.26±10.62)mg/L明显低于治疗前(159.12±15.26)pg/ml、(19.55±5.22)mg/L、(94.26±5.36)ng/L、(182.58±9.08)mg/L及对照组治疗后(75.16±9.35)pg/ml、(12.18±3.38)mg/L、(72.16±6.68)ng/L、(126.48±9.94)mg/L,P<0.05。观察组和对照组不良反应发生率为8.70%(4/46)和10.87%(5/46),P>0.05。结论 幽门螺杆菌感染消化性溃疡采用布拉氏酵母菌散联合胶体果胶铋四联疗法治疗具有确切疗效且安全性良好,能够降低血清炎症因子,加快溃疡愈合,提高幽门螺杆菌根除率,调节胃肠激素水平,提高临床治疗效果。