目的本研究通过对内蒙古自治区脑卒中高危人群进行筛查,了解内蒙古自治区人群脑卒中危险因素水平及高危人群检出特征和变化趋势,对脑卒中风险人群短期干预效果进行评价,为制定和完善脑卒中防治策略奠定基础。方法本研究采用整群方法在自治区6个脑卒中高危人群筛查与干预项目地区以社区为单位抽取筛查点,对筛查点内40岁以上当地常住人口(在当地居住满半年以上者)进行筛查,了解调查人群危险因素暴露情况及人口学分布特征。对初筛脑卒中中危及高危人群进行干预,由项目地区基层医疗单位在满12个月时开展一次随访。采用单因素和多因素Logistic回归分析探讨对生活方式进行干预与风险人群干预后脑卒中风险等级的关联;采用单因素和多因素Cox回归分析人口学特征、生活行为、脑卒中危险因素等与高危人群脑卒中发生的关联。结果(1)高危人群流行病学分布特征:本研究共纳入2017-2020四年度共计51729名研究对象,共筛查出脑卒中高危人群16688名,其中男性多于女性(P<0.05),蒙古族多于汉族(P<0.05),随着年龄增加高危人群比例呈上升趋势(P<0.05)。不同性别之间高血压病、血脂异常、吸烟史、明显超重或肥胖男性检出率均高于女性(P<0.05);高血压病、糖尿病、房颤或瓣膜性心脏病的检出随年龄增长而增长(P<0.05);蒙古族的高血压、吸烟史、明显超重或肥胖、缺乏运动和脑卒中家族史高于汉族(P<0.05)。(2)调查人群脑卒中主要危险因素变化趋势:血脂异常、高血压、糖尿病4年检出率均居于前三位,4年期间高危人群超重或肥胖检出率有所上升,高血压检出率在2020年上升到首位;高危人群血脂异常、高血压、明显超重或肥胖、房颤及瓣膜性心脏病检出率总体呈上升趋势,吸烟史、缺乏运动总体呈下降趋势(P<0.05)。(3)脑卒中中危人群干预后随访结果:随访后共收集到中危人群1809名,干预后有202名中危人群患病风险上升为高危,1313名风险等级仍为中危,294名干预后检出的危险因素数量下降;对比干预前后,经常运动者占比由86.8%提高到93.2%,吸烟者占比由10.8%下降到7.2%,饮食口味偏咸者占比由44.4%下降到12.6%,同时口味适中者由45.6%上升到56.8%,血压控制不良情况由69.9%下降到22.6%,血脂控制不良情况由26.5%下降到18.5%,血糖控制不良情况由36.4%下降到干预后的8.5%;单因素Logistic回归结果显示,多食蔬菜水果及调整饮食口味有助于降低脑卒中风险等级(OR>1,P<0.05)。多因素Logistic回归结果显示,各生活方式改善后均有助于降低脑卒中风险等级。(4)脑卒中高危人群干预后随访结果:随访后共收集到高危人群3263名,其中695人风险等级降低为非高危(中危及低危)人群,1732名风险等级仍为高危,836人随访期间患病;对比干预前后,经常运动者占比由37.6%提高到78.7%,吸烟者占比由35.1%下降到14.9%,饮食口味偏咸者占比由60.9%下降到15.9%,同时口味适中者由20.2%上升到59.3%,高危人群饮食结构也有所改善,筛查对象每周食用水果蔬菜量均有所提升(P<0.05);房颤或瓣膜性心脏病比例从干预前的1.2%下降到干预后的0.3%;血压控制不良情况从干预前的69.9%下降到干预后的22.6%;血脂购买Blebbistatin控制不良情况从干预前的26.5%下降到干预后的18.5%;血糖控制不良情况从干预前的36.4%下降到干预后的8.5%(P<0.05)。单因素Logistic回归结果显示,经干预后改善运动、吸烟、食用蔬菜水果、饮食口味、体重控制情况均有利于降低脑卒中风险评级(OR>1,P<0.05);多因素Logistic回归结果显示,除多食水果外,各生活方式的改善共同作用有利于脑卒中风险等级的降低(OR>1,P<0.05)。(5)脑卒中发病影响因素Cox回归分析:单因素Cox回归分析。结果显示,高龄、口味偏咸及有脑卒中各危险因素检出者脑卒中发病的风险高(HR>1,P<0.05);多因素Cox回归结果显示,女性发病的风险是男性的0.839倍,脑卒中发病风险随年龄升高而上升(HR>1,P<0.05),随食用蔬菜水果量的升高而下降(HR<1,P<0.05),口味偏咸者发病风险高于口味适中者和偏淡者(HR>1,P<0.05),高同型半胱氨酸血症患者脑卒中的发病风险是同型半胱氨酸水平正常者的1.328倍(HR=1.328,P<0.05)。脑卒中各危险因素未控制者发生脑卒中的风险均高于CX-5461控制者(HR>1,P<0.05)。结论根据本研究结果,男性、蒙古族、高龄、低收入及低受教育者是内蒙古地区预防脑卒中发生的重点人群;高危人群血脂异常、高血压、明显超重或肥胖、房颤及瓣膜性心脏病检出率总体呈上升趋势;对风险人群的干预取得了良好的效果,高血压、血脂异常、糖尿病、超重和肥胖等得到了有效控制,吸烟、饮酒medically compromised、参加体育锻炼等生活方式向积极方向转变,膳食结构向有利于降低脑卒中风险的方向改善;高危人群占比有所下降;高危人群中男性、高龄、食用蔬菜水果少、口味偏咸、高同型半胱氨酸血症以及脑卒中各项危险因素未控制者患脑卒中的风险高。
生脉散合桃红四物汤辅助治疗对非霍奇金淋巴瘤患者心肌的保护作用
目的：探讨生脉散合桃红四物汤辅助治疗对非霍奇金淋巴瘤患者心肌的保护作用。方法：选取赣州市肿瘤医院2019年1月—2020年12月收治的60例非霍奇金淋巴瘤患者纳入研究，采用随机数字法将患者分为对照组（30例）与观察组（30例）。对照组给予CHOP方案（含环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松）化疗，观察组在对照组的基础上加用生脉散合Berzosertib供应商桃红四物汤治疗。观察比较两组化疗前和化疗3个疗程后心肌酶指标[天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）]、心电图异常情况、心脏超声参数[左心室射primary human hepatocyte血分数（LVEF）、左心室舒张末期内径（LVEDD）]及心脏标记物[肌钙蛋白I(cTnI)、脑利尿钠肽（BNP）、肌红蛋白（Mb）]。结果：治疗后，两组AST、LDH、CK均较治疗前显著升高，而观察组上述指标均低于对照组（P<0.05）；观察组心电图异常发生率显著低于对照组（P<0.05）；对照组LVEF较治疗前和观察组均显著更低，LVEDD显著更高（P<0.05），而观察组LVEF和LVEDD治疗前后比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；两组cTnI、BNP、Mb均较治疗前升高，而观察组上述指标均显著低于对照组（P<0.05）。结论：生脉散合桃红四物汤具有https://www.selleck.cn/products/XL184.html保护心肌功能的作用，可有效降低蒽环类药物治疗非霍奇金淋巴瘤产生的心脏毒性。
多发性骨髓瘤患者血清sIL-2R表达情况与患者预后的关系
目的 探究多发性骨髓瘤(MM)患者血清sIL-2R表达情况与患者预后的关系。方法 选取开封市人民医院2018年3月～2020年7月收治的72例MM患者作为研究对象，根据预后情况将72例MM患者分为存活组、死亡组，分析MM患者死亡的危险因素，绘制受试者工作特征曲线（ROC）判断发生死亡时血清sIPidnarulex采购L-2R最佳截断值，根据线下面积评估血清sIL-2R表达水平与患者预后的关系。结果 随访3年中，72例MM患者存活45例（62.50%），死亡27例（37.50%）。死亡组MM分期Ⅲ期人数比例高于存活组，β_2-微球蛋白水平（β_2-MG）、血清钙（Ca）水平、sIL-2R水平及轻链比值（K/λ），高于存活组，差异有统计学意义（P<0.05）。Logistitrait-mediated effectsc多因素回归分析结果显示，MM分期、β_2-MG、Ca、sIL-2R水平及K/λ值，均为MM患者死亡的危险因素（P<0.05）。ROC曲线显示，MM患者最佳截断值为328.50，曲线下面积为0.903，灵敏度为86.75%，特异度为88.75%,95%CI(1.27～3.01），提示血清sIL-2R水平可用于预测MM患者的预后情况。结论 sIL-2R水平对MM患者的预Cobimetinib研究购买后有着重要的预测价值，MM分期、β_2-MG、Ca水平及K/λ值，均为MM的危险因素。
微/纳塑料对肠道的毒性效应及机理研究
近年来,微/纳塑料的健康风险越来越受到人们的关注,先前的一些研究发现它们对人体肠道可能有潜在的健康风险。肠道对人体健康发挥着非常重要的保护作用,肠道上皮细胞和肠道上皮表面的包括巨噬细胞在内的多种免疫细胞分别构成了肠道的物理屏障和免疫屏障。微/纳塑料对肠道产生毒性效应的途径及其作用机理对于明确微/纳塑料的肠道健康风险至关重要。目前,大多数的研究集中于采用动物实验考察微/纳塑料对肠道的毒性效应,对于产生毒性效应的途径及其毒理学机制的研究还不够全面和系统。基于此,本研究在微/纳塑料是否通过破坏肠道物理屏障和/或免疫屏障从而对肠道健康构成威胁两方面开展了研究。本研究采用体内动物模型和体外细胞模型相结合的方法,系统研究了微/纳塑料对肠道的毒性效应及机理。主要包括以下四个方面:(1)明确了微/纳塑料对小鼠各个器官组织的损伤情况。采用粒径为3μm和80nm的聚苯乙烯(PS)微球分别作为微塑料和纳塑料的模型。结果表明摄入微塑料和纳塑料对小鼠结肠组织的损伤非常明显,且与微塑料相比,纳塑料对小鼠肠道组织的损伤作用更明显tubular damage biomarkers。微塑料和纳塑料对小鼠的肾脏、肝脏、脾脏、肺部以及心脏等器官均没有观察到明显的组织学损伤。(2)揭示了微/纳塑料对小鼠肠道物理屏障的毒性效应及可能的毒理学Empagliflozin研究购买机制。采用小鼠结肠癌细胞CT26.WT作为肠上皮细胞的模型,粒径为3μm和0.3μm的PS微球作为微塑料的模型,粒径为80 nm和20 nm的PS微球作为纳塑料的模型。研究结果发现,微塑料和纳塑料对CT26.WT细胞的毒性效应具有尺寸依赖性(3μm<0.3μm<80 nm<20 nm)。凋亡是微塑料和纳塑料诱导CT26.WT细胞死亡的主要方式。本研究采用抗氧化N-乙酰-l-半胱氨酸证明了氧化应激是微/纳塑料诱导肠道上皮细胞毒性效应的可能机理。基于已报道的人体通过塑料茶包冲泡的茶水中包含的微/纳塑料的水平计算了风险指数(HQ)的值,结果表明该水平的微/纳塑料对肠道物理屏障存在一定的健康风险。(3)探明了微/纳塑料对人体肠道物理屏障的毒性效应及可能的毒理学机制,并探寻了一种可以减轻微/纳塑料对人类肠道毒性的措施。研究结果表明四种不同粒径(3μm、0.3μm、80 nm和20 nm)的PS微球对体外人类肠道模型Caco-2细胞的毒性效应具有尺寸依赖性(3μm<0.3μm<80 nm<20 nm),氧化应激是微/纳塑料破坏人类肠道物理屏障的机制之一。此外,本研究发现绿茶中的儿茶素可以显著减弱微/纳塑料对人类肠道细胞的不良影响。基于已报道的塑料茶包制作的茶水和人类全血中微塑料的水平计算了HQ值,结果表明人类当下微塑料的暴露水平对人类肠道物理屏障的危害远远超过了安全边际,强调了日常摄入以及人体当下暴露的微/纳塑料水平对肠道健康具有潜在的健康风险。(4)研究了微/纳塑料对机体肠道免疫屏障功能的影响以及可能的毒理学机制。采用小鼠腹腔巨噬细胞更多RAW264.7作为体外免疫细胞模型,3μm和80 nm的PS微球分别作为微塑料和纳塑料的模型。蛋白质组学分析的结果发现微塑料和纳塑料对巨噬细胞的生物学过程、细胞组分和分子功能这三大生物学功能都有不良影响,对巨噬细胞炎症反应及调节炎症反应相关的信号通路的影响非常显著。微/纳塑料通过诱导细胞凋亡对巨噬细胞产生毒性效应,通过把巨噬细胞极化成M1型的巨噬细胞诱导炎症反应。微/纳塑料对巨噬细胞毒性和促炎作用的机理是诱导细胞发生氧化应激。本研究还发现纳塑料对巨噬细胞的不良影响比微塑料大。本论文明确了微/纳塑料对肠道健康产生危害的途径是通过破坏肠道的物理和免疫屏障,探究了微/纳塑料对肠道产生毒性效应的毒理学机理,并为减轻微/纳塑料的肠道毒性提供了一种切实可行的保护措施。本研究为微/纳塑料对人体肠道健康的潜在危害提供了科学依据和理论基础。
黄连大黄药对调控ROS/NF-κB/GSDMD信号通路对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞焦亡的影响
目的 基于活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)/核转录因https://www.selleck.cn/products/INCB18424.html子κB(nucleartranscriptionfactor-κB，NF-κB)/消皮素AG-221生产商D(gasderminD，GSDMD)焦亡信号通路探讨黄连大黄药对发挥2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)胰岛β细胞保护作用的分子机制。方法 选取自发性T2DM大鼠—Goto-Kakizaki(GK)大鼠构建动物模型，24只符合成模标准的GK大鼠随机分为模型组、二甲双胍组(0.1g·kg~(-1)·d~(-1))、黄连大黄高剂量组(4.72g·kg~(-1)·d~(-1))及低剂量组(2.36g·kg~(-1)·d~(-1))，并随机选取6只正常Wistar大鼠设为正常组，连续灌胃干预8周后采用免疫荧光法检测大鼠胰腺组织胰岛素(insulin，INS)阳性表达，RT-PCR法检测细胞增殖相关细胞周期蛋白D1(cyclinD1，CCND1)、髓细胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosisvH pylori infectioniraloncogene，c-Myc)mRNA表达，TUNEL染色检测胰岛细胞焦亡，流式细胞术检测ROS水平，Westernblot法检测NF-κBp65、GSDMD及消皮素DN端片段(gasderminD-N，GSDMD-N)蛋白的表达，ELISA法检测白介素1β(interleukin1β，IL-1β)水平。结果 与正常组比较，模型组大鼠胰腺组织INS平均光密度值显著降低，CCND1、c-MycmRNA表达显著下调，TUNEL阳性率、ROS水平和NF-κB p65、GSDMD-N蛋白表达以及IL-1β水平均显著升高(P均<0.01)；与模型组比较，黄连大黄低剂量组INS平均光密度值有效升高，CCND1、c-MycmRNA表达有效上调，TUNEL阳性率、ROS水平以及NF-κB p65、GSDMD-N蛋白表达、IL-1β水平均明显降低(P<0.01，P<0.05)，黄连大黄高剂量组仅c-MycmRNA表达有效上调，NF-κB p65蛋白表达明显降低(P均<0.05)。结论 黄连大黄药对可能通过ROS/NF-κB/GSDMD信号通路抑制细胞焦亡，促进增殖进而起到保护T2DM大鼠胰岛β细胞的作用。
液质联用法同时测定保健食品中维生素B_1、维生素B_6、烟酸、烟酰胺和咖啡因的含量
建立一种能够同时测定保健食品中维生素B_1、维生素B_6、烟酸、烟酰胺和咖啡因含量的高效液相色谱-寻找更多串联质谱法。以山楂酵母片、B族维生素片、多种B族维生素片、综合营养片（孕妇专用）、褪黑素片、多种维生素矿物质咀嚼片（儿童型）、黄山灵芝孢子粉、蜂胶软胶囊、保健口服液为试验材料，9种保健precise medicine食品用去离子水溶解，滤液经色谱柱CAPCELL PAK C18(150 mm×2.1 mm,5μm)分离，流动相为0.1%甲酸溶液-0NVP-TNKS656.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱，采用电喷雾离子源正离子模式，检测方式为多重反应监测（MRM），喷雾电压为5 000 V，离子源温度为500℃，对9种保健食品中的目标化合物进行分离测定。结果表明，维生素B_1、维生素B_6、烟酸、烟酰胺、咖啡因5种目标化合物在5～500μg/L的浓度范围内线性关系良好，R~2均大于0.990 0，回收率在75.4%～94.5%，相对标准偏差（RSD）为1.1%～15.6%，维生素B_1、维生素B_6、烟酸、烟酰胺、咖啡因5种目标化合物的定量限分别为2.10、4.47、3.93、5.46、1.53μg/kg。该方法与现行国家标准相比，具有灵敏度高、前处理操作简单快速、抗干扰能力强，能同时测定不同剂型保健食品中5种目标化合物的含量。
经典名方四逆汤“药物-机体-效应”联动环节的方剂配伍关系研究
辨证论治是中医药临床工作的核心要求,是理-法-方-证-药的系统整合。方剂作为理-法-方-证-药中的重要一环,既是“辨证”环节抽象思维的具体表达,也是“论治”环节固本疗疾的执行者,而配伍正是方剂实现上述功能的根本途径。因此,阐明方剂的配伍关系与配伍机制对于揭示方剂的科学本质具有重要意义。四逆汤是仲景名方,也是中药方剂配伍应用代表方。四逆汤组方精妙,法度严谨,药虽三味,但方中附子甘草配伍与附子干姜配伍均为中药七情配伍的经典代表,三者互助互制,共奏回阳之功,是中医药现代化研究中的关注热点,本论文也在前期做了大量探索工作。目前相关研究已从附子甘草“相畏/相杀”、附子干姜“相须/相使”的角度对四逆汤的配伍内涵进行了大量阐述,从一定程度揭示了四逆汤的组方原理。但分析发现,现有四逆汤配伍内涵研究多侧重于对正常生理条件下的甘草减附子之毒,以及病理条件下的干姜增附子之效的探讨,忽略了药物-机体-疗效/安全性的高度统一,以及生理因素对方剂配伍关系的影响,不利于对四逆汤配伍内涵的客观阐释。因此,本研究基于生物药剂学“药物-机体-效应”的相互影响环节,采用整体药效学、代谢组学、网络药理学、组学-生物信息学关联分析的整合研究方法,利用正常动物与模型动物对四逆汤方剂配伍关系及其配伍机制进行综合探讨,以期更加全面客观诠释四逆汤方剂配伍关系的科学本质,为其安全、有效的临床用药提供参考。主要研究内容如下:(1)四逆汤处方制法的古今差异分析:通过梳理古代医籍与现行版《中国药典》中四逆汤的收载情况,发现四逆汤在处方组成、药物比例结构方面保持了良好的延续性;在入药品种与制法方面,古代医籍记载与《中国药典》标准存有一定差异,即古代医籍均以生附子与炙甘草(实为炒甘草)入药,采用复方合煎方式制备,《中国药典》中以淡附片与蜜炙甘草入药,采用分煎制备工艺,但根据本论文的前期工作,《中国药典》收载四逆汤(简称药典法四逆汤)在药效与安全性方面更具优势,更能满足现代人们生活习惯和生活节奏,更适宜于现代社会的用药要求;通过对现有四逆汤工艺优化研究的分析,发现相关研究因处方组成、评价指标、比对基准等问题,难以证明其优化结果相较于《中国药典》制法工艺的优越性。因此,仍以药典法四逆汤开展相关研究为宜。(2)四逆汤方剂配伍关键环节的药效学研究:通过建立慢性心力衰竭大鼠模型,以模型大鼠与正常大鼠模拟机体不同生理条件,以相同指标评价四逆汤方剂配伍在不同生理条件下的药物效应差异。研究结果发现,附子单煎液、附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤均可有效改善模型大鼠BNP、CK、LDH、c Tn T、CRP、TNF-α等指标的异常水平,改善模型大鼠心肌组织病理形态学特征,表现为药物治疗效应,且附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤的药效作用优于附子单煎液。同时,研究结果表明,附子单煎液、附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤均可导致正常大鼠CK、LDH、c Tn T水平的异常升高,诱发正常大鼠心肌组织病理损伤,表现出不同程度的损伤作用,但附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤的毒性均低于附子单煎液。由此,基本明确了配伍增效是附子甘草配伍与附子干姜配伍在病理条件下的核心配伍关系,配伍减毒则是二者在正常生理条件下配伍关系的核心内涵。(3)四逆汤方剂配伍关键环节的代谢调控差异研究:针对生物药剂学中的重要环节,利用代谢组学技术研究发现,附子单煎液、附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤均可改善模型大鼠的代谢紊乱状态,回调相关代谢物的相对表达量,所涉及代谢通路具有共性,表现出药效方面的相似性。但相较于附子单煎液,附子甘草合煎液、附子干姜合煎液以及四逆汤可调控代谢物种类更多,对相同代谢物的调控力度更优,表现出配伍增效的配伍关系。同时,研究结果显示,附子单煎液、附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤均可导致正常大鼠代谢物的相对表达量异常变化,不同煎液对相同代谢物的作用趋势基本一致,但附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤对代谢物的干扰作用低于附子单煎液,表现出配伍减毒的作用。通过进一步分析发现,相同煎液对模型大鼠或正常大鼠体内同一代谢物的调控趋势基本相同,在不同生理条件下,代谢物的相对表达量相较于正常值是否发生偏离,是导致药物调控意义发生改变,进而表现为药效或毒性的重要原因。(4)四逆汤方剂配伍增效减毒机制的网络药理学研究:通过研究发现,附子抗心力衰竭药效网络由66个成分,43个靶点,10条通路构成;附子与甘草配伍后,药效网络中的靶点增加至49个,参与成分292个,新增作用通路3条(血管平滑肌收缩、血清素能突触、Rap 1信号通路);附子与干姜配伍后,药效网络中的靶点增加至47个,参与成分188个,新增作用通路2条(血管平滑肌收缩、Rap 1信号通路);四逆汤全方配伍可调控靶点49个,参与成分414个,作用通路13条;由此分析,四逆汤配伍增效机制可能与调控靶点、参与成分、作用通路的增加相关,并通Adavosertib半抑制浓度过钙信号通路、c GMP-PKG信号通路、神经活性配体-受体相互作用、c AMP信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号、肾素分泌、血管平滑肌收缩、心肌收缩、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、肾素-血管紧张素系统、血清素能突触、Rap 1信号通路等具体通路实现。同时,研究发现附子心脏毒性网络由46个成分,16个靶点和心肌细胞肾上腺素能信号通路构成,附子与干姜配伍后相关靶点未富集到具有显著性意义通路,提示干姜对附子减Needle aspiration biopsy毒作用较弱;附子与甘草配伍后可通过心肌细胞肾上腺素能信号、醛固酮合成与分泌等18条通路对附子心脏毒性发挥针对性与综合性的调控作用,而四逆汤全方配伍后毒性调控通路与附子甘草配伍环节一致,揭示了甘草在四逆汤全方配伍减毒作用中的主导地位。(5)代谢组学结合网络药理Dorsomorphin学关联分析及验证研究:通过关联分析,发现心肌细胞肾上腺素能信号、钙信号通路、c AMP信号通路、c GMP-PKG信号通路、肥厚型心肌病、肾素分泌、心肌收缩、神经活性配体-受体相互作用、血管平滑肌收缩、肾素-血管紧张素系统等通路是四逆汤方剂配伍增效机制的关键环节;降低附子对心肌细胞肾上腺素能信号、催产素信号通路、胰岛素信号通路等关键通路的影响,是四逆汤方剂配伍减毒机制的核心。进一步的Western blot验证实验证明,四逆汤不同配伍水煎液均可显著降低模型大鼠肾素-血管紧张素系统中ACE、ACE2、AngⅡ、ATR2等蛋白的表达,且相较于附子单煎液,附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤的药效更优。同时,四逆汤不同配伍水煎液均可导致正常大鼠心肌细胞肾上腺素能信号通路中AKT、ERK、TNNI3等蛋白的表达显著升高,但附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤的升高作用较附子单煎液均有所降低。综上,本论文基于生物药剂学的“药物-机体-效应”联动环节,通过整体药效评价-代谢组学-网络药理学-组学关联分析的整合研究模式,探明了四逆汤方剂配伍关系在不同生理条件下的核心内涵,即病理条件下以增效关系为配伍核心,正常生理条件下以减毒作用为配伍重点,并在此基础上对其配伍机制及关键环节进行了探索,进一步客观阐释了四逆汤方剂配伍的科学实质,也为其临床用药、用药风险预警、质量标准提升等相关研究提供了参考。
雷帕霉素预处理MDSC来源的外泌体miR-181d-5p通过靶向KLF6缓解角膜移植排斥反应
目的:经前期研究证明,雷帕霉素预处理MDSC(骨髓源性免疫抑制细胞)分泌的外泌体(Rapa-Exo)可有效延缓角膜移植排斥反应。但其作用机制尚不清楚。本研究的目的为进一步探讨雷帕霉素预处理MDSC分泌的外泌体延缓角膜移植免疫排斥的作用机制。方法:(1)MDSC来源的Exo分离与鉴定:选取正常8周龄BALB/c小鼠,提取其骨髓细胞,通过免疫磁珠分选法分选骨髓细胞中的MDSC,加入Rapa(100nmol/L)培养2天收集上清,通过超速离心法提取培养上清液中的Exo,并通过透射电镜及WB鉴定Exo。(2)验证miR-181d-5p在细胞、外泌体及角膜中的表达量:选取正常8周龄BALB/c小鼠,提取其骨髓细胞,通过免疫磁珠分选法分选骨髓细胞中的MDSC,将MDSC分为Nor组和Rapa组。Rapa组加入Rapa(100nmol/L)。两组MDSC培养2天收集细胞及细胞上清,细胞上清通过超速离心法提取培养上清液中的Exo。提取两组细胞及Exo中的RNA。建立同系小鼠穿透性角膜移植和异系小鼠穿透性角膜移植模型,待异系移植小鼠角膜发生排斥后取下眼球,此时将同系移植小鼠未排斥角膜取下,以正常同龄小鼠眼球作为对照,提取角膜RNA。经PCR检测细胞、外泌体和角膜组织中miR-181d-5p的表达量。(3)构建穿透性角膜移植模型及高表达miR-181d-5p的Rapa-Exo干预治疗与效果评价:建立小鼠异系穿透性角膜移植模型,随机分为Allo+PBS组、Allo+Rapa-Exo组、Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组。术后三天开始结膜下注射,Allo+PBS组结膜下注射PBS溶液;Allo+Rapa-Exo组结膜下注射Rapa-Exo,浓度为100μg/ml;Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组结膜下注射Rapa-Exo和miR-181d-5p antagomir,Rapa-Exo浓度为100μg/ml,miR-181d-5p antagomir浓度为1000μg/ml,剂量均为10μl/次,3天1次,共注射3次。每隔一天用裂隙灯给小鼠术眼拍照观察小鼠植片排斥情况,观察30天,根据植片排斥时间绘制生存曲线。术后23天,取以上3组角膜,进行HE染色比较各组植片炎症反应情况。经PCR检测角膜组织中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α、Ccr7和IL-17α的表达量。(4)巨噬细胞的分离以及与Exo共培养:选取正常8周龄BALB/c小鼠,提取其骨髓细胞,加入m-csf刺激因子培养至第6天,将巨噬细胞分为四组,正常组(Nor组)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+Rapa-Exo组(LPS+Rapa-Exo组)、脂多糖+Rapa-Exo+miR-181d-5p inhibitor组(LPS+Rapa-Exo+miR-181d-5p inhibitor组)。各组细胞加入刺激后培养24h收集细胞、培养48h收集细胞上清。将收集的细胞提取RNA后,经过Real time PCR法检测细胞中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β和TNF-α的表达水平。用ELISA试剂盒检测细胞上清炎症因子IL-6和TNF-α蛋白水平。(5)Mi R-181d-5p靶基因预测:通过四种不同的网站进行miR-181d-5p靶基因的预测,分别是miRDB、Target Scan、RNA22和Starbase。Target Scan获得大鼠、小鼠和人的miR-181d-5p与KLF6结合位点及序列。双荧光素酶报告基因检测mmumiR-181d-5p与KLF6能否相互作用。(6)巨噬细胞与si KLF6共培养:依据上述(4)中的方法将巨噬细胞培养至第六天,将细胞分为三组,正常组(Nor组)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+si KLF6组(LPS+si KLF6组)。各组细胞加入刺激后培养24h收集细胞(细胞1),培养48h收集细胞(细胞2)及培养上清。提取细胞1中的RNA,经Real time PCR法检测细胞中的炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α和klf6的表达水平。提取细胞2中的蛋白,经蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测各组klf6的表达量。用ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-6和TNFα的表达水平。(7)构建穿透性角膜移植模型及si KLF6的干预治疗与效果评价:建立小鼠异系穿透性角膜移植模型,随机分为Allo+PBS组、Allo+si KLF6组,术后3天开始结膜下注射si KLF61(000μg/ml),剂量10μl,3天1次,共注射3次。每隔一天用裂隙灯给小鼠术眼拍照观察小鼠植片排斥情况,观察30天,根据植片排斥时间绘制生存曲线。术后Ceralasertib作用20天,取以上两组角膜,行HE染色观察比较两组角膜炎症反应情况。经PCR检测角膜组织中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α的表达量。结果:(1)MDSC来源的外泌体鉴定:提取的外泌体通过100kv进行电镜检测成像,形态为一侧或双侧凹陷的盘状囊泡,直径主要集中在180nm,分布范围在50～200nm之间。WB结果显示外泌体CD81、CD9结果阳性。结果说明成功提取外泌体。(2)Mi R-181d-5p在细胞、外泌体及角膜中的表达差异:Real time PCmedicinal marine organismsR法检测结果可知,Rapa预处理的MDSC及其分泌的外泌体中miR-181d-5p表达量高于未处理组的MDSC及其分泌的外泌体。在角膜组织中,异系排斥组的角膜miR-181d-5p表达量低于正常组和同系未排斥角膜。(3)Mi R-181d-5p体内实验观察:三组小鼠角膜移植模型中,各组小鼠角膜植片平均存活时间分别为Allo+PBS组(18.9±5.8)d、Allo+Rapa-Exo组(25.4±6.0)d、Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组(17.1±3.8)d。Allo+Rapa-Exo组的存活时间显著高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05)。各组角膜HE染色Allo+PBS组与Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组炎症反应较重,Allo+Rapa-Exo组角膜炎症反应较轻。Real time PCR法检测各组植片中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β和TNF-α的表达量,发现Allo+PBS组与Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组明显高于Allo+Rapa-Exo组(P<0.05)。(4)上调miR-181d-5p在巨噬细胞的作用:四组巨噬细胞,经Real time PCR检测,不做任何处理的Nor组炎症因子表达水平最低,LPS组与LPS+Rapa-Exo+miR-181d-5p inhibitor组的炎症因子表达水平无统计学差异且明显高于LPS+Rapa-Exo组(P<0.05)。ELISA检测细胞培养上清,炎症因子表达水平与Real time PCR结果一致。免疫荧光发现klf6的表达水平Nor组最低,LPS组与LPS+Rapa-Exo+miR-181d-5p inhibitor组表达量最高且无统计学差确认细节异,同时高于LPS+Rapa-Exo组。表明上调miR-181d-5p可明显降低巨噬细胞炎症因子的表达量,即miR-181d-5p具有抑制巨噬细胞炎症反应的作用。(5)靶基因生物信息学分析:在四种不同的网站miRDB、Target Scan、RNA22和Starbase均预测KLF6是miR-181d-5p的靶基因。Target Scan是最早出现的miRNA靶基因软件,也是目前使用率和准确性最高的预测软件,通过该软件获得miR-181d-5p与KLF6在大鼠、小鼠和人的结合位点及序列。双荧光素酶报告基因检测mmu-miR-181d-5p可与KLF6的启动子结合。(6)si KLF6转染巨噬细胞:通过Real time PCR法检测细胞IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α表达量,三组巨噬细胞炎症因子的表达水平由强到弱依次为LPS组、LPS+si KLF6组、Nor组。通过ELISA检测细胞上清中IL-6、TNF-α蛋白水平以及用Western Blot检测KLF6的蛋白水平,结果与Real time PCR一致。(7)si KLF6的体内实验:两组小鼠角膜移植模型中,各组小鼠角膜植片存活时间分别为Allo+PBS组(18.2±7.0)d,Allo+si KLF6组(27.7±6.4)d。Real time PCR检测各组植片中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α及KLF6的表达量,Allo+si KLF6组明显低于Allo组。结论:(1)雷帕霉素预处理的MDSC分泌的外泌体具有延缓角膜移植免疫排斥反应的作用。(2)Mi R-181d-5p以klf6为作用靶点抑制巨噬细胞炎症反应并延缓角膜移植排斥反应。
CD47在经典型霍奇金淋巴瘤中的表达情况及临床意义
目的:研究免疫检查点分子CD47在经典型霍奇金淋巴瘤中的表达情况及临床意义。方法:收集90例中国医学科学院肿瘤医院经典型霍奇金淋巴瘤患者的样本,分别为结节硬化型霍奇金淋巴瘤(Nodular sclerosis classic Hodgkin lymphoma)54例,混合细胞型霍奇金淋巴瘤(Mixed-cellularity claMucosal microbiomessic Hodgkin lymphoSAHAma)28例,淋巴细胞丰富型霍奇金淋巴瘤(Lymphocyte-rich classic Hodgkin lymphoma)6例,淋巴细胞减少型霍奇金淋巴瘤(Lymphocyte depleted classic Hodgkin lymphoma)2例。通过免疫组化染色,比较CD47高表达与低表达情况,并对经典型霍奇金淋巴瘤免疫微环境、临床病理特征的意义进行分析。本课题同时也对PD-1、PD-L1、EBV-LMP1在经典型霍奇金淋巴瘤中的表达情况和临床意义进行了探索。结果:本研究表明,在90例经典型霍奇金淋巴瘤病例中,共有22例CD47高表达,68例CD47低表达。与CD47高表达相关的因素包括:男性(P=0.044)、年龄≥45岁(P=0.000),PD-L1阳性(P=0.024),与PD-L1 阳性表达相关的因素:年龄≥45岁(P=0.033),Ann Arbor 分期(Ⅲ/Ⅳ)(P=0.002)Nirmatrelvir小鼠。在 K-M 生存分析中,发现与 OS 相关的风险因素为:CD47高表达(P=0.024)、年龄≥45岁(P=0.031),与在单因素分析中的结果一致。在无事件生存期(event-free survival,EFS)单因素分析中,风险因素为:CD47高表达(p=0.020)、CD47高表达/PD-L1共表达(P=0.001)、B症状(P=0.047)。在无事件生存期多因素分析中,发现B症状是患者无事件生存期的独立风险因素。结论:本研究通过对CD47在经典型霍奇金淋巴瘤中的表达情况及其与经典型霍奇金淋巴瘤免疫微环境、临床病理特征、预后的相关性进行了分析,发现CD47高表达组在生存分析中预后较差。该结果为CD47靶向药临床试验提供了进一步的证据支持。B症状是患者无事件生存期的独立风险因素,这为临床医师对患者的预后判断提供了一个新的方向。
长链非编码RNA Lcn2-204对脓毒血症小鼠心肌损伤铁过载和铁死亡的影响及机制探讨
目的:观察铁过载和铁死亡在盲肠结扎与穿孔(cecum ligation and perforation,CLP)法诱导的脓毒血症小鼠心肌损伤中的变化,并分析CLP中差异表达的LncRNAs和mRNAs。研究LncRNA Lcn2-204的基本特点,探讨LncRNA Lcn2-204能否参与调控小鼠脓毒血症的铁代谢,并参与到铁死亡发生过程中。方法:第一部分,选取成年雄性C57BL/6J小鼠,采用CLP法诱导脓毒血症心肌损伤模型。小鼠随机分为6组(10只/组):假手术组(Sham);CLP组;CLP+二甲基亚砜(DMSO,溶媒)组;CLP+铁螯合剂右雷佐生盐酸盐组(DXZ,小鼠在CLP前2 h腹腔注射50 mg/kg DXZ);CLP+铁死亡特异性抑制剂ferrostatin-1(Fer-1,小鼠在CLP前2 h腹腔注射5 mg/kg Fer-1)组;急性铁过载右旋糖酐铁(Irondextran,小鼠腹腔注射1000 mg/kg Iron-dextran)组。第二部分,选取成年雄性C57BL/6J小鼠,首先,通过微阵列鉴定假手术组和CLP手术组小鼠差异表达的长链非编码RNA(LncRNA)和信使RNA(mRNA)。构建编码-非编码基因共表达网络(CNC网络)揭示最高上调的LncRNA-Lcn2-204与mRNAs之间的联系,通过生物信息学方法分析差异表达的mRNAs的潜在机制。构建靶向心肌的低表达LncRNA Lcn2-204(sh RNA-Lcn2-204)重组腺相关病毒及其空载体(NCRNA),CLP手术和注射Iron-dextran前21天尾静脉注射病毒,小鼠随机分为6组(10只/组):Sham+NCRNA组、Sham+sh RNA-Lcn2-204组、CLP+NCRNA组、CLP+sh RNA-Lcn2-204组、Iron-dextran+NCRNA组、Iron-dextran+sh RNA-Lcn2-204组。以上分组的小鼠在CLP术后24 h或注射Iron-dextran后6 h,通过超声心动图检测小鼠心功能改变;H&E染色观察心肌损伤病理变化;透射电镜观察心肌纤维超微结构和线粒体的变化;超氧化物阴离子荧光探针(dihydroethidium,DHE)荧光染色观察心肌组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平变化;TUNEL荧光染色评估心肌细胞死亡阳性率;检测血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、脂质运载蛋白2(lipocalin-2,Lcn2)水平及心肌白介素6(interleukin 6,IL-6)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、脂素1(lipin 1,LPIN1)水平的变化;实时荧光定量PCR验证微阵列分析结果、LncRNA Lcn2-204和Lcn2 mRNA表达水平;Western blot检测心肌组织转铁蛋白受体1(transferrin receptor1,TFR1)、膜铁转运蛋白1(ferroprotein 1,FPN1)、铁蛋白(ferritin)、溶质载体家族7成员11(recombinant solute carrier family 7 member 11,SLC7A11,x CT)、铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase,GPX4)、Lcn2蛋白表达水平变化。此外还检测了sham组、CLP组、CLP+DXZ组和CLP+Fer-1组心肌线粒体二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate-dehydrogenase,DHODH)蛋白表达水平变化。结果:第一部分:与Sham组相比,CLP组、CLP+DMSO组、Iron-dextran组小鼠左心室心输出量(cardiac output,CO)、每搏输出量(stroke volume,SV)、缩短分数(left ventricular fractional shortening,LVFS)和射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)均明显下降(P<0.001);心肌ROS水平明显升高(P<0.001);血清CK-MB、LDH、Lcn2水LGK-974体内实验剂量平和心肌IL-6、MDA水平均明显升高(P<0.001～0.01),心肌SOD和LPIN1水平明显降低(P<0.001～0.01);心肌铁代谢相关蛋白TFR1蛋白表达升高(P<0.001～0.01),FPN1(P<0.001～0.01)、铁蛋白(P<0.01)蛋白表达均降低;铁死亡相关蛋白x CT(P<0.001～0.05)、FSP1(P<0.05)、GPX4(P<0.001～0.01)蛋白表达均降低;Lcn2蛋白表达升高(P<0.001～0.05);CLP组心肌线粒体蛋白DHODH表达降低(P<0.001);心肌LncRNA Lcn2-204表达升高(P<0.001～0.05),Lcn2 mRNA水平升高(P<0.001)。CLP和CLP+DMSO组TUNEL染色阳性细胞率增加(P<0.001),Iron-dextran组无统计学意义。H&E染色观察到CLP和CLP+DMSO组小鼠心肌纤维排列不整齐,部分变性,有炎性细胞浸润,间质水肿,横纹模糊,红细胞渗出,Iron-dextran组心肌纤维有断裂、水肿,但整体形态保持完整,间质内有铁沉积,炎性细胞浸润较少;透射电镜观察到CLP和CLP+DMSO组部分线粒体嵴减少,外膜破裂,部分线粒体变小,膜密度增高,Iron-dextran组虽然心肌纤维排列较紊乱,但部分线粒体结构致密,无明显的线粒体损伤。与CLP组相比,CLP+DXZ组和CLP+Fer-1组小鼠左心室CO、SV、LVEF%、LVFS%升高(P<0.001～0.01);肌丝排列较整齐,无炎性细胞的浸润;心肌纤维排列更完整,线粒体损伤较小;ROS水平明显降低(P<0.001);TUNEL染色阳性细胞率明显降低(P<0.001);血清CK-MB、LDH、Lcn2水平和心肌IL-6、MDA水平均明显降低(P<0.001～0.01);心肌组织TFR1、Lcn2蛋白表达降低(P<0.01～0.05),FPN1(P<0.01)、铁Populus microbiome蛋白(P<0.05)、x CT(P<0.001～0.01)、FSP1(P<0.001～0.01)、GPX4(P<0.01～0.05)蛋白表达均升高,CLP组线粒体DHODH蛋白表达升高(P<0.001);LncRNA Lcn2-204表达降低(P<0.01);Lcn2 mRNA水平降低(P<0.001～0.01);CLP+Fer-1组SOD水平明显升高(P<0.05),CLP+DXZ组SOD水平无明显变化。与CLP组相比,CLP+DMSO均无统计学差异。第二部分:通过微阵列分析发现Sham与CLP组中有520个mRNA和552个LncRNA差异表达,其中LncRNA-Lcn2-204是差异表达最高的上调LncRNA,其CNC网络由137个正交互和138个负交互组成。生物信息学分析结果表明铁代谢紊乱与脓毒血症心肌损伤有关,生物信息学分析富集多个与铁相关条目,其中有六个基因(Scara5、Tfrc、Lcn2、Cp、Clic5、Ank1)与铁代谢密切相关。与CLP+NCRNA组相比,CLP+sh RNA-Lcn2-204组小鼠左心室CO、SV、LVEF%、LVFS%升高(P<0.001～0.05);肌丝排列较整齐,无炎性细胞的浸润;ROS水平明显降低(P<0.01);TUNEL染色阳性细胞率明显降低(P<0.001);血清CK-MB、LDH、Lcn2水平和心肌IL-6、MDA水平均明显降低(P<0.001～0.05),心肌SOD、LPIN1水平明显升高(P<0.01～0.05);心肌组织TFR1(P<0.05)、Lcn2(P<0.01)蛋白表达均降低,FPN1(P<0.05)、铁蛋白(P<0.01)、x CT(P<0.05)、FSP1(P<0.01)、GPX4(P<0.05)蛋白表达均升高;LncRNA Lcn2-204表达降低(P<0.01);Lcn2 mRNA水平降低(P<0.01)。与Iron-dextran+NCRNA组相比,Iron-dextran+sh RNA-Lcn2-204小鼠左心室CO、SV、LVEF%、LVFS%降低(P<0.001～0.05);肌丝排列较整齐,无炎性细胞的浸润,出现较少铁沉积;ROS水selleck HPLC平明显降低(P<0.01);TUNEL染色结果无统计学差异;血清CK-MB、LDH、Lcn2水平和心肌IL-6、MDA水平均明显降低(P<0.001～0.01),心肌SOD水平明显升高(P<0.01),LPIN1无明显变化;心肌组织TFR1(P<0.01)、Lcn2蛋白表达(P<0.01)降低,FPN1(P<0.05)、铁蛋白(P<0.001)、x CT(P<0.001)、FSP1(P<0.01)、GPX4(P<0.01)蛋白表达均升高;LncRNA Lcn2-204表达降低(P<0.01);Lcn2 mRNA水平降低(P<0.01)。结论:1.CLP诱导的脓毒血症小鼠心肌损伤中存在铁过载和铁死亡,抑制铁过载和铁死亡能够减轻心肌损伤;2.脓毒血症小鼠心肌LncRNA Lcn2-204表达增高;3.敲低LncRNA Lcn2-204保护小鼠免受脓毒血症心肌损伤造成的铁代谢紊乱和心肌细胞铁死亡,并可能通过降低Lcn2表达发挥保护作用。