目的 探讨低氧微环境和结肠癌转移相关基因1(MACC1)对结直肠癌(VE-822采购CRC)肿瘤干细胞(CSC)样特性生物学行为的www.selleck.cn/products/3-methyladenine影响及机制。方法 将空载体(LV-ctrl组)、MACC1过表达载体(LV-MACC1)转染结肠癌细胞HCT116,同时在低氧微环境条件下培养LV-MACC1细胞(LV-MACC1+hypoxia组)。分别应用CCK-8法及免疫细胞化学法、划痕实验、Transwell侵袭实验、肿瘤球形成实验检测细胞增殖、迁移能力、侵袭能力及体外肿瘤形成能力。免疫印迹法检测MACC1、CD133、CD44、AKT和p-AKT蛋白的表达，740 Y-P验证PI3K/AKT在MACC1诱导的肿瘤干细胞样特性中的作用。结果 与LV-ctrl组比较，LV-MACC1组的细胞增殖、迁移和侵袭能力均增强，肿瘤球形成增多，CD44、CD133和p-AKT蛋白的表达水平增高(P<0.05)。与LV-MACC1组比较，LV-MACC1+hypoxia组的细胞增殖、迁移和侵袭能力增强，肿瘤球形成增多(P<0.05);CD44、CD133和p-AKT蛋白的表达水平增高(P<0.05)。与对照组比较，740 Y-P增加了细胞CD133和CD44蛋白表达水平(P<0.05)。结论 低氧微环境增Culturing Equipment强MACC1调控PI3K/AKT信号通路促进结直肠癌细胞出现肿瘤干细胞样特性。
陆地棉背景海岛棉导入系棉仁营养品质性状QTL定位分析
棉花是世界上最重要的经济作物之一,即是天然纤维的主要来源。长期以来,棉花育种工作者都以提高棉花产量和改善纤维品质为研究重点,而有关棉仁营养成分相关的研究相对较少。棉籽是重要的植物蛋白质和油分来源,棉籽中不饱和脂肪酸含量较高,而且棉籽蛋白质含有多种氨基酸,且各种氨基酸的比例均衡,因此研究棉仁营养品质性状的遗传特性,对进一步提高棉花的经济价值具有重要意义。本研究以陆地棉丰产品种中棉所35为轮回亲本,优质海岛棉品系C084-220为供体亲本,构建了一套包含523个株系的染色体片段导入系群体。从实验室前期构建的高密度陆海遗传图谱上挑选SSR标记检测BC_3F_2代所有单株的基因型,同时用近红外快速检测仪测定棉仁主要营养成分含量(蛋白质含量、含油量、油酸含量、亚油酸含量、棕榈酸含量、硬脂酸含量)。结合基因型数据与四个环境的表型数据定位棉仁营养品质性状QTL,主要研究结果如下:1.染色体片段导入系的基因型分析实验室前期已利用477个标记检测了BC_3F_2群体单株的基因型,本研究对标记间隔较大区域进一步增加标记密度,新增107个SSR标记。利用新增标记检测导入系后,584个标记覆盖棉花基因组的98.34%,标记平均距离为6.56 c M,导入系各染色体的遗传背景恢复率范围为57.79%～96.60%,平均背景恢复率为87.89%。各单株导入片段的长度介于112.36 c M～1599.42 c M之间,平均长functional symbiosis度为452.19 c M。2.棉仁营养品质性状QTL分析四个环境下共定位到77个棉仁营养品质性状QTL,其中包括19个蛋白质含量QTL,16个含油量QTL,6个棕榈酸含量QTL,10个硬脂酸含量QTL,15个油酸含量QTL,11个亚油酸含量QTL。At亚组共检测到34个QTL,Dt亚组共检测到43个QTL,所有QTL的LOD值范围为2.00～25.01,单个QTL解释了2.1%～25.9%的表型变异率。45个QTL的增效等位基因来源于轮回亲本中棉所35,另外32个QTL的增效等位基因来源于供体亲本C084-220。定位的17个QTL能够在两个及两个以上的环境中被检测到。3.基于棉仁营养品质性状BLUP值的QTL分析分别对6个营养品质性状进行最佳线性无偏预测(BLUP)分析,并利用BLUP值进行QTL定位分析,共检selleck合成测到49个QTL。其中,At亚组检测到25个QTL,Dt亚组检测到24个QTL。单个QTL的LOD值介于2.01～22.53之间,解释表型变异1.8%～18.5%。利用BLUP值定位到的QTL有29个与原始表型值QTL分析检测到的AG-221QTL重合。4.高含油量株系的鉴定本研究定位到的16个含油量QTL的增效等位基因均来自于海岛棉C084-220,表明在这些QTL区域来自C084-220的染色体片段能够提升轮回亲本中棉所35的含油量。因此选择了3个稳定的含油量QTL位点(q OC-A07-2、q OC-A09-1、q OC-D03-2),分析不同染色体片段对表型的影响。统计分析显示无三个位点同时导入C084-220染色体片段的纯合株系,但与在三个位点均为陆地棉中棉所35纯合片段的株系相比,含有1个有利等位基因的纯合株系含油量提升3.61%～8.54%,同时含有其中两个QTL位点的10个纯合导入片段株系,其含油量提升9.95%～11.10%,这10个高含油量株系是未来分子育种的理想材料。
刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗的构建及SRS29C与SAG1联合免疫保护性的比较研究
为了探究刚地弓形虫表面蛋白(surface antigen, SAG)SRS29C基因和SRS29C、SAG1联合基因的核酸疫PD-0332991价格苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护效果，试验利用PCR方法扩增了SRS29C基因片段并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组质粒pEGFP-SRS29C,并对该质粒进行酶切鉴定，同时用该质粒对HEK293T细胞进行转染，再用Western-blot方法检测目标蛋白在细胞中的表达情况；用重组质粒pEGFP-SRS29C和pEGFP-SAG1单独免疫或联合免疫小鼠，用ELICell Biology ServicesSA法测定血清IgG水平，CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力，流式细胞仪测定CD_4~+和CD_8~+T淋巴细胞百分比，ELISA试剂盒检测脾脏细胞因子的表达情况；进行小鼠体内攻虫试验，记录小鼠存活时间。结果表明：成功构建了重组质粒pEGFP-SRS29C,表达的蛋白质大小为66 ku; pEGFP-SRS29C组和联合免疫组与PBS组和空载体组相比血清IgG含量、脾淋巴细胞增殖率、CD4~+/CD8~+值均显著提高(P<0.05);pEGFP-SRS29C组和联合免疫组γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量明显提高；联合免疫组诱免疫球蛋白G(IgG)、IFN-γ和TNF-α含量均高于pEGFP-SRS29C组和pEGFP-SAGPUN301191组。PBS组和空载体组小鼠存活8～9 d; pEGFP-SRS29C组小鼠存活(18.10±1.37)d, pEGFP-SAG1组小鼠存活(21.20±0.97)d,联合免疫组小鼠存活(24.20±1.72)d,极显著长于PBS组和空载体组(P<0.01)。说明单独使用构建的弓形虫核酸疫苗pEGFP-SRS29C或与pEGFP-SAG1联合使用能够诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，增强小鼠抵抗弓形虫感染的能力，并且SRS29C作为保护性抗原与SAG1联合免疫的效果更好。
氯沙坦钾对糖尿病大鼠肾脏内质网应激及炎症反应的作用研究
目的 探讨氯沙坦钾在糖尿病大鼠肾脏内质网应激以及炎症反应中的作用。方法 选取30只SD雄性大鼠，以随机分组的方式将其分为对照组（10只）、模型组（10只）和氯沙坦钾组（10只）。模型组和氯沙坦钾组大鼠进行腹腔注射链脲佐菌素以建立糖尿病大鼠模型，对照组注射相同体积的枸橼酸钠缓冲液。模型建立后，氯沙坦钾组给予每日氯沙坦钾灌胃，持续4周。使用逆转录-聚合酶链反应检测肾组织中c-Jun氨基末端激酶（JNK）、C/EBP同源蛋白（CHOP）、人巨噬细胞趋化蛋白cruise ship medical evacuation-1(MCP-1)的mRNA表达，使用蛋白质印迹法检测大鼠肾组织中JNK、p-JNK、CHOP、MCP-1蛋白的表达情况。结果 4周后，模型组与氯沙坦钾组的24 h尿蛋白定量均高于对照组，且氯沙坦钾组低于模型组（P <0.05）；三组的肾组织中JNK mRNA水平差异无统计学意义（P> 0.05），模型组与氯沙坦钾组的CHOP、MCP-1 mRNA表达水平均高于对照组，且氯沙坦钾组低于模型组（P <0.05）；三组JNK蛋白的表达水平差异无统计学意义（P> 0.05）；氯沙MK-4827小鼠坦钾组与模型组的p-JNK、CHOP、MCP-1蛋白的表达水平均高于对照组，且氯沙坦钾组低于模型组（P<0.05）。结论 氯沙坦钾可以降低JNK/CHOP通路蛋白的表达，从而抑制内质网应激，确认细节同时减少炎症反应，达到保护肾脏的作用。
烟酰胺对黄鳝生长性能、肌肉品质与脂质代谢的影响及其调控机理
黄鳝是我国重要的淡水经济养殖鱼类。烟酰胺作为辅酶Ⅰ(NAD~+/NADH)和辅酶Ⅱ(NADP~+/NADPH)的直接前体,在动物碳水化合物、脂肪及蛋白质相互转化与利用中起着重要调控作用,但其作用机理目前尚不清楚。目前也未见有关烟酰胺在黄鳝生产应用上的报道。鉴于此,本研究以黄鳝为养殖对象,通过添加不同剂量烟酰胺研究其对黄鳝生长、肌肉品质及脂质代谢的影响,以期为黄鳝等鱼类新型功能性饲料添加剂开发提供基础理论依据。研究结果如下:1.烟酰胺对黄鳝生长性能、血液生化指标及血清代谢组的影响采用单因子完全随机化试验设计,选择健康、体重匀称(3.29±0.02 g)幼鳝苗700尾,随机分成7个处理组,分别饲喂基础饲料上添加0、20、40、80、160、320和640mg/kg烟酰胺的等氮等能饲料(分别命名为N0、N20、N40、N80、N160、N320、N640)。养殖前期(0～60 d)发现饲料添加20 mg/kg烟酰胺极显著提高了黄鳝60 d末重、增重率和特定生长率(P<0.05);添加80～320 mg/kg烟酰胺提高了采食量和饲料转化率(P<0.01)。养殖后期(60～120 d)发现添加各水平烟酰胺均显著提高了黄鳝增重率、特定生长率和成活率(P<0.05);添加高剂量烟酰胺(320 mg/kg)能更好的提高120d黄鳝的增重率、特定生长率、采食量、饲料转化率、肥满度和肠体指数等(P<0.05),同时也降低了血清甘油三酯(TG)、非酯化脂肪酸(NEFA)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平,提高了高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平(P<0.05)。通过黄鳝增重率的折线拟合分析,发现幼苗期黄鳝(3～25 g)烟酰胺的最适添加量为19.46 mg/kg,整个养殖周期(3～50g)烟酰胺的最适添加量为29.47 mg/kg。通过血清代谢组学分析,发点击此处现添加40 mg/kg和320 mg/kg烟酰胺均显著改变了腺苷三磷酸结合盒(ABC)转运体和鞘磷脂代谢等糖脂代谢相关通路(P<0.05)。2.烟酰胺对黄鳝肌肉品质的影响添加各水平烟酰胺均显著提高了黄鳝肌肉的p H值、亮度(L*)、红度(a*)和内聚性(P<0.05),降低了肌肉的滴水损失、蒸煮损失、肌肉剪切力和咀嚼性(P<0.05)。饲料添加80 mg/kg以上烟酰胺可降低肌肉硬度和胶着性(P<0.05)。添加40～320 mg/kg烟酰胺Stress biomarkers均显著降低了肌肉糖原和糖酵解潜能(P<0.05)。添加20～40mg/kg烟酰胺提高了肌肉脂肪和体脂肪含量(P<0.05),而且肌肉组织切片分析也发现N40组黄鳝肌肉周围沉积的脂肪明显更多。饲料添加40 mg/kg烟酰胺显著提高了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和丙酮酸激酶(PK)活性(P<0.05),添加320mg/kg烟酰胺显著提高了PEPC活性,降低了苹果酸脱氢酶(MDH)活性(P<0.05)。进一步对肌肉脂肪酸含量分析,发现添加40 mg/kg烟酰胺显著提高黄鳝肌肉棕榈油酸(C16:1)含量,降低了硬脂酸(C18)含量(P<0.05);添加320 mg/kg烟酰胺提高了肌肉PUFA/SFA比,降低了硬脂酸和SFA含量。3.烟酰胺对黄鳝肝脏脂质代谢的影响饲料添加40 mg/kg烟酰胺显著降低了肝脏甘油三脂(TG)、非酯化脂肪酸(NEFA)、胆汁酸(TBA)和脂肪含量(P<0.05),提高了高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量(P<0.05);添加高剂量烟酰胺(320 mg/kg)除了降低肝脏甘油三酯(TG)、非酯化脂肪酸(NEFA)和胆汁酸(TBA)含量之外,还降低了葡萄糖(GLU)和糖原(GLUCO)水平(P<0.05),提高了肝脏高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(P<0.05)。添加40 mg/kg烟酰胺有提高丙酮酸激酶(PK)、苹果酸脱氢酶(MDH)和降低6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性的趋势(0.05
间歇充气压力泵辅助预防妇科盆腔术后下肢深静脉血栓的疗效观察
目的 探讨间歇充气压力泵辅助预防妇科盆腔术后下肢深静脉血栓的疗效。方法 研究选取2019年9月～2022年1月100例妇科盆腔疾病手术患者以www.selleck.cn/products/vx-661随机数字表法分组，基础组开展常规预防性护理(50例),试验组在此基础上辅助应用间歇充气压力泵(50例),比较两组凝血功能指标、下肢周径及静脉血液流速变化、下肢异常情况及护理满意度。结果 两组患者经过护理干预后，其凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)及活化部分凝血活酶时间(APTT)与干预前相比均延长，差异有统计学意义，P<0.05Barasertib说明书;但组间比较，差异无统计学意义，P>0.05,试验组患者护理后纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体(D-D)水平均低于基础组，差异有统计学意义，P<0.05。试验组护理后左、右下肢周径均小于基础组，其股静脉、腘静脉血流峰速均高于基础组，差异有统计学意义，P<0.05。试验组患者术后下肢皮肤颜色改变、下肢肿胀及DVT发生率均低于基础组，差异milk-derived bioactive peptide有统计学意义，P<0.05。试验组患者对护士风险防范、穿刺技术、舒适程度及DVT预防等方面满意度评分显著高于基础组，差异有统计学意义，P<0.05。结论 间歇充气压力泵辅助干预能够有效预防妇科盆腔术后下肢深静脉血栓的形成，促使患者凝血功能指标改善，并优化其下肢周径、提升股静脉、腘静脉血流峰速，从而全面提升其护理满意情况。
基于“肠道菌群-胆汁酸”轴改善热应激畜禽肉品质的研究进展
畜禽肉品质是对肉的理化特性进行综合评价的重要经济性状,而热应激一直是畜牧生产中降低畜禽肉品质的主要因素之一。肠道菌群可影响动物对养分的消化吸收、新programmed transcriptional realignment陈代谢及免疫功能等,胆汁酸能够促进脂肪和脂溶性物质消化吸收并作为信号Trichostatin A molecular weight分子调控机体代谢活动。肠道菌群参与胆汁酸的修饰过程,胆汁酸又能MRTX849浓度调控肠道菌群结构,它们之间存在双向调节作用。肠道菌群、胆汁酸及其受体的互作形成了“肠道菌群-胆汁酸”轴,调节着碳水化合物、脂质和能量代谢等许多生理过程,可能进一步影响着肉品质。大量研究表明,热应激造成畜禽生产性能的下降与肠道菌群、胆汁酸代谢的失调有关,但是热应激与“肠道菌群-胆汁酸”轴的关系不够明确。本文就热应激影响畜禽肉品质、“肠道菌群-胆汁酸”轴与热应激的关系以及通过该轴改善热应激导致的畜禽肉品质下降的可能机制进行综述,为解决热应激降低畜禽肉品质这一问题提供参考。
基于FAERS数据库的卡非佐米安全警戒信号挖掘与分析
目的:基于美国FDA不良事件报告系统(FAERS)对卡非佐米的不良反应进行挖掘，为临床安全用药提供参考。方法:收集FAERS数据库2012年3季度至2022年4季度共42个季度的数据，采用报告比值比法(ROR)和比例报告比值法(PRR)进行数据挖掘。结果:共提取到卡非佐米相关不良事件报告记录16 229例，男女比例为1.27∶1,患者中位年龄为65岁，小于18岁患者165例。美国、德国和法国是报告例数最多的前3位国家。单用卡非佐米患者8 330例，合并用药中联合地塞米松的患者5 340例。挖掘出卡非佐米不良事件信号688个，排除非药品不良反应信号后得到信号620个，累及20个器官系统。395个信号在现有药品说明书中未被提及，信号强度排名前50位的首选术语中未在说明书中出现的信号共34个，包括全身炎症反应综合征、软骨病、浆细胞骨髓瘤、室壁运动指数异常、关节强直等。卡非佐米联用地塞米松患者发生率较高的不良反应包括浆细胞骨髓瘤、血bacterial and virus infections小板减少、肺炎获悉更多、中性粒细胞减少等。结论:GSI-IX使用方法利用FAERS数据库可较深入挖掘分析卡非佐米安全警戒信号，为临床安全合理用药提供参考。使用卡非佐米期间应注意监测血液毒性、肾功能、血压波动、肿瘤溶解综合征、肺部情况，保障患者用药安全。
卵巢癌来源外泌体通过THBS1基因诱导巨噬细胞M2极化的研究
【目的】上皮性卵巢癌因早期诊断medical curricula困难、高复发性及转移性,因此其预后差。外泌体及其内容物与恶性肿瘤的外渗、免疫逃逸等密切相关,其可作为恶性肿瘤早期诊断的潜在标记物。肿瘤微环境是肿瘤生存的细胞环境,它能促进肿瘤进展及促使肿瘤的异质性,肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要组成成分,它能促进恶性肿瘤的血管生成、侵袭迁移等。本研究为探讨不同卵巢组织外泌体m RNAs表达谱的差异,筛选出不同卵巢组织差异性外泌体m RNAs,探究卵巢癌组织来源外泌体对巨噬细胞极化的调节作用以及为上皮性卵巢癌早期诊断、发生发展提供实验数据。【方法】1.收集2021年1月至2022年1月就诊于“云南省肿瘤医院妇科”住院行卵巢切除手术患者的标本。其中对于要求切除卵巢、临床诊断和术后病理诊断明确为子宫平滑肌瘤、子宫腺肌症等患者的卵巢标本,将其纳入正常卵巢组织组收集。2.分离原代上皮性卵巢癌细胞,超速离心法分离提取卵巢组织来源外泌体(正常卵巢组织组、良性肿瘤组、交界性肿瘤组、卵巢恶性肿瘤早期、卵巢恶性肿瘤晚期)、NTA及流式细胞术鉴定外泌体,其中流式细胞术检测外泌体表面标记物CD9。3.卵巢癌外泌体转录组高通量测序,比较分析各组外泌体m RNAs的差异表达;并用GO、KEGG pathway、PPI等生物信息学分析,筛选出差异性基因;蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测不同卵巢分组中外泌体THBS1基因表达水平。4.筛选出的外泌体差异性基因THBS1,在卵巢癌细胞中将其敲降,采用WB检测M1型巨噬细胞标志物CD86和M2型巨噬细胞标志物CD206表达水平。5.通过CCK8实验、细胞划痕实验等探讨卵巢癌外泌体通过THBS1基因调节巨噬细胞极化及促进肿瘤细胞的增殖和迁移。【结果】1.透射电镜下观察不同来源卵巢组织的外泌体,其形态、大小未见明显差异,均呈圆盘状的囊性结构;对不同来源卵巢组织外泌体进行粒径分析,正常卵巢组织组、卵巢良性肿瘤组、卵巢交界性肿瘤组、卵巢恶性肿瘤早期组、卵巢恶性肿瘤晚期组的平均粒径分别为176.3 nm、165.9 nm、174.2 nm、151.7 nm、155.8nm,平均浓度分别为1.5E+11 Particles/ml、7.2E+10 Particles/ml、1.6E+11Particles/ml、1.6E+11 Particles/ml、6.0E+9 Particles/ml,各组间外泌体粒径及浓度差异均无统INCB018424体内实验剂量计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测各组间外泌体标志物CD9均表达阳性,各组间外泌体表面蛋白CD9阳性率差异无统计学意义(P<0.05)。2.高通量测序结果发现,卵巢恶性肿瘤早期组和恶性肿瘤晚期组基因组成相似,卵巢良性肿瘤组和交界性肿瘤组基因组成相似。卵巢良性肿瘤组和正常卵巢组织组比较,共有26条差异表达m RNAs,其中21条表达上调,5条表达下调;卵巢交界性肿瘤组和正常卵巢组织组比较,共有20条差异表达m RNAs,其中18条表达上调,2条表达下调;卵巢恶性肿瘤早期组和正常卵巢组织组比较,共有349条差异表达m RNAs,其中199条表达上调,150条表达下调;卵巢恶性肿瘤晚期组和正常卵巢组织组比较,共有741条差异表达m RNAs,其中501条表达上调,240条表达下调。3.GO分析结果发现各组外泌体相关差异性m RNAs主要涉及多细胞生物过程、细胞增殖与分化、细胞迁移、解剖结构发育、细胞对化学刺激的反应、细胞过程负调控、细胞黏附、SMAD蛋白复合物、糖胺聚糖结合分子、细胞外基质组织、血管生成等。4.KEGG分析发现各组外泌体相关差异性m RNAs主要参与PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、TGF-β信号通路、人乳头瘤病毒感染等。5.通过绘制维恩图我们发现卵巢良性肿瘤组、恶性肿瘤早期组、恶性肿瘤晚期组共有差异性基因16个,通过PPI分析预测差异基因m RNAs和相互作用网络,我们最终筛选出与巨噬细胞极化相关的基因为THBS1。6.WB结果显示,THBS1在正常卵巢组织组、卵巢良性肿瘤组、交界性肿瘤组、恶性肿瘤早期组和恶性肿瘤晚期组中表达,其中卵巢恶性肿瘤早期组和恶性肿瘤晚期组表达水平显著高于正常卵巢组织组、良性肿瘤组和交界性肿瘤组(P<0.001)。7.WB结果显示,将差异基因THBS1敲降后,M2型巨噬细胞标志物CD206蛋白表达水平较对照组和空白载体组显著降低(P<0.001),M1型巨噬细胞标志物CD86蛋白表达水平较对照组和空白载体组显著增强(P<0.001)。CCK-8实验发现敲降THBS1基因,卵巢癌细胞增殖活力较空白载体组及对照组显著降低(P<0.001)。细胞划痕实验发现敲降THBS1基因后,卵巢癌细胞迁移能力较空白载体组和对照组降低。【结论】1.不同卵巢组织来源的外泌体浓度、形态无明显差异。2.不同卵巢组织来源的外泌体在成分上存在差异,其中卵巢恶性肿瘤早期组、恶性肿瘤晚期组与正常卵巢组织组比IACS-10759生产商较,m RNAs表达存在显著差异。差异性m RNAs主要涉及p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、TGF-β信号通路等。3.卵巢癌源性外泌体THBS1基因促进巨噬细胞向M2型极化。敲降THBS1基因后,巨噬细胞向M1型极化。4.卵巢癌外泌体THBS1基因能促进卵巢癌细胞的增殖和迁移。因此,卵巢癌外泌体THBS1基因的m RNA可能是潜在的早期诊断、促进肿瘤增殖和迁移的分子标志物。目前卵巢癌外泌体通过THBS1基因诱导巨噬细胞向M2型极化的机制尚不清楚,还有待进一步研究。
卵巢癌来源外泌体通过THBS1基因诱导巨噬细胞M2极化的研究
【目的】上皮性卵巢癌因早期诊断medical curricula困难、高复发性及转移性,因此其预后差。外泌体及其内容物与恶性肿瘤的外渗、免疫逃逸等密切相关,其可作为恶性肿瘤早期诊断的潜在标记物。肿瘤微环境是肿瘤生存的细胞环境,它能促进肿瘤进展及促使肿瘤的异质性,肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要组成成分,它能促进恶性肿瘤的血管生成、侵袭迁移等。本研究为探讨不同卵巢组织外泌体m RNAs表达谱的差异,筛选出不同卵巢组织差异性外泌体m RNAs,探究卵巢癌组织来源外泌体对巨噬细胞极化的调节作用以及为上皮性卵巢癌早期诊断、发生发展提供实验数据。【方法】1.收集2021年1月至2022年1月就诊于“云南省肿瘤医院妇科”住院行卵巢切除手术患者的标本。其中对于要求切除卵巢、临床诊断和术后病理诊断明确为子宫平滑肌瘤、子宫腺肌症等患者的卵巢标本,将其纳入正常卵巢组织组收集。2.分离原代上皮性卵巢癌细胞,超速离心法分离提取卵巢组织来源外泌体(正常卵巢组织组、良性肿瘤组、交界性肿瘤组、卵巢恶性肿瘤早期、卵巢恶性肿瘤晚期)、NTA及流式细胞术鉴定外泌体,其中流式细胞术检测外泌体表面标记物CD9。3.卵巢癌外泌体转录组高通量测序,比较分析各组外泌体m RNAs的差异表达;并用GO、KEGG pathway、PPI等生物信息学分析,筛选出差异性基因;蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测不同卵巢分组中外泌体THBS1基因表达水平。4.筛选出的外泌体差异性基因THBS1,在卵巢癌细胞中将其敲降,采用WB检测M1型巨噬细胞标志物CD86和M2型巨噬细胞标志物CD206表达水平。5.通过CCK8实验、细胞划痕实验等探讨卵巢癌外泌体通过THBS1基因调节巨噬细胞极化及促进肿瘤细胞的增殖和迁移。【结果】1.透射电镜下观察不同来源卵巢组织的外泌体,其形态、大小未见明显差异,均呈圆盘状的囊性结构;对不同来源卵巢组织外泌体进行粒径分析,正常卵巢组织组、卵巢良性肿瘤组、卵巢交界性肿瘤组、卵巢恶性肿瘤早期组、卵巢恶性肿瘤晚期组的平均粒径分别为176.3 nm、165.9 nm、174.2 nm、151.7 nm、155.8nm,平均浓度分别为1.5E+11 Particles/ml、7.2E+10 Particles/ml、1.6E+11Particles/ml、1.6E+11 Particles/ml、6.0E+9 Particles/ml,各组间外泌体粒径及浓度差异均无统INCB018424体内实验剂量计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测各组间外泌体标志物CD9均表达阳性,各组间外泌体表面蛋白CD9阳性率差异无统计学意义(P<0.05)。2.高通量测序结果发现,卵巢恶性肿瘤早期组和恶性肿瘤晚期组基因组成相似,卵巢良性肿瘤组和交界性肿瘤组基因组成相似。卵巢良性肿瘤组和正常卵巢组织组比较,共有26条差异表达m RNAs,其中21条表达上调,5条表达下调;卵巢交界性肿瘤组和正常卵巢组织组比较,共有20条差异表达m RNAs,其中18条表达上调,2条表达下调;卵巢恶性肿瘤早期组和正常卵巢组织组比较,共有349条差异表达m RNAs,其中199条表达上调,150条表达下调;卵巢恶性肿瘤晚期组和正常卵巢组织组比较,共有741条差异表达m RNAs,其中501条表达上调,240条表达下调。3.GO分析结果发现各组外泌体相关差异性m RNAs主要涉及多细胞生物过程、细胞增殖与分化、细胞迁移、解剖结构发育、细胞对化学刺激的反应、细胞过程负调控、细胞黏附、SMAD蛋白复合物、糖胺聚糖结合分子、细胞外基质组织、血管生成等。4.KEGG分析发现各组外泌体相关差异性m RNAs主要参与PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、TGF-β信号通路、人乳头瘤病毒感染等。5.通过绘制维恩图我们发现卵巢良性肿瘤组、恶性肿瘤早期组、恶性肿瘤晚期组共有差异性基因16个,通过PPI分析预测差异基因m RNAs和相互作用网络,我们最终筛选出与巨噬细胞极化相关的基因为THBS1。6.WB结果显示,THBS1在正常卵巢组织组、卵巢良性肿瘤组、交界性肿瘤组、恶性肿瘤早期组和恶性肿瘤晚期组中表达,其中卵巢恶性肿瘤早期组和恶性肿瘤晚期组表达水平显著高于正常卵巢组织组、良性肿瘤组和交界性肿瘤组(P<0.001)。7.WB结果显示,将差异基因THBS1敲降后,M2型巨噬细胞标志物CD206蛋白表达水平较对照组和空白载体组显著降低(P<0.001),M1型巨噬细胞标志物CD86蛋白表达水平较对照组和空白载体组显著增强(P<0.001)。CCK-8实验发现敲降THBS1基因,卵巢癌细胞增殖活力较空白载体组及对照组显著降低(P<0.001)。细胞划痕实验发现敲降THBS1基因后,卵巢癌细胞迁移能力较空白载体组和对照组降低。【结论】1.不同卵巢组织来源的外泌体浓度、形态无明显差异。2.不同卵巢组织来源的外泌体在成分上存在差异,其中卵巢恶性肿瘤早期组、恶性肿瘤晚期组与正常卵巢组织组比IACS-10759生产商较,m RNAs表达存在显著差异。差异性m RNAs主要涉及p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、TGF-β信号通路等。3.卵巢癌源性外泌体THBS1基因促进巨噬细胞向M2型极化。敲降THBS1基因后,巨噬细胞向M1型极化。4.卵巢癌外泌体THBS1基因能促进卵巢癌细胞的增殖和迁移。因此,卵巢癌外泌体THBS1基因的m RNA可能是潜在的早期诊断、促进肿瘤增殖和迁移的分子标志物。目前卵巢癌外泌体通过THBS1基因诱导巨噬细胞向M2型极化的机制尚不清楚,还有待进一步研究。