Achr receptor

目的：探讨青藤碱（SME）对缺氧微环境BMN 673纯度诱导的甲状腺乳头状癌细胞“干性”的影响及机制。方法：采用不同selleck浓度（0.25、0.5和1 mmol/L）的SME处理缺氧条件下的人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞或采用1 mmol/L SME处理缺氧条件下小泛素相关修饰蛋白（SUMO）特异性蛋白酶1(SENP-1)基因过表达的TPC-1细胞。流式细胞术检测肿瘤干细胞亚群（CD44~+CD24~-）比例；qRT-PCR检测肿瘤干细胞标志物Naimmune cellsnog、八聚体结合转录因子4(OCT4)和SRY盒转录因子2(SOX2)的mRNA表达水平；肿瘤细胞成球实验观察细胞的干性特征；Western blot检测细胞中SENP-1、SUMO1和低氧诱导因子1α(HIF-1α)的蛋白表达水平；试剂盒法检测细胞中HIF-1α蛋白SUMO化水平；免疫荧光染色检测细胞中HIF-1α蛋白分布情况。结果：SME可呈浓度依赖性降低缺氧微环境下TPC-1细胞中干细胞亚群（CD44~+CD24~-）比例，下调肿瘤干细胞标志物Nanog、OCT4和SOX2的mRNA表达水平，降低肿瘤细胞成球数量和成球体积，同时促进HIF-1α蛋白SUMO化，下调SENP-1和HIF-1α蛋白表达水平，上调SUMO1蛋白表达水平，并抑制HIF-1α蛋白向细胞核转位。然而，过表达SENP-1可逆转缺氧微环境下SME对TPC-1细胞“干性”的抑制作用，上调HIF-1α蛋白表达水平，并降低HIF-1α蛋白SUMO化水平。结论：SME通过促进缺氧条件下HIF-1α蛋白的SUMO化修饰，降低HIF-1α蛋白的稳定性和转录活性，进而抑制TPC-1细胞“干性”。

目的 探讨LASP1基因表达对人结肠癌（LOVO）细胞增殖、迁移以及侵袭能力的影响及其作用机制。方法 分别构建LASP1过表达质粒和LASP1干扰质粒转染LOVO细胞，qRT-PCR验证LASP1mRNA转染结果。MTT法、Tunel染色分别检测细胞增殖活性和细胞的凋亡情况，细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。Westernblot测定细胞LASP1、p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表达。结果 质粒转染成功。LASP1过表达的LOVO细胞的增殖、迁移和侵袭能力增加，细RAD001溶解度胞凋亡率降低，细胞中LASP1、p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表达升高（P<0.01）。而敲减LOVO细胞中LASP1的表达后，细胞增殖、迁移和侵袭能力减弱，细胞凋亡率增加，细胞Chlamydia infection中LASP1、p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表达降低（P<0.01）。结论 LASP1可正向调控FAK/AKT信号通路，促进LOVO细胞的增殖、迁移以及OXPHOS抑制剂侵袭能力。

研究目的:早期风险分层对急性心肌梗死(AMI)患者很重要。我们旨在开发一个简单易于使用的APACHE Ⅳ网页动态列线图,结合入院24小时内容易获得的临床参数,从而提高其预测AMI患者28天死亡率的能力。研究方法:有关急性心肌梗死患者的临床信息从e ICU数据库v2.0中提取。使用机器学习算法XGBoost、随机森林、梯度提升机、广义线性模型对数据库中所有变量与28天死亡率之间的关联性进行了初步筛查。采用单因素和多因素logistic回归分析进行主要的变量筛选。基于多因素分析,建立了预测这些患者28天死亡率的动态列线图。为了处理数据库中含有缺失变量的数据,我们应用了多重插补(MI)方法。预测模型在三个主要方面进行评估,即区分度、校准和临床有效性。区分度主要体现在受试者工作特征曲线下面积(AUC)、净重分类改善率(NRI)和综合判别率改善率(IDI)。校准由校准曲线图表示。临床有效性由决策曲线分析(DCA)曲线表示。最后,建立的最终模型与梅奥诊所的M-CARS模型进行比较。结SBE-β-CD果:共有504人通过纳排标准进入了这PCR Equipment项研究。所有504人都被用于构建预测模型,Alpelisib内部验证模型使用500次bootstrap方法。多因素分析显示,列线图中包括四个变量,即APACHE Ⅳ、首次入院乳酸样本、既往房颤(AF)和性别,其被纳入作为AMI 28天死亡率的独立预测因子。预测模型的AUC为0.819(95%CI 0.770至0.868),而内部验证模型的AUC为0.814(95%CI 0.765至0.860)。校准和DCA曲线表明,本研究中的动态列线图能较好的反映真实情况,可用于临床。由这四个变量组成的预测模型在NRI和IDI方面均优于单个APACHE Ⅳ指标构建的模型,其中NRI为16.4%(95%CI:6.1%至26.8%;P=0.0019),IDI为16.4%(95%CI:6.0%至26.8%,P=0.0020)。乳酸对APACHE Ⅳ系统的改善度占总NRI的近一半,这表明乳酸是除APACHE Ⅳ之外的三个变量中最重要的。与M-CARS模型相比,我们的最终的模型较其改善的指标分别为NRI为23.02%(95%CI:9.54%至36.50%;P=0.0008),IDI为23.02%(95%CI:9.47%至36.56%;P=0.009)。结论:APACHE Ⅳ结合入院乳酸首测值、既往房颤和性别构建的预测模型在预测AMI 28天死亡率方面优于单独的APACHE Ⅳ评分系统。预测模型的动态列线图模型通过网站app发布,允许临床医生在1分钟内将APACHE Ⅳ评分的预测效力提高16.4%。

目的 利用网络药理学和细胞实验探讨艾迪注射液治疗卵巢癌的关键分子靶点及可能的作用机制。方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TroditionalChinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)数据库筛选艾迪注射液中中药的活性成分及作用靶点，并筛选卵巢癌异常表达的基因，取交集后获得艾迪注射液作用于卵巢癌的可能靶点。接着对可能靶点进行蛋白质互作网络分析、构建药物-化合物-靶点网络和富集分析。进一步筛选靶点，对与卵巢癌预后相关的关键基因进行实验验证，用50mg/ml艾迪注射液处理卵巢癌细胞后利用CCK-8实验观察细胞增殖能力，实时荧光定量聚合酶链反应技术检测核心靶基因的表达。结果 筛选到艾迪注射液作用于卵巢癌的可能靶点共13个。这些靶点主要富集于细胞凋亡、铂耐药和白细胞介素-17等肿瘤发生、发展密切相关的信号通路。13个基因中，与卵巢癌预后相关的关键基因为细胞间紧密连接蛋白4(claudin 4,CLDN4)、分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte peptidase inhibitor, SLPI)和杆状病毒IAP重复序列包含5(Lapatinib体内baculoviral IAP repeat containing 5,BIRC5)。细胞实验发现，艾迪注射液能显著抑制卵巢癌细胞增殖，促进卵巢癌保护性靶点BIRC5的表达，并显著下降卵巢癌危险因素CLDN4和SLPI的Sulfamerazine antibiotic水平。结论 艾迪注射液可能是通过影响CLDN4、SLCH-223191配制PI、BIRC5这3个核心靶点的表达来实现多成分、多靶点、多途径的抗卵巢癌和联合化疗的增效减毒作用。

目的 探讨丙泊酚通过PI3K/AKT/mTOR信号通路对乳腺癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。方法 在体外，丙泊酚10 mg/mL分别与乳腺癌MCF-7和BT474细胞系共孵育分为对照组和丙泊酚组。PI3K过表达质粒经丙泊酚处理后转染MCF-Immune evolutionary algorithm7细胞分为对照组、丙泊酚+PI3K组、PI3K组，分别检测细胞的生存、侵袭及凋亡情况。Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平。在体内构建MCF-7小鼠模型，免疫组化和TUNEL实验用于检测乳腺癌细胞的生长和凋亡情况。结果 丙泊酚显著抑制乳腺癌细胞的生长和侵袭能力(P<0.05)。Western blot和细胞凋亡实验结果显示，丙泊酚通过降低Bcl-2和Erdafitinib体外Bcl-w在乳腺癌细胞中的表达水平来诱导细胞凋亡(P<0.05)。丙泊酚降低了乳腺癌细胞中磷酸肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B (AKT)和mTOR蛋白表达水平(P<0.05)。对P13K进行过表达处理后显示，PI3K过表达逆转了丙泊酚对MCF-7细胞的生长和侵袭的抑制作用(P<0.05)。体内实验表明，丙泊酚治疗明显抑制MCF-7小鼠模型中的肿瘤生长，促进了细胞凋亡(P<0.05)。结论 丙泊酚通过PI3K/AKT/mTOR信号通路体外抑制乳RAD001分子量腺癌细胞的生长和侵袭，促进细胞凋亡。

目的 探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组织中长链非编码RNA(lncRNA)人去泛素化酶含有卵巢肿瘤结构域的6B反义RNA 1(OTUD6B-AS1)的表达及临床意义。方法 选取2016年2月至2017年2月就诊的110例DLBCL患者作为研究对象，取手术切除的DLBCL癌组织作为研究组，另选择111例淋巴结反应性增生(RLH)患者的淋巴组织为对照组；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测组织中lncRNA OTUD6B-AS1表达水平；采用Kaplan-Meier法分析lncRNA OTUD6B-AS1表达与DLBCL患者预后的关系；采用COX回归分析影响DLBCL患者预后不良的危险因素。结果 研究组DLBCL组织中lncRNA OTUD6B-AS1表达水平明显低于对照组(P<0.05);DLBCL患者癌组织中lncRNA OTUD6B-AS1表达与美国东部肿瘤协作组评分(ECOG评分)、霍奇金淋巴瘤HL分期(Ann Arbor分期)、国际预后指数(IPI)评分密切相关(P<0.05);Kaplan-Meier分析结果显示，lncRNA OTUD6B-AS1低表达患者生存率低于lncRNA OTUD6B-AS1高表达患者(P<0.05);多因素COX分析表明，lncRNA OTUhepatobiliary cancerD6B-AS1低表达是影响DLBCL患者预后不良的危险因素(P<0.0Crizotinib化学结构5)。结论 lncRNA OTUD6B-AS1在DLBselleckCL组织中低表达，其与DLBCL的发生及患者预后密切相关。

碳点(CDBarasertib体外s)作为一类新型纳米酶,因其制备过程简便、稳定性高、易于功能化、催化活性高等特点,已被应用于生物传感、疾病诊疗、环境监测、光催化等多种领域。在CDs中掺杂金属离子能够改变CDs的电荷密度和电子转移形式,增加催化活性位点,是开发CDs纳米酶的一种有效策略。因此,本论文设计制备了两种性能优异的金属掺杂CDs纳米酶,对其催化性能进行了分析研究,将其应用于药物分析检测,并PDCD4 (programmed cell death4)探究其作为化学动力学治疗(CDT)试剂在抗肿瘤治疗方面的应用潜力。主要内容包括:第一章:对CDs纳米酶的研究及应用进行了综述。首先,概述了纳米酶的类型及合成纳米酶的材料,并重点阐述了CDs纳米酶及其掺杂原理。其次,总结了CDs纳米酶在传感、催化、抗菌和癌症治疗中的应用。最后,简要总结了本文的立题背景,研究内容以及创新点。第二章:通过一步热解法以维生素B12(VB12)和柠檬酸为前体,制备了钴掺杂碳点(Co-CDs)纳米酶。前体VB12中的钴离子作为纳米酶的活性中心,赋予Co-CDs优异的类过氧化物酶(POD)活性。Co-CDs对H_2O_2表现出较高的亲和力,可以催化H_2O_2产生三种活性氧(ROS),即羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(·O_2~-)和单线态氧(~1O_2)。因此,通过将Co-CDs与葡萄糖氧化酶(GOx)结合,开发了一种通过级联反应检测葡萄糖的灵敏比色传感器。该比色传感器在葡萄糖浓度为0.500至200μM范围内表现出良好的线性响应能力,最低检测限(LOD)为0.145μM(S/N=3),并且实现了对不同人血清样品中葡萄糖的准确检测。同时,由于其优异的催化活性,Co-CDS63845纯度s可以作为一种CDT试剂。通过细胞毒性及共聚焦细胞成像实验证明了:Co-CDs可以催化癌细胞中过量表达的H_2O_2生成高毒性ROS,从而诱导癌细胞死亡,达到了杀灭癌细胞的目的。第三章:以钼酸铵和抗坏血酸为前驱体通过一步水热法制备了钼掺杂碳点(Mo-CDs)纳米酶。由于其独特的结构特征,Mo-CDs显示出优异的类POD活性,可以通过Russell机制催化氧化H_2O_2生成~1O_2。基于Mo-CDs纳米酶产生的~1O_2可以与氨苄青霉素(AMP)发生反应,构建了一种新型的AMP比色检测方法。对AMP的线性响应范围为0.0500μg/m L至100μg/m L,LOD低至12 ng/m L(S/N=3)。此外,将比色试纸与智能手机相结合开发了智能手机辅助的比色传感平台,实现了对水中AMP的方便快速检测。同时,Mo-CDs也可以作为CDT试剂,将癌细胞中过表达的H_2O_2催化成高毒性的~1O_2,实现了靶向杀灭肿瘤细胞的目的。

目的:分析长链非编码(long non-coding RNA,lncRNA)CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平与患者临床病理特征的关系，探究CTD-2182N23.1通过靶向miR-200c-3p对甲状腺乳头状癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:采用TCGA数据库分析CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其与患者临床分期、预后的关系。收集2019年05月至2022年03月本院手术切除的50例甲状腺乳头状癌患者癌组织和癌旁组织，采用实时定量聚合酶Elexacaftor供应商链反应(qPCR)检测甲状腺乳头状癌组织中CTD-2182N23.1的表达，分析其与甲状腺乳头状癌患者临床病理特征的关系。qPCR检测人正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1和人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1、MDA-T32、TT、SW579、B-CPAP中CTD-2182N23.1的表达。体外培养MDA-T32细胞，实验分为NC组和CTD-2182N23.1组。细胞克隆形成实验和Transwell实验分别检测转染后MDA-T32细胞增殖能力和侵袭能力。双荧光素酶基因报告实验验证CTD-2182N23.1与miR-200c-3p之间的靶向关系。qPCR检测转染后MDA-T32细胞中miR-200c-3p和ATP2A2 mRNA的表达。采用TCGA数据库分析CTD-2182N23.1与psycho oncologyATP2A2 mRNA表达的相关性。Western blot法分别检测ATP2A2、CDK1、Cyclin B、Twist、Slug蛋白水平。结果:TCGA数据库显示甲状腺乳头状癌组织中CTD-2182N23.1呈低表达(P<0.01),其与患者临床分期、无病生存期均呈正相关(均P<0.05)。qPCR显示甲状腺乳头状癌组织和细胞系中CTD-2182N2Galunisertib3.1均呈低表达(均P<0.05)。CTD-2182N23.1表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移有关联(均P<0.01)。上调CTD-2182N23.1后MDA-T32细胞克隆形成数目和细胞侵袭数目均明显减少(均P<0.01)。CTD-2182N23.1能够靶向且负调控miR-200c-3p的表达(P<0.01)。上调CTD-2182N23.1后MDA-T32细胞中ATP2A2基因表达显著升高(P<0.01)。CTD-2182N23.1与ATP2A2 mRNA表达呈正相关。上调CTD-2182N23.1后MDA-T32细胞中CDK1、Cyclin B、Twist、Slug蛋白水平均显著降低(均P<0.01)。结论:CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中呈低表达，上调CTD-2182N23.1通过调控miR-200c-3p/ATP2A2表达显著抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭，CTD-2182N23.1可能是甲状腺乳头状癌治疗的潜在分子靶标。

目的:分析长链非编码(long non-coding RNA,lncRNA)CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平与患者临床病理特征的关系，探究CTD-2182N23.1通过靶向miR-200c-3p对甲状腺乳头状癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:采用TCGA数据库分析CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其与患者临床分期、预后的关系。收集2019年05月至2022年03月本院手术切除的50例甲状腺乳头状癌患者癌组织和癌旁组织，采用实时定量聚合酶Elexacaftor供应商链反应(qPCR)检测甲状腺乳头状癌组织中CTD-2182N23.1的表达，分析其与甲状腺乳头状癌患者临床病理特征的关系。qPCR检测人正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1和人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1、MDA-T32、TT、SW579、B-CPAP中CTD-2182N23.1的表达。体外培养MDA-T32细胞，实验分为NC组和CTD-2182N23.1组。细胞克隆形成实验和Transwell实验分别检测转染后MDA-T32细胞增殖能力和侵袭能力。双荧光素酶基因报告实验验证CTD-2182N23.1与miR-200c-3p之间的靶向关系。qPCR检测转染后MDA-T32细胞中miR-200c-3p和ATP2A2 mRNA的表达。采用TCGA数据库分析CTD-2182N23.1与psycho oncologyATP2A2 mRNA表达的相关性。Western blot法分别检测ATP2A2、CDK1、Cyclin B、Twist、Slug蛋白水平。结果:TCGA数据库显示甲状腺乳头状癌组织中CTD-2182N23.1呈低表达(P<0.01),其与患者临床分期、无病生存期均呈正相关(均P<0.05)。qPCR显示甲状腺乳头状癌组织和细胞系中CTD-2182N2Galunisertib3.1均呈低表达(均P<0.05)。CTD-2182N23.1表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移有关联(均P<0.01)。上调CTD-2182N23.1后MDA-T32细胞克隆形成数目和细胞侵袭数目均明显减少(均P<0.01)。CTD-2182N23.1能够靶向且负调控miR-200c-3p的表达(P<0.01)。上调CTD-2182N23.1后MDA-T32细胞中ATP2A2基因表达显著升高(P<0.01)。CTD-2182N23.1与ATP2A2 mRNA表达呈正相关。上调CTD-2182N23.1后MDA-T32细胞中CDK1、Cyclin B、Twist、Slug蛋白水平均显著降低(均P<0.01)。结论:CTD-2182N23.1在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中呈低表达，上调CTD-2182N23.1通过调控miR-200c-3p/ATP2A2表达显著抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭，CTD-2182N23.1可能是甲状腺乳头状癌治疗的潜在分子靶标。

背景和目的:根据国际糖尿病联合会(IDF)统计,约有4.63亿成年人患糖尿病,预计到2045年,全球糖尿病总人数将达到7亿~([1])。因此,进一步开发糖尿病防治靶点显得尤为重要。Ⅰ型糖尿病是由T细胞介导的胰岛β细胞破坏,导致胰岛素绝对缺乏所致的自身免疫性疾病。II型糖尿病是由遗传因素和不良代谢环境导致的进行性胰岛β细胞损伤。目前,移植供体严重短缺和免疫排斥反应等是糖尿病临床治疗面临的瓶颈问题。为了解决上述问题,人们从干细胞治疗、免疫治疗、体外生成胰岛素样细胞治疗和纳米材料治疗等多方面进行了探索,以期寻找到有效的胰岛β细胞替代方案。比如:移植大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化产生的胰岛素样细胞(insulin-producing cells,IPCs)在改善血糖和恢复残存胰岛细胞功能方面显示出一定的效果,表明移植干细胞来源IPCs对于糖尿病的治疗具有较好的应用前景。为了获得具有免疫抑制功能且稳定表达胰岛素的IPCs,克服糖尿病免疫介导的胰岛细胞破坏,人们尝试了多种免疫抑制疗法,但均未取得理想的治疗效果。而静电纺丝纤维作为纳米级支架能够有效的模拟细胞外基质环境,为细胞的粘附、生长和分化提供必要载体。课题组前期工作发现负载Zn T8_((107-115))和HLA-A2多肽二聚体的聚多巴胺改性明胶聚乳酸静电纺丝纤维复合材料(PLLA/G-p DA-p MHC)能通过释放二聚体诱导免疫耐受和促进干细胞分化,为细胞的生长构造独立的排列空间,在诱导细胞表型转换和增加细胞数量方面具有显著优势。PLLA/G-p DA-p MHC被认为可能通过调节免疫和促进干细胞分化实现双重功能。目前研究表明,糖尿病高糖(high glucose,HG)环境中IPCs细胞存活率低成为阻碍其发展的重大挑战。移植后细胞死亡可能是限制IPCs移植治疗效果的主要因素。虽然,已有实验认为IPCs移植后发生的细胞凋亡可能与IPCs治疗失败有关,但利用特异性凋亡抑制剂等措施并未见完全改善移植后的细胞死亡现象,提示可能还存在着其他形式的程序性细胞死亡。我们查阅相关文献发现一种新形式调节性细胞死亡机制,铁死亡可能是HG环境诱导胰岛β细胞死亡的主要途径之一,在糖尿病及相关并发症中发挥着重要作用。虽然,有研究发现铁死亡在糖尿病胰岛β细胞死亡过程中发挥重要调控作用,但关于铁死亡对移植后IPCs损伤的调控作用及机制却鲜有报道。鉴于铁死亡机制的复杂性,需要利用生物信息学方法更为全面的分析铁死亡相关信号通路与移植后IPCs损伤的关系。在生理水平上,细胞内可变铁池稳态在细胞代谢、增殖和死亡过程中发挥至关重要的调控作用。由于可变铁池内的铁离子催化活性不受限制,其浓度的增加所引发的氧化作用能够直接损伤DNA、蛋白质和脂质,进而导致细胞死亡。研究认为NCOA4介导的铁蛋白自噬是细胞维持可变铁池稳态的重要途径,NCOA4在细胞可变铁池浓度过低的情况下可与铁蛋白结合,并递送至自噬溶酶体降解以向胞浆释放铁离子;而当细胞中可变铁池水平过高时,NCOA4选择性的与HERC2结合被泛素化及降解,从而降低铁蛋白自噬的活性。提示从NCOA4入手有望为阐明HG环境中铁蛋白自噬介导的可变铁池失衡诱导干细胞来源IPCs的死亡机制提供新思路。综上,本研究以PLLA/G-p DA-p MHC支架为基础构建BMSCs向IPCs分化的培养体系,获得具有免疫抑制功能且稳定分泌和表达胰岛素的IPCs,进一步通过HG培养液模拟糖尿病高血糖环境,结合生物信息学分析方法,阐明HG环境诱导IPCs的损伤机制,旨在为降低干细胞来源IPCs移植后的细胞死亡率,提高IPCs细胞治疗效果提供新靶点。研究方法:1.IPCs细胞分化体系的构建(1)为了构建具有免疫耐受功能的IPCs细胞分化体系,对PLLA/G-p DA-p MHC支架进行改性和理化性质测试:FTIR测定化学组成、结构及形貌、接触角测量仪及含水量分析检测亲水性;利用ELISpot检测分化体系对CD8~+T细胞IFN-γ分泌能力的影响;CCK-8实验检测淋巴细胞增殖能力变化;LDH释放实验检测淋巴细胞对靶细胞的特异性杀伤效应。(2)为了获得具有免疫抑制功能且稳定分泌和表达胰岛素的IPCs,分离提取大鼠BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面标志分子表达;扫描电子显微镜观察BMSCs在PLLA/G-p DACrizotinib抑制剂-p MHC支架上的生长状态;以PLLA/G-p DA-p MHC支架为基础构建BMSCs向IPCs分化的培养体系,利用Western blot和q PCR实验检测IPCs细胞Pdx-1、Glut-2、Insulin、Pax-4的m RNA和INSULIN蛋白表达水平变化;ELISA法检测胰岛素分泌情况。2.HG诱导IPCs铁死亡机制的研究(1)利用生物学信息方法对GEO数据库中移植前与移植后60-120天胰岛细胞的基因表达进行对比分析;对差异表达基因进行KEGG信号通路富集分析;通过蛋白质-蛋白质相互作用及基因相关性分析铁死亡相关信号通路差异表达基因之间的相互作用关系及相关性系数,初步确定铁死亡与移植后胰岛细胞损伤的相关性。(2)为了确定铁死亡是HG环境下IPCs细胞死亡的主要途径,采用含25m M葡萄糖培养液培养IPCs,模拟体内高血糖环境;采用铁死亡抑制剂(Ferrostatin1,Fer-1)、坏死性凋亡抑制剂(Necrostatin1,Nec-1)、凋亡抑制剂(Z-VAD)对IPCs进行预处理,CCK-8方法检测细胞活力变化。(3)为了明确HG环境通过上调可变铁池浓度诱导IPCs铁死亡,采用铁离子螯合剂去铁胺(deferoxaFerrostatin-1临床试验mine,DFO)预处理IPCs;利用CCK-8法检测细胞活力变化;流式细胞术检测IPCs细胞脂质过氧化水平;流式细胞仪检测细胞内可变铁池浓度变化;q PCR和Western blot检测铁死亡标志分子GPX4和XCT的m RNA水平和蛋白水平变化;MDA检测试剂盒检测细胞MDA水平变化。(4)为了阐明HG环境通过上调细胞铁蛋白自噬水平提高IPCs可变铁池浓度,采用自噬抑制剂(chloroquine,CQ)预处理IPCs,流式细胞仪检测细胞内可变铁池浓度变化;Western blot检测铁死亡和自噬标志分子LC3、p62、TFRC和Ferritin的蛋白表达水平变化;MDA检测试剂盒检测细胞内MDA水平变化。(5)为了进一步明确HG环境通过NCOA4介导的铁蛋白自噬提高可变铁池浓度,采用sh RNA和过表达质粒在IPCs中敲低NCOA4和过表达NCOA4,Western blot检测NCOA4的敲低和过表达效率,以及在HG环境下敲低和过表达NCOA4对Ferritin蛋白表达的影响;通过流式细胞仪检测可变铁池浓度变化和脂质过氧化水平变化。(6)为了确定HG环境下NCOA4对IPCs胰岛素合成和分泌的影响,在敲低和过表达NCOA4的前提下,Western blot检测HG环境下胰岛素蛋白表达水平,并通过ELISA法检测培养上清中胰岛素分泌水平变化。实验结果:1.FTIR结果显示Zn T8_((107-115))/HLA-A2多肽二聚体被负载于PLLA/G-p DA支架,表明PLLA/G-p DA-p MHC构建成功,且具有更高效的亲水性。免疫学检测发现PLLA/G-p DA-p MHC支架能够显著抑制CD8~+T细胞IFN-γ的分泌、淋巴细胞增殖以及淋巴细胞对靶细胞的杀伤效应。表明成功构建具有免疫抑制功能的PLLA/G-p DA-p MHC支架材料。2.流式细胞检测显示分离培养的BMSCs中CD29、CD44、CD90和CD105表达阳性,而CD34和CD45表达阴性,表明分离纯化BMSCs具有正常的表面特异性标记;扫描电子显微镜观察和CCK-8活力分析发现PLLA/G-p DA-p MHC支架具有更好的生物相容性;q PCR结果显示PLLA/G-p DA-p MHC支架构建的分化体系能够促进IPCs中Pax-4、Pdx-1、Glut-2和Insulin m RNA表达,同时促进INSULIN蛋白表达;与对照组IPCs比较,PLLA/G-p DA-p MHC支架能够更显著的促进IPCs分泌胰岛素。表明PLLA/G-p DA-p MHC支架能够更有效的促进BMSCs向IPCs分化。3.KEGG信号通路富集分析发现移植前后胰岛细胞差异表达基因主要富集在铁死亡、谷胱甘肽代谢、自噬等信号通路;PPI和相关性分析发现上述通路差异表达基因存在显著的相互作用及相关性,尤其NCOA4与自噬相关基因Atg7、Ulk2、gd、Nfe2l2等具有显著的相关性。初步表明铁死亡可能在移植后胰岛细胞损伤过程中发挥重要的调控作用。4.流式细胞术检测发现,HG处理的IPCs细胞内可变铁池浓度和脂质过氧化水平呈时间依赖性显著增加;q PCR和Western blot结果表明HG处理后的IPCs细胞铁死亡标志分子GPX4和XCT在转录和蛋白水平表达均下调;细胞内MDA水平显著升高;铁离子螯合剂(DFO)能够显著逆转上述现象;与其他处理组比较,铁死亡抑制剂(Fer-1)预处理能够有效降低HG环境对IPCs的损伤作用。进一步明确铁死亡是HG环境诱导IPCs损伤的主要途径。5.Western blot结果显示HG处理后IPCs内TFRC和p62的蛋白表达水平呈时间依赖性降低,而Ferritin和LC3蛋白表达水平呈时间依赖性升高;自噬抑制剂氯喹(CQ)能够逆转HG介导的TFRC蛋白表达下调和Ferritin蛋白表达的上调;流式细胞仪检测结果和MDA检测结果发现CQ能够逆转HG诱导的可变铁池浓度和MDA水平的升高。表明HG处理是通过激活铁蛋白自噬诱导IPCs铁死亡。6.Western blot结果显示HG处理后NCOA4蛋白表达水平显著升高,敲低或过表达NCOA4能够抑制或促进HG介导的Ferritin蛋白降解;同时,敲低NCOA4增强HG诱导的脂质过氧化水平升高。medication delivery through acupoints表明NCOA4是HG环境下调控IPCs铁蛋白自噬的关键分子。7.Western blot和ELISA检测结果显示敲低NCOA4能够逆转HG环境介导的胰岛素合成和分泌的降低,而过表达NCOA4加重胰岛素合成和分泌的降低;同时,抑制铁死亡能够恢复IPCs胰岛素的分泌;q PCR检测发现敲低NCOA4或过表达NCOA4能够抑制或促进HG诱导的Pdx-1 m RNA水平的降低。表明NCOA4通过调控铁蛋白自噬影响HG环境下IPCs的成熟。结论:1.利用PLLA/G-p DA-p MHC支架促进了BMSCs分化成为具有免疫抑制功能且稳定表达和分泌胰岛素的IPCs。2.铁死亡是调控HG环境中IPCs细胞存活率下降的主要途径。3.NCOA4介导的铁蛋白自噬参与调控了HG环境诱导的IPCs铁死亡过程。4.抑制NCOA4通路有望成为预防IPCs细胞损伤、防治糖尿病的重要靶点。