Achr receptor

肿瘤目前是居高不下的一种严重疾病,威胁着人类的健康和生命。肿瘤由多种因素引起导致,使用单一药物治疗往往会导致产生耐药性,难以完全控制病情。药物联合治疗能有效降低癌症治疗耐药性问题,可以同时针对多个靶点,发挥协同作用,提高治疗效果,延长患者生存期。随着高通量筛选方法的发展,研究人员可以通过体外实验发现协同组合,但这样大规模的进行药物组合实验筛选需要耗费大量时间和成本,因此迫切需要一种更高效的方法来筛选药物组合。本文以抗肿瘤药物组合为研究对象,考虑药物组合之间存在相互作用关系,以及细胞系本身特征,并考虑蛋白质与蛋白质相互关联的特征,提出了基于多路相互作用的协同抗肿瘤药物组合预测研究模型,实现更高效、更精准的抗肿瘤药物组合预测。本文首先整理收集了药物组合数据、细胞系的基因表达数据、拷贝数数据和突变数据、药物的SMILES表达数据、蛋白质与蛋白质相互作用网络关联数据组成输入数据集,使用Tsne算法将收集得到的药物SMILES摩根指纹数据和细胞系基因表达数据、突变数据、拷贝数数据进行降维处理;再利用自适应的GCN对降维后的数据进行特征提取;然后结invasive fungal infection合构建的药物与癌症细胞系的PPI网络关系图,提取蛋白质模块拓扑关系,得到药物组合作用机制与蛋白质拓扑结构的关联特征信息,以此构建了基于多路相互作用的协同抗肿瘤药物组合预测模型。另外在基于多selleck Tamoxifen路相互作用的基础上,进一步考虑药物组合在不同浓度下的协同作用反应,通过GCN模块对药物SMILES构建的分子图进行特征提取得到药物特征;再利用Deep FM对细胞系基因表达、细胞系基因表达稀疏矩阵、药物浓度、药物浓度稀疏矩BI 10773阵进行特征提取;然后结合struc2vec模块对PPI网络提取的蛋白质关联特征,组成特征数据集,通过全连接层预测得到最终的百分比增长数,构建基于药物浓度的多路相互作用协同抗肿瘤药物组合预测模型。最后通过对多西他赛与伊马替尼治疗前列腺癌细胞(PC3)、培美曲塞与吉非替尼联合治疗非小细胞肺细胞(NCI-H522)以及培美曲塞与克唑替尼联合治疗非小细胞肺癌(NCI-H322M)进行验证分析;另对药物联合治疗非小细胞肺细胞(NCI-H322M)的648种组合进行预测,对比实验结果验证了所提预测模型能够更高效,更精准的筛选药物组合,具有一定的理论和实际意义。

目的:通过观察富血小板血浆凝胶治疗大鼠深Ⅱ度烧伤创面效果及其对烧伤创面炎症控制及巨噬细胞表型的影响,初步讨论其促进烧伤创面愈合的相关机制。方法:SD大鼠30只,雄性,6-8周龄,约180—220g,SPF级。其中12只用于制作富血小板血浆凝胶,另外18只建立深Ⅱ度烧伤模型,随机分为实验组和对照组(每组9只)。实验组创面涂抹富血小板血浆凝胶治疗,隔日给药1次。对照组给予等量生理盐水涂抹后,凡士林纱布覆盖。分别于第3、7、14天观察创面愈合情况,测量各组创面愈合率,HE染色观察创面炎症细胞浸润情况,Masson染色法观察创面胶原沉积情况,免疫组化方法观察M1、M2型巨噬细胞表型标记物诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、CD206阳性细胞数目,荧Belnacasan浓度光定量PCR(q PCR)检测创面组织中炎症因子TNF-α及抗炎因子IL10、TGF-β1 m RNA的相对表达量。结果:1.两组大鼠的创面愈合率均随着观察时间延长而升高,在第3、7、14天实验组愈合率高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.HE染色显示,第3、7、14天实验组炎症细胞数目显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Masson染色显示,随着时间点,两组胶原纤维沉积逐渐增多。治疗后3天对照组胶原少,分布稀疏,实验组胶原粗大,排列错乱。治疗后7天,各组胶原蛋白纤维仍排列紊乱,实验组胶原量比对照组多。治疗后14天,对照组胶原排列杂乱,纤维断裂。实验组大部排列有序,少量排列杂乱。4.免疫组织学显示,治疗后第3、7、14天,两组,实验组i NOS标记的M1型巨噬细胞数目显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。相反,实验组CD206标记的M2型巨噬细胞数目显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.q PCR显示,治疗后第3、7、14天,实验组TNF-αm Captisol抑制剂RNA相对表达量显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。IL10 m RNA相对表达量则高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组TGF-β1 m RNA相对表达量除在第3天显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。在第7天,14天低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.富血小板血浆凝胶能够抑制大鼠深Ⅱ度烧伤创面炎症因子TNF-α的表达,提高抗炎因子IL10、TGF-β1的表达,减轻创面炎症反应并促进胶原合成,具有显著的促愈合作用;2.富血小板血浆凝胶可能通过促进创面巨噬细胞表型由M1表型向M2表型转Immune magnetic sphere化进而促进创面愈合。

宫颈癌是全球范围内威胁女性健康的重大疾病之一,特别是在欠发达地区有较多的新发病例和死亡病例,给社会和家庭带来了严重危害。作为世界卫生组织建议开展筛查的重大疾病,大范围的早期筛查可大幅降低宫颈癌的发病率和死亡率,并且早期发现对宫颈癌治疗具有重大意义。临床宫颈癌早期筛查方法主要包括HPV检测和细胞学检测,存在一定的局限性,比如细胞学检查高度依赖病理医师的经验判断,HPV检测特异性较低。二维(2D)光散射技术可以反应细胞内部结构和成分的变化,是一种简便、快速、免标记的非侵入单细胞分析方法。近年来,以深度学习为主的人工智能技术在医学图像的分析应用中取得了显著效果。多模态信息的整合应用也成为医学决策分析中的热点。以2D光散射技术为基础,拓展多模态成像方法,融合深度学习技术,预期可以为宫颈癌无标记智能检测分析提供新的方法与思路。本文旨在探究基于2D光散射的深度学习和多模态成像技术在宫颈细胞分析中的应用。论文主要围绕2D光散射技术对宫颈细胞的无标记检测,selleck产品将2D光散射单细胞检测技术与深度学习、特征工程、多模态、可解释性人工智能技术genetic mutation结合,实现了对宫颈细胞的无标记快速检测分析,具有自动、简便、非侵入性的优点。本文的主要研究内容和创新点归纳如下:(1)探究了深度学习与静态单细胞2D光散射实验装置的集成系统及其宫颈细胞分析应用。首先设计了用于单个宫颈细胞分析的光散射图样特定深度卷积网络作为特征提取器,与2D光散射细胞术集成,并结合机器学习分类器对不同类型的宫颈单细胞进行无标记分类。该系统实现了无标记的宫颈癌细胞和正常细胞的分类、两种宫颈癌细胞系亚型的分类,以及宫颈细胞的三分类工作,获得了较高的准确率。最后对比了深度学习提取的特征与传统特征描述符提取的特征,可视化地展示了深度网络特征更好的聚类趋势,说明了自动提取的深度特征在分类任务中的优越性。(2)探究了多模态图像的对比分析和宫颈癌前细胞的无标记检测。在前期工作的基础上,进一步开发单细胞检测装置,使得该系统可以逐步获取宫颈癌前细胞H8和宫颈癌细胞HeLa的明场图像、荧光图像和2D光散射图样,并采用多种特征提取方法对多模态数据进行对比分析和无标记检测。对明场图像和荧光图像,提取形态特征和纹理特征,使用统计学方法进行分析和机器学习方法进行分类,证明了线粒体作为细胞内生物检测指标用于宫颈癌细胞分类的潜力。对于无标记2D光散射图样,使用深度学习网络从中提取深度特征进行更具挑战性的宫颈癌前细胞分类,展示深度学习提取的特征具有更优越的分类效果,并且结果更自动化、更具稳定性,为实现自动化宫颈细胞检测带来希望。最后,探讨了深度学习网络参数对分类结果的影响,帮助研究人员更好地研究深度学习网络结构优化和宫颈细胞数据集的问题。(3)探究了无标记双模态图像的融合与解释及其宫颈细胞分析应用。设计并报告了一个双模态多种特征融合的网络,对不同类型的单个宫颈细胞进行无标记分类并提供解释性的分析。首先将这种双模态融合的单细胞检测网络应用于C-33A、CaSki和正常宫颈细胞的三分类,将细胞的暗场图像和2D光散射图像模态特征融合,得到双模态的分类结果,并与单模态结果比较。接着,将其应用于更高挑战的宫颈癌前细胞H8和宫颈癌细胞HeLa分类,将细胞的明场图像和2D光散射图像模态特征融合,提D-Lin-MC3-DMA临床试验升了分类结果;同时,使用相关工具对双模态特征进行可解释性分析,展现了双模态图像中纹理特征的关注点,并对深度特征的提取提供指导分析,为细胞光散射机制研究提供帮助,促进对宫颈癌相关机制和疾病的进一步理解和研究。

目的:本课题运用自拟桑枇芷翘方外用联合羟氯喹口服治疗热毒蕴肤型酒渣鼻,观察治疗前后患者的症状改善程度及不良反应情况来评价其临床疗效和安全性,并在皮肤镜下观察酒渣鼻患者治疗前后皮损改变的情况,从而为中西医结合治疗酒渣鼻提供更多选择。方法:将纳入本课题研究的70例热毒蕴肤型酒渣鼻患者按照随机原则分为治疗组和对照组,每组各35例。治疗组给予自拟桑枇芷翘方外用联合羟氯喹、甲硝唑凝胶治疗,对照组给予羟氯喹、甲硝唑凝胶治疗。分别在治疗前、治疗4周末、治疗8周末记录三组患者的主观症状、客观皮损总评分、中医症候评分、生活质量评分及皮肤镜下皮损评分,将数据经统计学处理后进行分析。结果:(1)治疗结束后,两组患者的主观症状,客观皮损、中医证候均较前改善,患者的生活质量均有所提高;治疗组主观症状,客观皮损的评分及总评分、中医证候评分值、生活质量评分均低于对照组,疗效优于对照组(P<0.05);总有效率治INCB018424体内实验剂量疗组为88.6%,对照组为62.9%,治疗组的总体疗效优于对照组(P<0.05)。(2)皮肤镜下皮损评分比较:酒渣鼻患者皮肤镜下背景主要以深红色为主,血管形态主要以线状和线状分枝状多见,血管分布主要以簇状分布和网状分布为主,非血管结构以丘疹脓疱、毛囊角栓、鳞屑多见。治疗组和对照组患者治疗4周、8周后深红色和红色背景减少,有统计学意义(P<0.05),淡红色背景增加,有统计学意义(P<0.05),提示背景颜色明显变浅。治疗BI 10773分子量前后血管形态和分布无明显改变,无统计学意义(P>0.05),而非血管结构治疗后明显减少,有统计学意义(P<0.05)。结论:自拟桑枇芷翘方外用联合羟氯喹治疗热毒蕴肤型酒渣鼻的临床疗效确切,能有效改善患者主观症状、客观皮损,中医症候及生活质量,且安全性较高,值得临床推广应用。通过皮肤镜观察Dermal punch biopsy酒渣鼻患者皮损的改善情况,可为评价临床疗效提供客观参考依据。

上皮间质转化指上皮到间质细胞的转化。它赋予细胞转移和入侵的能力，包括减少凋亡与衰老，促进免疫抑制，不仅在发育过程中起着关键的作用，而且还参与组织愈合、器官纤维化和癌症发生等过程。它同样也是胃癌发生侵袭转移的重要环节，是导致胃癌患者死亡的关键因素之一。上皮间质转化的发生与相关信号通路的激活关系密切。越来越多的证据表明中医药对癌症转移相关信号通路具有明显的抑制作用，中医药调控转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)/Smad通路，多通过抑制TGF-β、TGF-β受体（TGF-βRcysteine biosynthesis）及下游蛋白的表达来进行。目前的研究显示中医药调控胃癌上皮间质转化的机制局限于磷脂酰肌醇NN2211使用方法3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）-丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt Serine/Threonine Kinase,Akt)、TGF-β/Smad等经典通路，新的干预信号、具体的分子机制尚不明确，无法推进中医药在临床中的广泛应用。文章对近年来中医药调控胃癌上皮间质转化相关信号通路（包括EMT与TGF-β/Smad通路，Wselleckchem Adezmapimodnt/β-catenin通路，上皮间质转化与PI3K/Akt通路，长链非编码RNA相关信号通路等相关通路）的研究进行综述，并分析中医药调控胃癌上皮间质转化相关信号通路的用药规律，为下一步揭示中医药抗肿瘤的机制提供新思路。

目的：分析协同护理模式在淋巴瘤患者护理中的应用效果。方法：选取2020年1月—2022年12月张家港市第一人民医院收治的淋巴瘤患者70例作为研究对象，采用随机数字表法分为对照组和观察组，各35例。对照组采用常规护理模式，观察组采用协同护理模式。比较两组患者负性情绪、生存质量、护理满意度。结果：护理前，两组焦虑自评量CB-839 IC50表(SAS)、抑郁自评量表(SDS)评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)；护理后，两组SAS、SDS评分低于护理前，且观察组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。护理前，两组生理、心理、社会关系、环境评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)；护理后，两组生理、心理、社会关系、环境评分高于护理前，且观察组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组护理总满Adezmapimod小鼠意度高于对照组，差异有统计学意义(P=0.006)。结论：协同护理模式在淋巴瘤患者护理中的应用效果显著，可缓解患者负性情绪，改善生活质biomemristic behavior量，提高护理满意度。

目的:慢性髓性白血病(CML)是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤,以髓系过度增殖以及Ph染色体和(或)BCR/ABL融合基因阳性为特征。BCR/ABL基因编码一种持续活化的BCR/ABL P210融合蛋白,该蛋白具有活化的酪氨酸激酶活性,改变了中性粒细胞增殖、凋亡和迁移特征,是慢性髓性白血病发生的中心环节。酪氨酸激酶抑制剂可以在细胞水平上抑制BCR/ABL酪氨酸激酶,选择性抑制BCR/ABL 阳性细胞的增殖和诱导其凋亡,从而彻底改变了慢性髓性白血病治疗的现状。但是依然有部分患者因为疗效不佳或者疾病进展而需要进行治疗调整。干扰素α在酪氨酸激酶抑制剂诞生前曾经是造血干细胞移植以外的最佳选择。干扰素α可以调节基因表达,但具体机制尚不明确。在一些临床研究中干扰素联合酪氨酸激酶抑制剂可以使更多患者实现无治疗缓解。在真实世界的经验中,酪氨酸激酶耐药的患者联合干扰素治疗,具有一定逆转耐药的作用。PI3K/AKT信号通路是最常见的调控肿瘤生长的信号通路之一,受到多种受体的激活,其抑制剂已被证明对多种肿瘤有效。BCR/ABL蛋白可上调多种下游信号通路,其中活性最高的通路是PI3K/AKT。PI3K根据组织分布可分为3种类型,其中| A亚型可被BCR/ABL蛋白激活,进而活化AKT。在酪氨酸激酶抑制剂耐药的患者中,PI3K/AKT通路成为新的靶点。早期研究发现,干扰素α和β可通过结合干扰素受体,调节下游PI3K/AKT通路活性,从而影响细胞增殖。本课题拟证实干扰素可通过调节PI3K表达水平,逆转慢性髓性白血病细胞对TKI类药物的耐药GSK J4现象,并且进一步在体内与体外探索干扰素对于PI3K/AKT信号通路的调控作用。方法:首先,使用伊马替尼溶液缓慢诱导K562耐药细胞株(K562R),并通过CCK-8试剂盒检测K562细胞对于伊马替尼的IC50值。接着,利用伊马替尼、干扰素以及伊马替尼+干扰素分别处理K562R细胞后,利用Realtime PCR实验检测各组细胞的PI3K、AKT和BCR-ABL mRNA相对水平,利用Western Blot购买Pidnarulex实验检测各组细胞的PI3K、AKT和BCR-ABL蛋白表达水平,利用CCK-8实验检测各组细胞的增殖活力,利用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。然后,通过尾静脉注射K562R建立小鼠慢性髓性白血病耐药模型,比较各组小鼠的生存期以及脾大情况,并采用HE染色法观察各组小鼠脾脏白血病细胞浸润情况,采用免疫组化染色法比较各组小鼠脾脏目标分子的表达情况。再利用shRNA敲降K562R细胞的PI3K水平,利用Realtime PCR实验检测各组细胞的PI3K、AKT和BCR-ABL mRNA相对水平,利用Western Blot法检测各组细胞的BCR-ABL、PI3K、AKT蛋白表达水平,利用CCK-8实验检测各组细胞的增殖活力,利用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。最后,利用慢病毒过表达K562R细胞的PI3K水平,利用Realtime PCR实验检测各组细胞的PI3K、AKT和BCR-ABL相对水平,利用Western Blot实验检测各组细胞的BCR-ABL、PI3K、AKT蛋白表达水平,利用CCK-8实验检测各组细胞的增殖活力,利用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。共同验证干扰素通过抑制PI3K/AKT信号通路逆转慢性髓性白血病对伊马替尼的耐药作用。结果:成功通过伊马替尼溶液诱导出K562耐药细胞株K562R,利用CCK-8实验检测其对伊马替尼的IC50值为221.82nM。相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组BCR-ABL相对mRNA水平明显降低,干扰素组BCR-ABL相对mRNA水平降低,伊马替尼组BCR-ABL相对mRNA水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组PI3K相对mRNA水平明显降低,干扰素组PI3K相对mRNA水平降低,伊马替尼组PI3K相对mRNA水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组AKT相对mRNA水平明显降低,干扰素组AKT相对mRNA水平降低,伊马替尼组AKT相对mRNA水平无统计学差异。相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组BCR-ABL蛋白表达水平明显降低,干扰素组BCR-ABL蛋白表达水平降低,伊马替尼组BCR-ABL蛋白表达水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组PI3K蛋白表达水平相明显降低,干扰素组PI3K蛋白表达水平降低,伊马替尼组PI3K蛋白表达水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组AKT蛋白表达水平明显降低,干扰素组AKT蛋白表达水平降低,伊马替尼组AKT蛋白表达水平无统计学差异。相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组K562R细胞增殖能力明显降低,干扰素组K562R细胞增殖能力降低,伊马替组K562R细胞增殖能力无统计学差异。相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组K562R细胞凋亡率明显上升,干扰素组K562R细胞凋亡率上升,伊马替尼组K562R细胞凋亡率无统计学差异。相较于NC组,伊马替尼+干扰素组小鼠生存期显著延长,干扰素组小鼠生存期有所延长,而伊马替尼组小鼠生存期无明显统计学差异。相较于NC组,伊马替尼+干扰素组小鼠脾脏大小和重量显著下降,干扰素组小鼠脾脏大小及重量有所下降,而伊马替尼组小鼠脾脏大小及重量无明显统计学差异。HE染色结果显示:相较于NC组,伊马替尼+干扰素组小鼠脾脏白血病细胞数显著减少,干扰素组小鼠脾脏白血病细胞数减少,而伊马替尼组小鼠脾脏白血病细胞数显著减少无明显统计学差异。免疫组化染色结果显示:相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组BCR-ABL蛋白表达水平明显降低,干扰素组BCR-ABL蛋白表达水平降低,伊马替尼组BCR-ABL蛋白表达水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组PI3K分子表达水平相明显降低,干扰素组PI3K分子表达水平降低,伊马替尼组PI3K分子表达水平无统计学差异;相较于NC组,伊马替尼联合干扰素组AKT分子表达水平明显降低,干扰素组AKT分子表达水平降低,伊马替尼组AKT分子表达水平无统计学差异。再利用shRNA敲降K562R细胞的PI3K水平。相较于shNC组,shPI3K组PI3K、AKT和BCR-ABL相对mRNA水平明显降低。相较于shNC组,shPI3K组PI3K、AKT和BCR-ABL蛋白表达水平明显降低。相较于shNC组,shPI3K组K562R细胞的增殖活力显著降低。相较于shNC组,shPI3K组K562R细胞的凋亡率显著升高。最后利用慢病毒过表达K562R细胞的PI3K水平。相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的PI3K mRNA相对水平明显升高,Vector+干扰素组的PI3K mRNA相对水平明显降低,而PI3K+干扰素组的PI3K mRNA相对水平无明显统计学差异;相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的AKT mRNA相对水平明显升高,Vector+干扰素组的AKT mRNA相对水平明显降低,而PI3K+干扰素组的AKT mRNA相对水平无明显统计学差异;相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的BCR-ABL mRNA相对水平明显升高,Vector+干扰素组的BCR-ABL mRNA相对水平明显降低,而PI3K+干扰素组的BCR-ABL mRNA相对水平无明显统计学差异。相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的PI3K蛋白表达水平明显升高,Vector+干扰素组的PI3K蛋白表达水平明显降低,而PI3K+干扰素组的PI3K蛋白表达水平无明显统计学差异;相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的AKT蛋白表达水平明显升高,Vector+干扰素组的AKT蛋白表达水平明显降低,而PI3K+干扰素组的AKT蛋白表达水平无明显统计学差异;相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的hepatic macrophagesBCR-ABL蛋白表达水平明显升高,Vector+干扰素组的BCR-ABL蛋白表达水平明显降低,而PI3K+干扰素组的BCR-ABL蛋白表达水平无明显统计学差异。相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的细胞增殖活力明显升高,Vector+干扰素组的细胞增殖活力明显降低,而PI3K+干扰素组的细胞增殖活力无明显统计学差异。相较于Vector+生理盐水组,PI3K+生理盐水组的细胞凋亡率明显降低,Vector+干扰素组的细胞凋亡率明显升高,而PI3K+干扰素组的细胞凋亡率无明显统计学差异。结论:干扰素能够通过抑制PI3K/AKT信号通路以逆转伊马替尼对慢性髓性白血病的耐药作用。

癌症已成为高发病率和死亡率最高的疾病之一并时刻威胁着人类的生命健康。盐酸阿霉素(DOX)作为一种常用的广谱抗癌药物,其较佳的治疗效果在生物医药领域备受关注并已应用于临床。但又因其严重的心肌毒性和药物利用率低及缺乏选择性等问题而受到了限制。因此需要设计一种能够降低其对正常组织的毒副作用和协同其抗癌作用的治疗新体系。基于此,本课题以具有细胞毒性的中空纳米氧化铈(HCNPs)为药物载体,DOX作为模型药物,然后以具有肿瘤微环境(TME)响应性的聚丙烯酸(PAA)和叶酸修饰的牛血清白蛋白(BF)作为包封层构建了一种具有双重刺激响应性释药和靶向递送的多功能纳米载药系统。本课题所进行的研究内容如下:1、首先制备具有细胞毒性的HCNPs-NH_2纳米粒作为载药主体,以静电交联作用在纳米粒表面形成一层pH响应性的聚丙烯酸包封层,然后合成叶酸(FA)修饰的牛血清白蛋白,最后再通过酰胺反将谷胱甘肽(GSH)响应性的牛血清白蛋白连接在聚丙烯酸表面,从而制备出具有靶向双重刺激响应性的HCNPs-PAA-BF纳米载药系统。通过激光粒度及Zeta电位分析仪、透射电子显微镜、比表面及孔隙度分析仪、X射线粉末衍射仪、傅立叶变换红外光谱、紫外分光光度计、差热热重同步分析仪等对纳米颗粒的结构进行了表征。结果表明:所制备的HCNPs-PAA-BF纳米粒分散均匀,粒径均一,形貌类球形并具有良好的稳定分散性和明显的中空介孔结构。通过氮气吸附/脱附曲线算出HCNPs的表面积(SBET)为209.34 m~2/g,平均孔径(DBJH)为6.04 nm。通过X射线粉末衍射图确认了HCNPs的典型面心立方晶型结构,而PAA和BF的修饰没有造成二氧化铈单位晶胞的改变,仍保持了其原有的晶型,在衍射峰位面(111)前出现的宽峰是非晶型BSA的特征衍射峰,与红外光谱图和紫外光谱图及TGA曲线图相互验证了HCNPs-PAA-BF的成功制备。2、通过建立的高效液相色谱法对DOX的含量进行测定,并进行了方法学验证。对DOX的负载和药物在不同介质下的释放机理进行了研究。结果表明:建立的DOX含量测定方法专属性强,具有很好的精密度和重复性,建立的标准曲线具有很好的线性关系。而在药物负载时通过DOX与载体不同的质量比筛选出最佳配比,最终制备的载DOX纳米粒(DOX@HCNPs-PAA-BF)的载药量和包封率分别为32.2%、75.1%。体外释放实验表明DOX的释放量随释放介质pH值的降低而增加,并且累计释放曲线呈先快速释放后缓慢释放的趋势,DOX在含有5 m M GSH的pH 5.0 PBS缓冲液中的释放速度最快,在释放72 h后累MLN8237计释放量达到了76.23%;而在pH 7.4 PBS缓冲液中DOX几乎无释放,但在加入5 m M GSH后,DOX在72 h后累计释放量达到了43.57%。体外释放实验结果表明:所制备的DOX@HCNPs-PAA-BF具有pH和GSH双重敏感释药的特性,并且药物在释放过程中具有先快速释药后缓慢持久释药的特性。DOX@HCNPs纳米粒经PAA和BF修饰后,避免了DOX在体内到达靶细胞前过早泄露,而到达高浓度GSH和低pH的肿瘤细胞微环境下HCNPs表面的PAA和BF包裹层发生裂解,暴露出具有细胞毒性的二氧化铈纳米粒并释放出DOX,从而避免损伤正常细胞并实现氧化铈纳米载体与抗肿瘤药物协同抗癌的目的。3、通过溶血性实验对所制备的DOX@HCNPs-PAA-BF进行体外安全性评价,采用MTT法、倒置荧光显微镜和流式细胞仪验证了DOX@HCNPs-PAA-BF的细胞毒性和其在不同时间下的胞内分布及其主动靶向性。溶血性实验结果证明了DOX@HCNPs-PAA-BF具有良好的生物相容性和安全性。MTT实验结果表明HCNPs-PAA-BF在15μg/m L～250μg/m L下对正常肝细胞(HL-7702)没有毒性,而对肝癌细胞(HepG2)和乳腺癌细胞(MDA-MB-231)具有细胞毒性作用,在48 h内存活率均低于80%。说明HCNPs-PAA-BF纳米粒生物相容性好且能协同抗癌。游离DOX和DOX@HCNPs-PAA-BF的MTT实验结果表明:制备的DOX@HCNPs-PAA-BF对肿瘤细胞有明显的杀伤作用且随着时间的延长,对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于游离DOX。采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪相互验证了DOX@HCNPs-PAA-BF的主动靶向性,通过竞争抑制实验发现提前用FA预孵育后,MDA-MB-231细胞的摄取量明显减少,荧光强度减弱。证实了DOX@HCNPs-PAA-BF是通过FA受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞内的,具有特异性靶向肿瘤细胞递送药物的能力。4、以乳腺癌MDA-MB-231为细胞模型,通过倒置荧光显微镜观测细胞的摄取行为并结合高效液相色谱法对细胞的摄取和消除过程进行定量分析。结果表明,在细胞摄取过程中培养4 h后DOX已全部进入到了细胞核中,且随着时间延长,细胞内荧光强度不在增强;而在细胞消除实验中替换含药培养液10 h后观察到DOX@HCNPs-PAA-BF的消除速率明显慢于游离DOX,能够在细胞内长时间的滞留。以高效液相色谱法测定细胞内DOX的含量并进行细胞动力学研究。按照药物动力学单室模型和统计矩计算,结果表明DOX@HCNPs和DOX@HCNPs-PAA-BF相对于DOX来说药动学参数均得到了改善。通过比较,DOX@HCNPs-PAA-BF的Ke从游离DOX的1.25 h~(-1)减小到了0.195h~(-1),t_(1/2)从0.5selleckchem55 h延长到了3.557 h,MRT从2.646 h增加至4.506 h。结果证明了HCNPs-PAA-BF负载DOX能够很好的延长药物在细胞内的滞留时间改善药物细胞动力学行为从细胞水平上快速预测和评价药物的治疗作用,从而达到良好的协同抗癌效果。5、通过细胞对药物摄取机制的定量研究,以不同时间、不同给药浓度、不同温度和载体饱和及不同内吞抑制剂对DOX@HCNPs-PAA-BF纳米粒进入细胞的途径进行研究。结果表明:细胞对游离DOX和DOX@HCNPs-PAA-BF在不同时间、不同给药浓度下的摄取量在一定范围内具有依赖性,但在细胞摄取饱和后细胞内药物量便不在增加,表明细胞的容积是有限的。而在低温条件下细胞摄取药物量相较于正常温度下细胞摄取量明显受到抑制,证明细胞摄取具有能量依赖性。内吞抑制剂实验表明DOX@HCNPs-PAA-BF是通过clathrin介导和caveolae介导的内吞和笼形蛋白有被小窝及胞膜窖介导转运进入细胞中的,而DOX主要是依靠能量转运进入细胞的。这表明了HCNPs-PAA-BF能够改变DOX的入胞途径,从而改善其药动参数更好的发挥药理效用。综上所述,本课题所制备的DOX@HCNPs-PAA-BF纳米粒具有肿瘤微环境pH和GSH双重响应释药和靶向递送药物的能力,且安全性良好,在协同抗癌提高疗效的同时还可以降低对正常组织的毒副作用。此外,对细胞药物动Pathology clinical力学行为进行了研究,为从细胞水平上快速预测和评价药物的疗效和为肿瘤治疗方面开辟了新的思路。

目的:基于肺巨噬细胞对肺上皮细胞源外泌体的应答效应探讨麻杏石甘汤抗A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)的作用机制。方法:(1)流感病毒诱导肺上皮细胞损伤模型的建立:通过IAV诱导小鼠肺上皮细胞(Mouse lung epithelial cells,MLE-12),CCK8法检测不同干预时间的细胞活性,明确IAV诱导细胞损伤的最佳条件。其次通过流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)法检测炎症细胞因子的表达水平。(2)流感病毒诱导的肺上皮细胞源外泌体(Exsomes,Exo)对巨噬细胞的损伤机制:通过超高速离心法提取MLE-12细胞源外泌体,采用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)、Western blot进行鉴定;其次构建MLE-12细胞源外泌体与巨噬细胞共培养体系并检测巨噬细胞的应答效应;然后采用高通量测序表征流感病毒诱导的MLE-12细胞源外泌体特异性miRNA及预测靶基因和信号通路GPCR & G Protein抑制剂;最后筛选出来的miR-1249-5p进行验证,以及通过对巨噬细胞转染miR-1249-5p,检测其靶基因和相关信号通路的表达情况。(3)麻杏石甘汤通过调节miR-1249-5p抑制流感病毒诱导的级联细胞损伤作用:首先采用CCK8法检测麻杏石甘汤含药血清的安全剂量和对流感病毒刺激MLE-12细胞的治疗剂量;其次,以IAV诱导的MLE-12细胞损伤模型为干预对象,实验分空白对照组、模型组、麻杏石甘汤含药血清低、高剂量组以及奥司他韦组,给予相应干预方式8 h后收集上清,提取外泌体,NTA检测各组外泌体的粒径分布和浓度,qRT-PCR法检测各组外泌体中miR-1249-5p表达水平;最后,将上述各组外泌体与巨噬细胞共培养,qRT-PCR法检测巨噬细胞中miR-1249-5p表达水平,qRT-PCR和Western blot法检测巨噬细胞中溶质携带家族4成员1(Solute Carrier Family 4 Member 1,SLC4A1)靶点和核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路的基因及重要功能蛋白的表达。结果:(1)构建稳定的流感病毒诱导肺上皮细胞损伤模型:根据CCK8结果显示IAV干预8h的细胞活性最符合本研究需要,以此条件干预MLE-12细胞,流式细胞术检测其凋亡率明显升高;qRT-PCR和Western blot检测流感病毒核蛋白(Nuclear Protein,NP)和肿瘤坏死因子-α(Tumor nercrosisHerpesviridae infections factor-α,TNF-α)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的表达水平显著升高。(2)明确了流感病毒诱导的肺上皮细胞源外泌体对巨噬细胞的损伤机制:采用超高速离心法提取的外泌体鉴定符合外泌体表征;荧光显微镜观察发现外泌体能够进入巨噬细胞内,并且外泌体可以促进巨噬细胞炎症因子的分泌;高通量测序检测出外泌体miR-1249-5p,并聚焦于miR-1249-5p和其靶基因SLC4A1和NF-κB通路。巨噬细胞成功转染miR-1249-5p模拟物以及抑制剂,Western blot法检测miR-1249-5p能够抑制靶基因SLC4A1和NF-κB通路的表达。(3)麻杏石甘汤通过调节miR-1249-5p抑制流感病毒诱导的级联细胞损伤作用:CCK8结果显获悉更多示10%和20%的麻杏石甘汤含药血清无细胞毒性,且抑制IAV诱导MLE-12细胞损伤;NTA检测各组外泌体粒径无明显变化,而浓度有所改变;qRT-PCR结果表明IAV刺激的MLE-12细胞源外泌体miR-1249-5p表达明显降低,麻杏石甘汤高、低剂量组和奥司他韦组的表达显著升高。共培养后的巨噬细胞中miR-1249-5p表达与MLE-12细胞源外泌体相一致;qRT-PCR和Western blot结果显示模型组巨噬细胞SLC4A1和NF-κB通路基因和蛋白的表达显著升高,麻杏石甘汤高、低剂量组和奥司他韦组的表达显著下降。结论:流感病毒通过肺巨噬细胞对MLE-12细胞源外泌体的应答效应诱导急性细胞损伤,而麻杏石甘汤可以增加外泌体miR-1249-5p的传递以抑制SLC4A1和NF-κB信号通路从而改善IAV诱导的炎症反应。

近年来,我国前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)的发病率明显上升,电离辐射治疗(放疗)是一种常见的、疗效明确的前列腺癌治疗方法。铁死亡(Ferroptosis)是2012年新发现的一种区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型调节性细胞死亡形式,具有铁离子依赖性。放疗利用高能电离辐射(ionizing radiation,IR)使DNA双链发生断裂,诱导包括周期阻滞、衰老在内的各种细胞死亡。然而,IR是否能诱导与DNA损伤无关的细胞死亡(如铁死亡)尚不得知,铁死亡在电离辐射应答中的作用目前仍知之甚少。本研究首先使用文献计量的方法,将近十年内被Web of Science收录的关键词为“Ferroptosis”和“cancer”的文章建库,分析了铁死亡在癌症领域的研究热点和研究方向,并对纳入筛选的文章作者、关键词、引用等信息进行聚类分析,明确了铁死亡癌症领域的热点方向为:肿瘤治疗、生存、脂质过氧化、活性氧自由基等。其中最受关注的是肿瘤治疗方向,因此我们利用肿瘤基因图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中前列腺癌患者的m RNA测序和临床信息、基于铁死亡数据库Ferr DbPaired immunoglobulin-like receptor-B V2进行差异分析得到7个与铁死亡相关的预后基因AKR1C2、CDCA3、EZH2、MIOX、NOX1、PVT1、RRM2。对被确定为风险标志物的基因进行Lasso回归分析构建模型,并基于高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus data base,GEO)GSE70770数据集进行模型验证。根据ROC曲线和K-M分析结果显示,7基因模型表现出良好的生存预后预测能力。其次为了验证电离辐射是否能够诱导前列腺癌细胞发生铁死亡,我们对前列腺癌细胞系Du145和PC-3进行电离辐射并检测铁死亡相关指标。实验结果显示,电离辐射后的细胞在细胞形态、克隆形成、增殖能力更多及细胞内ROS、MDA、铁离子水平上均有显著性变化;Western Blot实验和实时荧光定量PCR结果显示铁死亡相关蛋白的表达量同样有显著性变化;对电离辐射的前列腺癌细胞给铁死亡激动剂与抑制剂后,细胞内铁死亡相关指标均有明显变化。由此表明,电离辐射可以诱导前列腺癌细胞发生铁死亡。最后对电离辐射后的前列腺癌细胞转录组进行测序分析,得到了辐射敏感的前列腺癌细胞转录组差异表达基因,将辐射敏感的转录组差异表达基因同生信分析得到的铁死亡相关前列腺癌差异表达预后基因取交集,获SAG小鼠得一个电离辐射敏感的与铁死亡相关的前列腺癌预后差异基因AKR1C2。进一步采用RT-PCR技术对其表达量进行了验证,发现该基因在电离辐射后细胞中高表达;且在铁死亡激动剂可以显著上调电离辐射后细胞该基因的表达量,上调表达随时间的增加而显著变化。综上所述,本研究通过文献计量学和生物信息学方法,发现AKR1C2是辐射敏感的铁死亡相关前列腺癌差异预后基因,并对其在前列腺癌发展及铁死亡通路中的作用进行了探讨并初步确定了AKR1C2参与辐射应答;本研究为电离辐射在前列腺癌临床治疗和铁死亡通路相关研究提供了一些基础数据,AKR1C2作为一个前列腺癌中的抗肿瘤及辐射増敏基因,有望被用于开发基于铁死亡的前列腺癌新疗法,为前列腺癌的治疗提供一条新思路。