Achr receptor

背景甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)是当今世界广泛流行的一种合成毒品。本课题组前期发现,慢性METH滥用可造成严重的神经毒性效应,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在其中扮演了重要作用。而且,α-syn不会局Mirdametinib临床试验限于神经元原位发挥毒性,其还能进入星形胶质细胞。鉴于星形胶质细胞是血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)的重要组成部分,那α-syn在星形胶质细胞中积累能否参与METH诱导的BBB损伤呢?核受体相关蛋白1(Nuclearreceptor-associated protein 1,Nurr1)是核受体家族成员,在大脑中广泛表达。既往研究发现Nurr1与α-syn关系密切,且能在星形胶质细胞中介导炎症反应。然而,目前尚不清楚在星形胶质细胞中,NuHealthcare-associated infectionrr1介导的炎症反应能否参与METH引起的BBB损伤。目的研究METH能否诱导神经元来源的α-syn转移至星形胶质细胞,从而引起BBB损伤,并探讨星形胶质细胞中Nurr1在其中的作用及机制。方法通过伊文思蓝和荧光素钠血管泄漏实验、免疫印迹、免疫荧光染色、免疫组织化学染色、透射电镜观察、酶联免疫吸附实验等,聚焦小鼠海马脑区,检测METH能否诱导BBB损伤和神经炎症(第一章);探讨α-syn基因敲除或α-syn化学抑制后,能否减轻神经炎症和BBB损伤(第二章);研究特异性上调星形胶质细胞Nurr1的表达后,能否对抗上述炎症反应及BBB损伤(第三章)。最后在第四章,原代培养神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞,并建立相应的共培养模型,研究METH能否诱导神经源性α-syn转移至星形胶质细胞;α-syn能否下调星形胶质细胞Nurr1的表达,诱发炎症反应并损伤BBB体外模型。结果第一章.(1)METH诱导了 BBB损伤和炎症反应:伊文思蓝脑透过性增高,Claudin5、Occludin和PDGFRβ水平降低;星形胶质细胞激活,IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高。(2)METH作用上调了 LGX818体内α-syn表达(海马CA1和DG),下调了 Nurr1 和 GDNF 表达。第二章.(1)METH处理可诱导α-syn转移至星形胶质细胞。(2)敲除α-syn可减轻METH诱导的炎症反应、细胞凋亡、BBB损伤、Nurr1及GDNF表达异常:星形胶质细胞数量减少,多种炎症因子水平降低;Cleaved Caspase3和Cleaved PARP水平降低;伊文思蓝和荧光素钠血管泄漏减少,脑实质内IgG沉积减少,Claudin5、Occludin和PDGFRβ水平升高,BBB超微病理(脑微血管异常、星形胶质细胞终足肿胀、周细胞覆盖率降低、紧密连接丢失)减轻;Nurr1和GDNF水平升高。(3)化合物抑制α-syn可减轻METH诱导的炎症反应、BBB损伤、Nurr1 和 GDNF 表达异常:IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平降低;Claudin5、Occludin和PDGFRβ水平升高;Nurr1和GDNF水平升高。第三章.过表达海马星形胶质细胞中Nurr1,减轻了 METH诱导的炎症反应、BBB损伤和GDNF表达异常:IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低;伊文思蓝和荧光素钠血管泄漏减少,Claudin5、Occludin和PDGFRβ水平升高,BBB超微病理减轻;GDNF水平升高。第四章.(1)METH暴露可诱导神经源性α-syn转移至星形胶质细胞。(2)外源性α-syn处理BBB细胞模型后,星形胶质细胞可以内化α-syn,并引起Nurr1和GDNF水平降低、而多种炎症因子水平升高,且共培养体系的培养基中也存在炎症因子升高、而GDNF降低;另外,荧光素钠通透性增高、跨膜电阻值降低、Claudin5和Occludin水平降低。结论慢性METH暴露后,神经元中高水平的α-syn可以转移至星形胶质细胞,α-syn在星形胶质细胞中积累降低了 Nurr1表达水平,进而激活星形胶质细胞引发炎症反应并降低GDNF表达,最终诱导BBB损伤。

猪源肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,Ex PEC)是一类能够引起肠道以外多种器官组织病变的病原菌,常与其他病原菌混合感染猪群,引起猪的脑膜炎、肺炎、关节炎和败血症。在我国,猪源Ex PEC有分离率高、耐药性广、人畜共患潜力大等特点。这些导致抗生素治疗难,病猪死亡率高等问题,给养殖业造成巨大经济损失的同时危害人类公共安全。本试验先初步检测了黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033生长性能的影响及其在猪源Ex PEC PCN033体外感染宿主细胞过程中的作用。之后建立小鼠感染模型,通过比较小鼠存活率、体重变化、临床病变、组织载菌量及组织病理变化等指标,进一步探究了黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033感染小鼠的保护作用。最后深入挖掘猪源Ex PEC PCN033感染宿主NF-κB、MAPK信号通路和NLRP3炎性小体的激活作用以及黄芩苷的调控机制。1、黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌感染细胞的保护作用。本试验首先通过黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033的最小抑菌浓度和生长特性测定,初步判断黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033的生长是否具有抑制作用并确定黄芩苷的最适作用浓度;其次通过测定猪源Ex PEC PCN033黏附、入侵猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)及猪肾上皮细胞(PK-15)和在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)内增殖的能力进一步确定黄芩苷是否对猪源Ex PEC PCN033侵袭宿主细胞具有保护作用;最后通过乳酸脱氢酶试验(LDH)测定黄芩苷是否对猪源Ex PEC PCN033介导的细胞损伤具有保护作用。结果显示,黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033的最小抑菌浓度大于1600μg/m L。此外25、50、100μg/m L的黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033的生长特性没有影响,并且对细菌在3D4/21细胞内的增殖没有作用。但是黄芩苷能够抑制猪源Ex PEC PNaporafenib研究购买CN033对IPEC-J2和PK-15细胞的黏附和入侵,并对其造成的三种细胞损伤有保护作用。2、黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌感染小鼠的保护作用。试验选取四周龄雌性昆明小鼠,随机分组。治疗组和感染组小鼠通过腹腔注射的方式建立猪源Ex PEC PCN033感染,每只小鼠感染1×10~7 CFU PCN033。治疗组小鼠皮下多点注射50寻找更多 mg/kg黄芩苷,首次给药在攻毒后,每日给药2次,直至小鼠剖检当日。攻毒后观察并记录小鼠临床状态、体重变化及死亡情况。在攻毒后6 h,麻醉小鼠并取心、肝、脾、肺、肾、脑、血液,充分研磨并稀释,用于记录各组织载菌量。同时取各组织浸泡于4%多聚甲醛固定,用于病理切片观察。结果表明,感染后小鼠状态萎靡,采食量下降,体重降低,感染组和治疗组均出现小鼠的死亡,且感染组小鼠死亡率及死亡速度均高于治疗组。剖检后,空白对照组无明显病变,各处理组脏器均出现不同程度的病变,但是治疗组的病变程度较感染组缓解。组织病理结果显示,治疗组病理变化程度较感染组轻。组织载菌量结果显示,治疗组的血液及各组织载菌量较感染组均显著降低。3、黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌激活宿主炎性信号通路的影响。首先通过细胞毒性试验初步探究黄芩苷对3D4/21的细胞毒性,以选择后续细胞试验最适药物浓度。其次通过Q-RT PCR的方法测定共培养3 h炎性基因IL-1β、IL-6、IL-8及核转录因子AP-1(c-jun和c-fos)的基因表达量;采用ELISA的方法测定共培养3 h炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8的释放量;采用Western blot方法测定细胞和小鼠NF-κB信号通路蛋白(P65、p-P65、IκBα、p-IκBα)及NLRP3炎性小体蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)的表达量,测定细胞MAPK信号通路蛋白(JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、P38、p-P38)表达量。细胞试验分组分别为空白对照组、PCN033造模组、PCN033+黄芩苷处理组(25、50、100μg/m L),小鼠试验分组分别为空白对照组、PCN033造模组和50 mg/kg黄芩苷治疗组。细胞处理方法为先加入黄芩苷预处理1 h,再加入MOI为10:1的菌量共培养;小鼠感染方法同试验二,感染量为5×10~6CFU。细胞毒性试验结果显示25、50、100和200μg/m L的黄芩苷处理后对细胞没有明显毒性。因此,选用25、50、100μg/m L黄芩苷进行后续细胞试验。Q-RT PCR结果显示,猪源Ex PEC PCN033感染3D4/21后,IL-1β、IL-6、IL-8的转录水平显著上调,黄芩苷可显著抑制这些炎性因子的转录水平;猪源Ex PEC PCN033感染3D4/21后,核转录因子c-jun、c-fos的转录水平显著上调,黄芩苷可显著抑制核转录因子的转录水平。ELISA结果显示,猪源Ex PEC PCN033感染3D4/21后,IL-1β、IL-6、IL-8的释放水平显著上调,黄芩苷作用后可显著抑制这些炎性因子的释放水平。Western blot结果显示,猪源Ex PEC PCN033感染宿主细胞后,p-P65、p-IκBα、p-JNK、p-ERK、p-P38及NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平均显著上调,黄芩苷处理组以上蛋白的表达水平均显著下调;猪源Ex PEC PCN033感染小鼠后,p-P65、p-IκBα、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平均显著上调,50 mg/kg黄芩苷治疗组以上蛋白的表达水平均显著下调。综上所述,systemic immune-inflammation index黄芩苷在不影响猪源Ex PEC PCN033的生长及在细胞内增殖的前提下,通过下调宿主NF-κB、MAPK信号通路的表达,抑制NLRP3炎性小体的激活,降低猪源Ex PEC PCN033感染造成的细胞损伤及对小鼠的致病性,发挥体内外的保护作用。本试验结果为黄芩苷用于治疗猪源Ex PEC感染提供了科学依据。

目的:探讨硫辛酸烟酸二联体(N2L)对蓝光致SD大鼠视网膜损伤的防治作用及最佳药物剂量，探寻其可能存在的保护机制。方法:选取150-200 g的SPF级雄性SD大鼠36只，随机分为正常对照组、蓝光损伤组、N2L低剂量组(1.0 mg/kg)、N2L中剂量组(2.5 mg/kg)、N2L高剂量组(5.0 mg/kg)及生理盐水组，每组各6只。正常对照组12 h明暗循环饲养，其余组每日接受9 hAntidepressant medication日常光照，3 h波长455 nm、强度3000±50 lx蓝光照射及12 h黑夜来建立损伤模型，持续14SBE-β-CD核磁 d。同时每日腹腔注射1 mL对应剂量的药物。14 d后，所有组常规12 h明暗循环再饲养5 d,采用视网膜电图检查。过量麻醉法处死大鼠制备标本，HE染色，在光学显微镜下观察外核层厚度；CheKine~(TM)超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒检测SOD活性；Western Blot检测大鼠视网膜Caspase-3、醌氧化还原酶1(NQO1)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、Bcl-2和Bax蛋白表达量。结果:蓝光损伤组暗视ERG 3.0、10.0 (cd·s)/m~2刺激光下b波、明视ERG 3.0 (cd·s)/m~2刺激光下b波振幅及震荡电位第2个波峰振幅显著低于正常对照组(均P<0.01),N2L中剂量组较蓝光损伤组振幅显著提高(均P<0.05),且与正常对照组无显著差异；蓝光损伤组较正常对照组视网膜ONL厚度下降(P<0.001),N2L中剂量组厚于蓝光损伤组(P<0.001),与正常对照组无显著差异；N2L中剂量组超氧化物歧化酶活性显著高于其余5组(P<0.05);蓝光损伤组Caspase-3、Bax及NQO1表Pidnarulex研究购买达量较正常对照组更高(均P<0.01),N2L中剂量组Bax、Caspase-3表达量较蓝光损伤组显著降低(均P<0.001),而GST、NQO1及Bcl-2显著增加(均P<0.01)。结论:2.5 mg/kg N2L能有效拮抗蓝光对SD大鼠视网膜的损伤作用，有望成为其防治药物。

本文以金属有机骨架ZIF-8/67、ZIF-67、MIL-88A为载体,与分子印迹技术结合,选择不同的模板分子合成表面分子印迹聚合物(Surface Molecular Imprinted Polymers,SMIPs)。将制备的聚合物用作固相萃取柱的吸Caspase抑制剂附剂,对自制柱的使用条件进行优化,结合高效液相色谱法检测水环境中的痕量喹诺酮类抗生素。建立喹诺酮类抗生素的检测方法,通过线性关系、加标回收实验对方法进行验证,并应用于实际水样中。利用新型172 nm氙准分子灯活氧发生器对喹诺酮类抗生素进行降解,对SPE过程中的条件进行优化,并对降解机理展开研究。主要包括以下四个部分:1.通过沉淀聚合法,以双金属沸石咪唑酯骨架ZIF-8/67为载体材料,环丙沙星为模板分子,合成表面分子印迹聚合物(ZIF-8/67@SMIPs),并对其进行表征,证实ZIF-8/67和聚合物合成成功。通过等温吸附实验,测定在环丙沙星浓度为30μg m L~(-1)时ZIF-8/67@SMIPs的吸附量为10.45μg mg~(-1),并将其用作固相萃取柱填料,对自制柱的各项参数进行优化,选择5%甲醇-水(V/V)为上样溶剂,0.1%甲酸-80%乙腈水(V/V)为洗脱溶剂,洗脱体积为4 m L。自制柱在优化条件下的柱容量为150μg,可以重复使用6次。结合高效液相-二极管阵列检测器,建立对水环境中喹诺酮类抗生素的检测方法,对方法进行加标回收实验,得出自制柱在10、20、30μg m L~(-1)三个浓度下,对环丙沙星的回收率在88.34%～111.97%范围内,RSD值在3.23%～5.72%之间。以实际水样为基质,方法在0.05～50μg m L~(-1)范围内线性良好,相关系数R~2=0.9996,检出限为2.59 ng m L~(-1),定量限为8.65 ng m L~(-1)。开发的方法可以对实际样品进行富集和检测,为实际应用提供了参考。2.以ZIF-67为支撑材料,恩诺沙星为模板Patrinia scabiosaefolia分子,甲基丙烯酸为功能单体,合成了表面分子印迹聚合物(ZIF-67@SMIPs),通过多种表征技术证实聚合物包裹成功。对聚合物的吸附能力进行测定,结果显示在恩诺沙星为30μg m L~(-1)时ZIF-67@SMIPs的吸附量为9.02μg mg~(-1)。将ZIF-67@SMIPs用作固相萃取柱填料,并对自制柱的各项参数进行优化,选择上样溶剂为5%的甲醇-水(V/V),洗脱溶剂为0.1%甲酸-甲醇(V/V),洗脱体积为2 m L。用优化出的条件进行柱容量和重复使用性测定,验证自制柱对恩诺沙星的承载量为510μg,可重复使用7次。方法在0.05～50μg m L~(-1)范围内线性良好,相关系数R~2=0.9997。检出限为1.44 ng m L~(-1),定量限为4.79 ng m L~(-1)。加标回收实验得出,在10、20、30μg m L~(-1)三个水平的加标浓度下,自制SPE柱对恩诺沙星的回收率分别为84.16%～100.68%、83.79%～95.17%、84.57%～98.43%,RSD在4.46%～7.35%范围内。利用建立的方法对采集的湖水和养殖厂污水进行处理,证明所开发的方法能够应用于水环境中恩诺沙星的前处理和检测。3.以MIL-88A为载体,司帕沙星的结构类似物槲皮素为替代模板合成了表面分子印迹聚合物MIL-88A@SMIPs。通过各种表征手段观察MIL-88A和MIL-88A@SMIPs外部形貌和特征,验证载体材料和表面印记聚合物合成成功。对聚合物进行吸附速率和等温吸附实验,得出SMIPs在15 min时达到吸附平衡,司帕沙星浓度为30μg m L~(-1)时聚合物吸附量为4.8μg mg~(-1)。将聚合物用作SPE柱填料,并对各项参数进行IDN-6556优化,比较得出,以0.1%甲酸-甲醇(V/V)为洗脱溶剂,洗脱体积为2 m L。用优化出的参数对柱容量和重复使用性进行检测,验证柱容量为80μg,可以重复使用7次以上。建立的方法具有良好的线性范围,相关系数R~2=0.9998,检出限为6.8 ng m L~(-1),定量限为22.68 ng m L~(-1)。用方法进行加标回收实验,在3、15、30μg m L~(-1)三个浓度下,自制柱对司帕沙星的回收率在87.04%～107.44%范围内,RSD值在3.87%～4.67%之间。将开发的方法应用于实际水样中的前处理和检测,结果表明自制柱具有良好的性能,为实际应用提供了参考。4.采用新型172 nm氙准分子灯活氧发生器对喹诺酮抗生素进行降解,并对降解机理进行分析。将其与介质阻挡放电臭氧发生器进行对比,用高效液相-二极管阵列检测器进行检测,得出172 nm氙准分子灯活氧发生器产生的NO_x浓度远低于介质阻挡放电臭氧发生器。对172 nm氙准分子灯活氧发生器的降解方式进行优化,结果表明,气体形式的活氧具有更优异的性能,降解率在78.67%～95.93%范围内。对降解温度和目标物的初始浓度进行探索,得出三种喹诺酮类抗生素在2℃的降解效果最优,分别为70.63%、100%、90.77%,而目标物初始浓度对降解效果的影响不大。实验结果表明,172 nm氙准分子灯活氧发生器在喹诺酮抗生素降解领域的表现优异,可以应用于现实生活中。

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,每年季节性流感给全球造成严重的经济损失和社会负担。当下,流感和新冠共感染增加了重症比例及死亡风险。因此,流感的防治依然是医药卫生领域关注的重点。尽管有多种小分子药物已被批准用于治疗流感,但流感病毒突变迅速导致上市药物均已产生耐药性,如M2-S31N突变株、NA-H274Y突变株和PA-I38T突变株分别对金刚烷胺(M2离子通道抑制剂)、奥司他韦(神经氨酸酶抑制剂)和巴洛沙韦(PA抑制剂)耐药。因此,发现具有新机制、新骨架的流感病毒抑制剂尤为迫切。表型筛选是一种能够快速发现具有新机制和新骨架的先导化合物的有效方法。本课题组前期构建Fer-1核磁了基于细胞模型的表型筛选方法,通过对组内化合物库进行筛选,发现一类查尔酮衍生物具有抗流感病毒活性。Time-of-Addition实验及免疫荧光实验结果表明,该类化合物抗流感的作用机制与现有上市药物截然不同——通过阻碍流感病毒核蛋白的核输出进而干扰病毒增殖,该发现为获得新骨架及新机制的流感病毒抑制剂提供了重要线索。经细胞水平的抗病毒活性评价发现,含有2,6-二甲氧基苯基的A9活性最好(对H1N1 PR8、H1N1 pdm09、H3N2、Yamagata 和 Victoria 毒株的 EC50 值分别为 3.51 μM、1.34μM、3.69 μM、2.47 μM和3.87μM),其表现出与上市药物奥司他韦(对H1N1 PR8、H1N1 pdm09、H3N2、Yamagata 和 Victoria 毒株的 EC50 值分别为 3.08 μM、>100 μM、1.08 μM、0.98 μM和2.43 μM)相当的广谱抗流感病毒活性。但美中不足的是A9具有明显的Persistent viral infections细胞毒性(CC50=41.46 μM),这限制了该化合物的进一步研发。此外,由于尚未确定该类化合物的靶标及结合模式,制约了基于靶标的先导化合物的合理优化。鉴于此,为了寻找高效、低毒的流感病毒抑制剂,本论文采用生物电子等排策略和骨架跃迁策略对先导A9进一步结构优化。根据表型筛选得到的初步构效关系,本论文保留了 A9的优势片段2,6-二甲氧基苯基,同时对“警惕结构”α,β-不饱和酮Linker进行封闭代谢位点、生物电子等排替换、稳定共轭体系以及成环等修饰,最终得到了五类共25个目标化合物。在随后的细胞水平活性测试中,大多数化合物与A9相比在毒性方面已经有所降低,其中Linker为1,4-二烯-3-酮类的化合物整体表现出较低的细胞毒性(50 μM下细胞存活率均大于95%)。但该类化合物的抗病毒活性没有明显提升,在50μM下对细胞的保护率仅为70%,仍需进一步优化。基于第一轮的结构优化及活性测试结果,2,6-二甲氧基苯基及1,4-二烯-3-酮Linker为优势片段,因此在第二轮的结构优化中保留。此外,采用骨架跃迁策略对贡献不突出的三甲基吡嗪环进行替换,引入长度递增的烷基链以及体积递增的脂肪环和芳杂环,丰富构效关系,以期提高活性并降低毒性,最终得到了四类共23个目标化合物。细胞活性测试表明,多数化合物与第一系列相比均无明显的细胞毒性(50μM下细胞存活率均大于95%),且抗流感活性均有提高。其中苯环对位含吗啉环取代基的IIB-2对多种高致病株均表现出微摩尔水平的活性(对H1N1 PR8Rapamycin MW、H1N1 pdm09、H5N8 和 Yamagata 毒株的 EC50 值分别为 7.31 μM、4.56μM、9.60μM、和4.82 μM),虽然抗病毒活性稍弱于A9,但其毒性明显降低(CC50>100 μM),为后续研发奠定了基础。基于ⅡB-2具有低毒高效的特征,本论文首先通过免疫荧光和免疫印迹实验对流感核蛋白进行定位和定量。结果显示与空白对照组相比,给药组中核蛋白的含量明显降低,且大都聚集在宿主细胞核中。由于核蛋白出核时已经与流感基因组和聚合酶组装成核糖核蛋白复合物(RNP),因此表明ⅡB-2可以抑制流感病毒RNP的核输出;随后本论文建立了基于胞苷脱氨酶的免疫荧光模型,探究ⅡB-2是否抑制宿主相关的核输出途径。结果表明ⅡB-2并不会影响胞苷脱氨酶的出核,排除了 ⅡB-2阻碍流感病毒依赖的宿主核输出途径的可能,将靶标锁定在流感病毒上;最后通过表面等离子共振实验证明ⅡB-2与流感核蛋白的亲和—解离趋势呈浓度依赖性变化,符合稳态亲和力结合原则(Kd=0.2392 μM),表明ⅡB-2与核蛋白之间存在特异性结合,推测其靶标可能是流感核蛋白。综上,本论文以具有新机制和新骨架的抗流感病毒化合物A9为先导。虽然A9表现出与上市药物奥司他韦相当的抗流感活性,但其明显的细胞毒性严重阻碍了后续药物开发。鉴于此本研究采用生物电子等排策略和骨架跃迁策略对A9进行两轮迭代优化,得到活性稍弱于A9但毒性显著降低的目标化合物ⅡB-2。最后构建相关的免疫荧光、免疫印迹及表面等离子共振等实验模型对其进行初步机制探究,最终推测该类化合物可能作用于流感病毒的核蛋白。本论文的工作为发现新骨架新机制的抗流感药物提供了先导化合物。

目的:通过检测慢性HBV感染者在不同免疫分期下IFN-λ3表达水平及其使用干扰素和核苷(酸)类似物抗病毒治疗对外周血清IFN-λ3表达水平的影响,探究IFN-λ3临床作用及药物治疗关系,从而为慢乙肝患者达到临床治愈提供合理有效的临床观测指标及治疗选择。方法:选取2021年11月至2023年1月在南昌大学第一附属医院感染科门诊及住院部就诊的慢性HBV感染者201例,并选取同期在我院接受健康体检的HBs Ag阴性的健康人40名作为健康对照组。采用ELISA方法检测血清中IFN-λ3水平,比较慢性HBV感染者与健康人血清IFN-λ3水平差异,分析慢性HBV感染者血清IFN-λ3水平与血清学指标及肝脏酶学指标的关系,分析不同免疫分期患者IFN-λ3表达情况。另选取同期南昌大学第一附属医院肝功能异常且初始抗病毒治疗的慢乙肝患者48例,其中恩替卡韦联合干扰素(ETV+Peg-IFNαBelnacasan molecular weight)治疗组18例,恩替卡韦(ETV)治疗组17例,富马酸丙酚替诺福韦(TAF)治疗组13例,均随访24周,检测0、24周时患者外周血血清IFN-λ3水平,分析各组之间的IFN-λ3之间的关系。结果:1、慢性HBV感染者血清IFN-λ3水平显著低于健康对照组,两组间有统计学差异(P<0.05)。2、免疫控制期血清IFN-λ3表达水平低于免疫耐受期、免疫清除期、再活动期,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。3、免疫稳定期血清IFN-λ3表达水平低于免疫不稳定期,两组间有统计学差异(P<0.05)。4、慢性HBV感染者血清IFN-λ3表达水平均低于临床治愈组血清IFN-λ3表达水平,两组间有统计学差异(P<0.05)。5、慢性HBV感染者血清IFN-λ3表达水平与ALT、AST呈正相关(r=0.145,P=0.04;r=0.57,P=0.026);慢性HBV感染者IFN-λ3表达水平与DNA、log HBV DNA、HBs Ag、HBs Ab、HBe Ag、HBc Ab、TBIL、DBIL无相关性(P>0.05)。6、TAF组治疗后IFN-λ3水平明显高于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05),ETV组和ETV+Peg-IFNα组治疗后较治疗前升高,但均未见统计学差异(P>0.05)。结论:1、慢性HBV感染者血清IFN-λ3显著低于健康者,其中免疫控制期患者较免疫耐受期、免疫清除期、再活动期患者具有较低的血清IFN-λ3水平,免疫稳定期组患者较免疫不稳定期组患者具有较低的血清IFN-λ3水平,预测IFN-λ3在慢性HBV感染者自然病程点击此处中起保护作用。2、慢性HMedicare savings programBV感染者血清IFN-λ3表达水平与ALT、AST水平呈正相关。推测IFN-λ3表达水平对肝酶有影响。3、抗病毒药物可能通过诱导IFN-λ3的表达来增强抗病毒活性,其中TAF治疗后患者具有较高的血清IFN-λ3水平。4、临床治愈者IFN-λ3表达水平最高,提示将来IFN-λ3有望成为慢乙肝患者抗病毒治疗达到临床治愈的一种治疗策略。

背景:随着社会的高速发展和各种高压事件的频发,抑郁症逐渐成为全球范围内最为普遍的精神障碍类疾病。抑郁症以长期的情绪低落、快感缺失和行为绝望为主要特征,但目前临床使用的一线抗抑郁药物治疗效果不佳,患者停药后易复发,这些现状提示抑郁症具有多病因机制的显著特点。因此,目前亟需更全面地阐明抑郁症的病理机制,以寻找治疗抑郁症的新靶点,并针对性地开发更优化的诊断和治疗策略。近年研究表明,神经元可塑性失调在抑郁症的发生发展中可能起着重要作用。慢性、持续的压力应激往往导致大脑出现适应性异常,神经元发生结构和功能可塑性损伤,从而影响正常的神经放电、神经内分泌等活动,这可能是促进抑郁、焦虑等情绪障碍发生的重要诱因,但具体机制不清。细胞内酸碱平衡是细胞维持功能活动稳态的重要特征之一,但截至目前止,神经元细胞内酸碱稳态失衡在抑郁症发病中的作用及机制尚不清楚。Na+/H+交换体(Na+/H+exchanger,NHE)属于高度进化保守的转运蛋白家族,可将细胞内H+与胞外Na+进行电中性交换,调控细胞内pH值(intracellular pH,pHi)的动态平衡。其中,NHE1是中枢神经系统中表达最丰富的亚型,尤其在皮质、海马和小脑中高表达,是哺乳动物神经元细胞内酸碱稳态的主要调节者,但其在突触可塑性调节中的作用,及其异常表达是否参与抑郁症的发病过程,目前尚未可知。在此研究背景下,我们拟构建慢性不可预知温和应激(Chronic Unpredicted Mild Stress,CUMS)诱导的抑郁动物模型,并采用蛋白质组学、膜片钳电生理、行为学检测、化学遗传学、病毒学和转基因鼠结合等多种实验技术与方法,探究压力应激作用下,NHE1是否通过调节神经元突触可塑性参与抑郁症的发生发展,及其发挥作用的具体分子机制。方法:(1)在体CUMS建模:将雄性Wistar大鼠(120-140 g)随机分为Control(空白对照组,Ctrl)组和CUMS组,给予CUMS组大鼠5周的慢性不可预知温和应激。造模结束后,对两组大鼠进行行为学测试以评估大鼠抑郁样和焦虑样行为,包括蔗糖偏好实验、强迫游泳实验、旷场实验和高架十字迷宫实验;采用H+荧光探针检测神经元细胞内pH值水平;采用免疫荧光、高尔基染色、透射电镜检测神经元结构可塑性如树突棘、突触的形态数目变化等;采用脑片膜片钳技术检测神经元功能性放电活动。对Control组大鼠和行为学测试中表现出抑郁样行为的CUMS组大鼠海马组织样本进行Label-free定量蛋白质组学检测,通过生物信息学分析寻找与调节细胞内pH值有关的差异性表达蛋白质。(2)敲减NHE1的腺相关病毒脑内注射建模:构建特异性敲减兴奋性神经元中NHE1的腺相关病毒,利用脑立体定位仪注射于大鼠的双侧海马CA1(Cornu Ammonis 1)区,病毒感染2-3周后进行蔗糖偏好实验、强迫游泳实验等行为学检测,若无显著的抑郁样行为,则给予大鼠2周的慢性不可预知温和应激刺激;通过Western blot技术、免疫荧光、转盘式共聚焦、高尔基染色、全细胞膜片钳技术和电子显微镜分别观察NHE1蛋白的表达水平、细胞定位、细胞内pH值以及神经元结构和放电活动的改变。采用全转录组学测序和qPCR技术验证NHE1的mRNA表达水平;通过富集分析寻找调控selleck激酶抑制剂翻译后修饰相关的蛋白质,进一步利用定量蛋白组学结果和生物信息学分析寻找与调控NHE1蛋白表达水平相关的差异性表达蛋白质。(3)离体实验建模:培养原代大鼠海马神经元,构建皮质酮(Corticosterone,CORT)诱导的细胞应激模型,验证应激刺激作用下NHE1蛋白的降解途径:采用溶酶体抑制剂氯喹阻断溶酶体降解通路,采用蛋白酶体抑制剂MG132阻断蛋白酶体降解通路;利用免疫荧光技术观察NHE1和CUL4A(Cullin4A)在神经元中的定位;采用免疫沉淀技术验证应激刺激作用下NHE1的泛素化水平。(4)构建过表达CUL4A的腺相关病毒,并通过脑立体定位仪定位注射于Thy1-Cre小鼠双侧海马CA1区,病毒感染2-3周后,对各组动物进行蔗糖偏好实验和强迫游泳实验等行为学测试;采用H+荧光探针和转盘式共聚焦检测小鼠海马CA1区神经元内pH值变化;通过Western blot技术检测CUL4A和NHE1的蛋白表达水平;使用膜片钳技术检测神经元自发性放电及诱发的动作电位变化。(5)基于化学遗传学技术,构建AAV-DIO-hM4Di-mCheery病毒,通过脑立体定位仪定点注射于Thy1-Cre小鼠海马CA1区;构建AAV-CaMKII-hM4Di-mCheery病毒注射于正常大鼠的海马CA1区,病毒感染2-3周后,对动物进行腹腔注射生理盐水或者CNO(clozapine-N-oxide)处理,通过蔗糖偏好实验和强迫游泳实验检测行为学改变;采用脑片膜片钳技术检测CNO给药前后神经元的兴奋性变化。结果:(1)与Control组比较,CUMS组大鼠在蔗糖偏好实验中对糖水的消耗百分比明显降低;在强迫游泳实验中其保持不动、相对静止的时间显著增多;在旷场实验中运动的总距离没有明显差异,但与Control组比较,CUMS组大鼠在中央格停留的时间减少;在高架十字迷宫实验中,与Control组比较,CUMS组大鼠进出开放臂的次数以及停留在开放臂的总时间均明显减少。与Control组比较,CUMS组大鼠海马CA1区神经元内pH值显著降低;CUMS组大鼠海马CA1区神经元的树突复杂性、树突棘密度和突触数量均有一定程度的降低;与Control组比较,CUMS组大鼠海马CA1区神经元自发性兴奋性突触后电流和微小兴奋性突触后电流减弱。以上结果提示5周的慢性不可预知温和应激可诱导大鼠表现出抑郁样行为,降低神经元内pH值水平并导致海马神经元结构和功能可塑性异常。(2)蛋白质组学结果显示,多种蛋白质在抑郁样大鼠海马CA1区存在差异性表达,其中NHE1蛋白表达明显减少,提示NHE1可能是参与抑郁症发病中神经元胞内pH值降低和可塑性损伤的关键分子。(3)行为学检测结果显示,相比于注射对照病毒组,敲减正常大鼠海马CA1区NHE1的蛋白表达后,动物的行为学检测结果无显著性变化,但给予这组大鼠仅2周的CUMS刺激,就足以诱导明显的抑郁样行为,包括在蔗糖偏好实验中饮用糖水的百分比减少,在强迫游泳实验中呈现静止状态的时间显著增加等。以上结果提示,相比于注射对照病毒组,敲减大鼠海马CA1区NHE1蛋白表达使大鼠在受到压力应激刺激后更容易表现出抑郁样行为,对应激刺激的易感性增加。(4)QPCR结果显示,Control组和CUMS组间NHE1的mRNA表达水平无统计学意义,提示NHE1蛋白水平下调可能是由于转录后或翻译后调控所致。COG(Cluster oforthologous group)富集分析显示,抑郁大鼠海马CA1区呈差异性表达的蛋白质主要富集在蛋白质翻译后修饰途径。在富集于翻译后修饰通路的差异性蛋白质中,CUL4A作为可通过泛素化降解蛋白质的E3泛素连接酶家族重要成员,与Control组比较,其在CUMS组表达水平明显增高。Western blot技术检测发现,经蛋白酶体抑制剂MG132处理后,可明显逆转CORT诱导的NHE1表达水平的下调,说明应激刺激作用下NHE1蛋白水平的下调可能与蛋白酶体降解途径有关。免疫荧光结果显示CUL4A和NHE1在内质网上存在共定位现象。免疫沉淀结果表明,随着CORT作用时间增加,培养的原代神经元中NHE1泛素化水平明显升高。这些结果提示CUL4A可能靶向NHE1的泛素化修饰,并促进其通过蛋白酶体途径降解。(5)在Thy1-Cre小鼠海马CA1区锥体神经元中过表达CUL4A,给予小鼠2周的CUMS刺激,即可诱导其产生明显的抑郁样行为。同时发现,相比于注射对照病毒组,过表达CUL4A的小鼠CA1区谷氨酸合成Organic immunity酶活性下降,锥体神经元内pH值降低,神经元自发性放电及诱发的动作电位明显减少,并伴随NHE1蛋白表达水平降低。(6)脑片膜片钳全细胞记录结果发现,在新鲜的脑切片灌流液中加入CNO后,表达hM4Di的Thy1-Cre小鼠海马椎体神经元产生动作电位的诱发电流阈值增高,神经元兴奋性降低;相比于CNO给药前,在相同的注入电流诱发条件下,表达hM4Di的大鼠兴奋性神经元动作电位频率降低。行为学检测结果发现,在锥体神经元中特异性表达hM4Di的Thy1-Cre小鼠中,相比于生理盐水注射组,腹腔注射CNO组小鼠在在强迫游泳实验和悬尾实验中的静止时间均增多。同样,在兴奋性神经元中特异性表达hM4Di的大鼠中,相比于腹腔注射生理盐水组,腹腔注射CNO的大鼠在强迫游泳实验中静止不动时间增多,在蔗糖偏好实验中糖水消耗百分比减少,表现出抑郁样行为。结论:慢性压力应激可导致大鼠海马CA1区E3泛素连接酶CUL4A表达ABT-263供应商增加,CUL4A可能通过泛素化修饰NHE1使其降解增加,导致神经元内H+排出减少、pH值降低,细胞内酸碱稳态失衡,继而导致海马CA1区锥体神经元突触可塑性发生失调,突触传递效能减弱,神经元兴奋性降低,并最终促进动物产生抑郁样行为。本研究结果完善了压力应激刺激导致抑郁症发病的神经可塑性损伤机制,为发现和筛选新型抗抑郁药和抗抑郁治疗新策略提供潜在靶点和科学依据。

过度的炎症给患者带来痛苦,严AZD6738核磁重可致亡。萘普生作为一种非甾体抗炎药,可有效缓解过度的炎症反应,但长期服用会导致诸多不良反应的发生。为了得到抗炎活性优良且毒副作用更小的新型抗炎药物,受肉桂酸生物活性多样性和安全低毒性的启发,本文以S-(+)-萘普生为基本骨架,利用肉桂酸及其类似物对其进行结构修饰,并通过体外生物活性测试和作用机制研究,以期得到高效低毒的新型抗炎药物。利用肉桂酸及其类似物,通过Steglich酯化反应,对S-(+)-萘普生这一基本骨架进行结构修饰,合成得到三个系列共88个新型化合物,并对其物理性质和化学结构进行表征,以确证化合物的纯度和结构。点击此处然后,建立LPS诱导RAW 264.7细胞体外炎症模型,并利用该模型对给药浓度为50μM的新型化合物进行抑制NO释放活性初筛和IC_(50)测试。与此同时,利用MTT法对化合物进行RAW 264.7细胞毒性测试。接着,从每个系列中分别选取一个活性最好且毒性较小的化合物,通过Western Blotting实验研究其抗炎机理。最后,通过分子对接软件Sybyl-X 2.0模拟其与炎症因子的结合情况。经表征,确证了88个新型化合物的化学结构,且纯度较高。经体外抗炎实验和细胞毒性测试,筛选出十个高效低毒的抗炎活性小分子(化合物10、23、26、28、53、58、68、7Medical college students3、86和87)。抗炎机理研究表明,在每个系列中抑制NO释放活性最好的化合物23、53和68对NF-κB通路具有一定的阻断作用,并抑制了NLRP3炎症小体和i NOS、COX-2和IL-1β三种炎症因子的过度表达。分子对接结果表明,该三个化合物均可嵌入该三种炎症因子的活性口袋,与每种炎症因子产生一定的相互作用力。本文合成的新型化合物23、53和68具有高效低毒的特点,可有效阻断NF-κB信号通路,以及抑制NLRP3炎症小体和i NOS、COX-2和IL-1β三种炎症因子的过度表达,从而抑制NO的释放。本文通过天然活性小分子修饰抗炎药物的合成策略有望为新型抗炎药物的研发提供新思路。

小麦作为世界三大粮食作物之一,为40%的人口提供食物。随着全球粮食需求的增加和耕地的减少,提高小麦产量对我国粮食安全具有重要意义。小麦产量由亩穗数、穗粒数和千粒重构成,其中千粒重受籽粒长度、籽粒大小和灌浆充实度调控,是遗传力相对较高的数量性状。本课题组前期通过特异位点扩增片段测序(SLAF-seq)的方法构建了小麦品种中国春与石新828粒长相关的遗传连锁图谱,定位到一个位于2D染色体长臂上的关键QTL位点qGL2D,并利用次级定位群体与转录组学结合的手段定位到调控籽粒长度和重量的关键基因TaIBH1-2D。本研究综合利用遗传学、生物化学、基因组学和代谢组学等研究方法,解析了 TaIBH1-2D与其相互作用蛋白TaSnRK1α1-1D调控此网站小麦genetic fate mapping粒长与粒重的分子机制,具体研究结果如下:1、对TaIBH1-2D小麦过表达材料与基因敲除突变体Taibh1-2ABD-cr的农艺性状分析显示,TaIBH1-2D过表达小麦粒长变短、千粒重降低,而Taibh1-2ABD-cr显示为小麦粒长和千粒重都显著增加。多组学分析显示,TaIBH1-2D一方面抑制细胞伸长基因TaEKPA2和TaEXPA4的表达,抑制籽粒种皮细胞伸长生长,导致籽粒长度缩短;另一方面TaIBH1-2D降低蔗糖长距离运输关键基因TaSUT1的表达,抑制蔗糖从旗叶向外运输,降低籽粒的灌浆,从而导致籽粒千粒重降低。2、利用酵母双杂交文库筛选,找到TaIBH1-2D互作蛋白TaSnRK1α1-1D,并通过体外蛋白Pull down、原生质体内参比双分子荧光互补和烟草瞬时转化CoIP等方法证明二者在体内与体外有相互作用。遗传学分析显示TaSnRK1α1-1D过表达促进小麦籽粒种皮细胞伸长生长,增加小麦籽粒长度和千粒重。RT-qPCR分析显示TaSnRK1α1-1D过表达促进TaEXPA2、TaEXPA4和TaSUT1的表达。代谢分析显示TaSnRK1α1-1D过表达株系中,旗叶淀粉含量显著下降,蔗糖含量显著升高。这些结果表明TaSnRK1α1-1D能够通过促进细胞伸长和灌浆来调控小麦籽粒发育。3、体外激酶实验显示TaSnRK1α1-1D能selleck Dinaciclib够直接磷酸化TaIBH1-2D。体内杂交材料和cell-free半体外蛋白降解实验证实,TaSnRK1α1-1D降低了 TaIBH1-2D的蛋白稳定性,促进其降解。综上所述,本研究揭示了粒长关键基因TaIBH1-2D通过抑制小麦籽粒种皮细胞伸长和旗叶中蔗糖的源-库运输,负调控小麦籽粒发育的潜在机理;系统阐述了TaSnRK1α1-1D通过磷酸化调控TaIBH1-2D蛋白稳定性,进而促进小麦籽粒发育的分子机制,为高产小麦品种培育提供优异等位基因和理论指导。

尿石素A具有许多优良的生理活性，但其极低的水溶性和生物利用率限制了尿石素A的应用。为克服上述限制，该文采用pH驱动法结合高压均质技术制备尿石素A脂质体（urolithin A liposomes，UA-LPs），并考察其结构特Lung bioaccessibility性、稳定性及体外消化特性。结果表明，大豆卵磷脂为20 mg/mL所制得的UA-LPs的平均粒径为（97.46 ± 0.83）nm，多分散指数为（0.26 ± 0.01），Zeta电位为（-43.6 ± 1.20）mV，包埋率为（98.11 ± 0.26）%，负载率为（2.39±0.01）%。UA-LPs在原子力显微镜下为分布均匀的球状结构。热稳定性实验表明，不同大豆卵磷脂浓度的selleckchem NSC 125973UA-LPs的包埋率均随热处理时间的延长有所下降，20 mg/mL的大豆卵磷脂制备的UA-LPs具有最好的热稳定性，其在80 ℃处理180 min后仍可保留45%的尿石素A，且粒径、多分散系数变化趋势较小。pH稳定性表明UA-LPs在酸性条件下包埋率较低，随着pH的升高粒径、多分散系数变化不显著（P > 0.05），20 mg/mL的大豆卵磷脂制备的UA-LPs的Zeta电位绝对值上升5.5，稳定性升高。体外模拟消化实验表明，UA-LPs能有效提高尿石素A的转化率以及生物可接受度，其中20 mg/mL大豆卵磷脂制备的UA-LPs的体外转化率相比游离的尿石素A增加了4.26倍，生物可接受度提高3.07倍。Erdafitinib因此，利用pH驱动法可以成功制备出UA-LPs，且高大豆卵磷脂浓度的UA-LPs物理稳定性更好，以上研究结果可以扩展尿石素A在食品工业及生物医药领域的应用。