Achr receptor

研究目的:抑郁症是一种常见的精神类疾病,以情绪低落为显著特征,临床症状表现为悲观、焦虑、厌世,严重者可能会产生自杀倾向。抑郁症的防治目前仍是我国乃至世界公共卫生的重要课题之一Personal medical resources。目前抑郁症的治疗主要以药物治疗为主,而抗抑郁药有起效慢、不良反应多、费用高等缺点。运动疗法因其安全可控、简单高效的独特优势成为目前干预抑郁症的热点。研究证实,运动在预防、治疗抑郁症方面中具有良好的效果,适当进行体育运动不仅能提高神经兴奋性,增强心肺功能,还能改善精神状态。目前运动类型主要集中在有氧运动和抗阻运动。课题组前期分别采用1H NMR和LC-MS代谢组学技术对不同运动方式干预后的抑郁大鼠不同生物样本进行检测,发现有氧运动呈现出更优的抗抑郁效果,但其机制尚不明确。海马体作为大脑生理和行为的重要调节区域,是与情绪和认知关系密切的重要脑区,抑郁障碍在其病因、病理生理过程以及治疗方面与海马结构有着密切的联系,海马被认为是治疗抑郁症的潜在靶点。现阶段对抑郁症海马组织的研究主要集中在海马结构和神经元等神经可塑性方面,但抑郁状态下海马组织的代谢特征目前还未完全阐明。因此,全面研究抑郁症状态下海马体的变化具有重要意义。本研究通过LC-MS代谢组学技术结合网络药理学探究有氧运动对CUMS大鼠海马组织内源性代谢物的调控作用以及有氧运动干预抑郁症的靶点和信号通路,明确有氧运动抗抑郁的作用机制。研究方法:选用8周龄雄性SD大鼠32只,适应性饲养一周后根据行为学测试指标的基线数据分为对照组(C)、模型组(D)、有氧运动组(E)和模型运动组(DE),每组8只。采用孤养法结合CUMS这两种造模方式来优化构建抑郁大鼠模型。C组和E组的大鼠每四只饲养在同一鼠笼,D组和DE组的大鼠每只一笼单独饲养。C组大鼠全程正常饲养,E组正常饲养三周,D组和DE组进行慢性不可预知温和应激(CUMS)造模三周后,D组继续造模,DE组和E组进行四周有氧运动干预,运动时仍进行造模。造模方式在课题组前期方案基础上稍作修改,每周有6天给予大鼠刺激源,每天随机进行一种刺激方式,同一刺激不连续出现,在第7天对大鼠进行各项行为学测试。在正式开始有氧运动干预前,先让大鼠连续三天在跑步机上进行活动,以熟悉正式运动,从第四周正式开始有氧运动干预,有氧运动方案为前5min速度为7m/min,后5min速度为10m/min,最后20min速度13m/min,每运动15min后允许休息5min,每周6次,每次30min,连续4周。采用体重(BW)、糖水偏好实验(SPT)及旷场实验(OFT)评估大鼠抑郁样行为,以确定抑郁模型成功建立。LC-MS代谢组学技术和Metaboanalyst软件分析检测与抑郁症及其有氧运动干预抑郁症后海马组织代谢物的变化及相关代谢通路,网络药理学分析采用Cytoscape3.7.2构建PPI网络,并利用MCODE得到有氧运动干预抑郁症的主要靶点,Metascape3.5软件进行生物学信息富集分析,用Cytoscape3.7.2构建靶点-通路图。利用SPSS27PLX-4720分子式.0统计软件以及GraphPad Prism8.0对数据进行处理分析。数据以均数±标准差(x±s)表示,采用双因素方差分析检验,P<0.05为差异具有显著性,P<0.01为具有非常显著性差异。研究结果:(1)与C组相比,D组大鼠体重、糖水偏爱率、穿越格数及直立次数均显著降低(P<0.01);与C组相比,E组大鼠体重在经过四周有氧运动后显著下降(P<0.01)、穿越格数和直立次数显著增加(P<0.05),而糖水偏爱率无显著差异;与D组相比,DE组大鼠糖水偏爱、穿越格数及直立次数均显著增加(P<0.05,P<0.01)。(2)与C组相比,D组大鼠海马组织鉴定出胆碱、L-苯丙氨酸、谷氨酸、N-乙酰丙氨酸、4-叔丁基苯酚、D-鞘氨醇、肌酸等16个与抑郁症相关的差异代谢物;与D组相比,DE组大鼠谷氨酸、L-苯丙氨酸、谷氨酰胺、次黄嘌呤、和酪氨酸水平显著升高,肌酸和黄嘌呤水平显著降低。(3)代谢通路富集分析结果显示有氧运动干预后回调了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、精氨酸生物合成等5条代谢通路。(4)网络药理学结果筛选出有氧运动干预抑郁症的99个靶点,MCODE分析得到12个关键靶点,KEGG富集分析发现靶点主要参与癌症通路、PI3K-AKT信号通路、多巴胺能神经突触、c AMP信号通路、钙信号通路和生长激素的合成、分泌和作用等20个显著相关通路,涉及分泌调节、炎症反应、血液循环等生物过程。研究结论:有氧运动能够改善CUMS大鼠的抑郁样行为,有氧运动能够显著回调海马区氨基酸类代谢物selleck PF-07321332的水平;综合网络药理学结果发现有氧运动可能通过调控机体AKT1、MTOR、GNAS、FOS、CREB1等靶点作用于PI3K-AKT、c AMP、多巴胺能神经突触等信号通路干预抑郁症。

土壤中重金属镉污染是当今亟待解决的世界难题之一,相比较于传统的物理化学修复技术,植物修复以绿色、高效等特点受到众多研究者的青睐。大量科学研究表明十字花科芸苔属植物具有较强的镉吸附能力,能有效修复受镉污染的土壤。相对于其它修复植物,甘蓝型油菜(Brassica napus)具有根系发达,地上部生物量大,抗胁迫能力强等特点,能够有效富集土壤中过多的镉,是我国种植面积最大、分布最广、籽粒产油量最高的油菜品种。此外还具有工业、饲用、蜜源和观赏等多种用途,在保持原有经济价值的同时还具有修复土壤中镉污染的潜力,是目前修复镉污染土壤的良好选择。因此,筛选具有镉耐受能力的甘蓝型油菜品种(系),鉴定油菜体内镉吸收和转运相关蛋白或功能基因,对Crude oil biodegradation于研究油菜应答镉胁迫的分子机制、培育用于土壤污染修复的实用型镉超积累油菜具有重要意义。本研究主要对课题组前期筛选出的4个甘蓝型油菜品系进行了进一步的细胞和生理学鉴定,并对油菜H334品系转录组数据中筛选出的镉相关候选基因进行了进一步的验证。主要研究结果如下:1.通过测定油菜镉耐受品系H334、H423和镉敏感品系H486、H540在镉胁迫下的干重、镉含量,观察各品系在根、茎、叶细胞学水平的差异,并测定不同品系在镉胁迫下的生理指标,发现H334经镉处理后根部镉含量积累较多,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸(ASA)等活性显著增强而H486镉胁迫后根部镉含量较低,生理指标无显著响应。2.从H334转录组数据中筛选出8个可能与镉转运相关的候选基因。分别在镉耐受品系H334和镉敏感油菜品系H486进行基因的组织表达分析并通过在酵母中异源互补验证这些基因的功能。组织表达分析结果表明这8个基因中大多数基因在镉胁迫后表达量发生显著变化,且在镉敏感性差异材料间基因的表达也存在显著差异。酵母LBH589配制互补实验表明Bn HIPP26和Bn HIPP47-like基因能增强酵母镉敏感型突变体Δycf1在含镉培养基上的生长。3.Bn HIPP26和Bn HIPP47-like基因属于甘蓝型油菜重金属相关异戊二烯化蛋白家族(HIPPs),对Bn HIPPs基因家族进行了生物信息学分析。以拟南芥中At HIPPs基因为参考,最终从甘蓝型油菜品种中双11(ZS11)基因组中筛选鉴定出124个Bn HIPPs基因,并对Bn HIPPs基因进行了进化树、保守基序和保守结构域等分析。进化分析结果表明Bn HIPPs基因主要被分为5个不同的簇,几乎所有Bn HIPPs蛋白(包括Bn HIPP26和Bn HIPP47-like)都含有motif 1(重金属保守结合基序M/L/IXCXXC)、motif 5(富含甘氨酸和脯氨酸区端)和motif 2(含异戊二烯化Caa X)基序。同时,该基因家族在基因结构方面也表现出同簇相似性。通过对所有Bn HIPPs基因上游2000 bps的启动子序列进行了分析。结果显示,所有的Bn HIPPs基因启动子中都有两个及以上的顺式作用元件,并且大多数都具有激素响应元件(如脱落酸、茉莉酸、赤霉素等)和参与防御胁迫响应元件。染色体结果显示除10个Bn HIPP基因未匹配到染色体上外,其余114个Bn HIPPs基因不均匀的分布在甘蓝型油菜的19条染色体上。4.为进一步验证Bn HIPP26和Bn HIPP47-like基因的功能,构建了基因的植物表达载体,并分别转入烟草和野生型拟南芥中。亚细胞定位结果Erastin molecular weight表明Bn HIPP26-GFP融合蛋白定位在细胞核,Bn HIPP47-like-GFP定位在细胞核和细胞膜。同时,成功将这两个基因转化至野生型拟南芥中,初步筛选获得了T_1代转基因植株。

中药五味子是五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的干燥成熟果实,因其具有酸、苦、甘、辛、咸五味而得名。现代药理学研究证明,联苯环辛烯类木脂素,具有联苯键和环辛二烯环,是五味子的主要活性成分,具有保肝、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等良好活性,临床需求量大。但是五味子植物生长周期长,有效成分含量低,提取分离纯化步骤繁琐,野生资源越来越少且人工栽培起步较晚,所以亟需开发新的资源供给模式。近些年来,由于中药资源的可持续利用一直是个热门话题,植物天然产物合成生物学应运而生,越来越多的中药活性成分已经通过合成生物学策略实现了新的供给模式。综上所述,基于联苯环辛烯类木脂素结构独特和活性显著的特点,引起了团队对此类化合物生物合成途径解析的极大兴趣。2007年,日本京都大学的学者Shiro Suzuki和Toshiaki Umezawa对各种结构类型木脂素类化合物的生物合成途径进行了总结和推测,其中对联苯环辛烯类木脂素生物合成途径的推测是:前体物质松柏醇被催化生成异丁香酚,接下来异丁香酚发生二聚化反应生成渥路可脂素,渥路可脂素接着发生开环反应生成二氢愈创木脂酸,最后二氢愈创木脂酸经分子内芳基偶联反应形成联苯键产生联苯环辛烯类木脂素戈米辛A。有学者从矮牵牛(Petunia×hybrida)中分离出两个酶PhCFAT和PhIGS1,前者能够催化松柏醇生成乙酸松柏酯,后者能够催化乙酸松柏酯生成异丁香酚。因此,松柏醇酰基转移酶(coniferyl alcohol acyltransferase,CFAT)和异丁香酚合酶(isoeugenol synthase,IGS)作为继松柏醇之后的前两个限速酶,它们对于联苯环辛烯类木脂素的积累以及生物合成途径的解析至关重要。为了鉴定五味子中编码CFAT和IGS的基因,本研究基于不同发育时期五味子果实的转录组数据库进行了基因家族的鉴定和生物信息学分析,不仅对五味子基因家族的功能进化有了系统的认识,还筛选得到了关键候选基因,并通过体外selleck Dibutyryl-cAMP酶促反应和底物饲喂的方式从五味子中鉴定到两个具有催化活性的酶ScCFAT和ScIGS1。现将主要研究内容及结果叙述如下:1.首先为了明确五味子中是否存在编码CFAT和IGS的基因,本研究使用气质联用仪对五味子果实乙酸乙酯提取物和异丁香酚标准品溶液进行了检测,通过比对发现五味子果实中富含大量顺、反式异丁香酚混合物,以反式异丁香酚为主。因此,可以明确五味子中存在编码CFAT和IGS的基因,另一方面也进一步证实了联苯环辛烯类木脂素生物合成途径的可靠性。2.为了对五味子BAHD酰基转移酶家族有系统的了解并发掘编码CFAT的候选基因,本论文基于五味子果实转录组数据寻找更多库对BAHD酰基转移酶家族成员进行了系统的鉴定和生物信息学分析。一共鉴定出37条ScBAHD氨基酸序列,与其它物种中共计75条BAHD酰基转移酶序列共同构建了系统发育树。结果显示,所有BAHD酰基转移酶划分为五大分支,除了第Ⅳ分支之外,37条ScBAHD在其它分支中均有分布。其中,ScBAHD1、ScBAHD3和ScBAHD7分布在第Ⅲ分支中,与PhCFAT的亲缘关系最近。表达模式分析表明,只有ScBAHD1表达水平的变化符合联苯环辛烯类木脂素在五味子不同发育时期果实中的积累模式,因此被选为候选基因用于后续研究。3.为了验证ScBAHD1是否具有松柏醇酰基转移酶的催化活性,本研究通过同源重组技术将其开放阅读框(openreadingframe,ORF)连接在原核表达载体上,以PhCFAT作为阳性对照,通过体外酶促反应发现ScBAHD1能够催化松柏醇和乙酰辅酶A产生与阳性对照组相同的产物乙酸松柏酯,所以将其命名为ScCFAT。此外,对ScCFAT进行底物多样性研究发现它只对醇羟基具有乙酰化活性,对酚羟基尚未检测到催化活性。ScCFAT的亚细胞定位分析结果表明其主要定位于烟草叶片的细胞质中。同源建模所得ScCFAT的三维晶体结构符合BAHD酰基转移酶家族成员三维结构的基本特征。最后,通过丙氨酸筛查的方式明确了 His158是ScCFAT的关键残基,突变之后会导致其完全失去催化活性。4.为了对五味子PIP还原酶家族有系统的了解并发掘编码IGS的候选基因,本研究基于五味子果实转录组数据库对PIP还原酶家族成员进行了系统的鉴定和生物信息学分析。一共鉴定出9条ScPIP氨基酸序列,与其它物种中的32条PIP还原酶序列共同构建了系统发育树。结果显示,所有PIP还原酶一共划分为四大分支,9条ScPIP散布在四个分支中。其中,ScPIP1处于第Ⅳ分支中,与PhIGS1的亲缘关系最近。ScPIP2和ScPIP4位于第Ⅲ分支中,该分支中包含一些丁香酚合酶(eugenol synthase,EGS)成员。实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测结果表明,ScPIP1和ScPIP2表达水平的变化趋势与ScCFAT的表达模式基本一致,ScPIP4却一直呈现出较低的表达水平。最终,本研究选择对ScPIP1、ScPIP2和ScPIP4这三条基因进行克隆及功能研究。5.为了验证ScPIP1、ScPIP2和ScPIP4是否具有异丁香酚合酶或者丁香酚合酶的催化活性,本研究将它们的ORF序列连接在原核表达载体上,将松柏醇饲喂孵育重组质粒的大肠杆菌,利用大肠杆菌内源性酰基转移酶乙酰化松柏醇生成乙酸松柏酯作为底物。检测发现,ScPIP1组和阳性对照PhIGS1组的大肠杆菌在培养基中释放出了异丁香酚,但是ScPIP2、ScPIP4以及空载体组既没有产生异丁香酚,也没有产生丁香酚,所以将ScPIP1命名为ScIGS1。亚细胞定位分析结果显示,ScIGS1主要定位于烟草叶片的细胞质及细胞核内。同源建模所得ScIGS1的三维晶体结构符合PIP还原酶家族成员三维结构的基本特征。通过定点突变实验发现,110位和113位氨基酸都会影响ScIGS1催化产物的组成及比例,His113突变为Tyr不会改变产物组成,Lys157突变为Ala会导致ScIGS1完全失去催化活性。最后,对ScIGS1及其5个突变体的酶转换数(kcat)进行预测发现5个突变体的kcat值均小于ScIGS1的kcat值,表明突变之后酶的催化活性降低。综上所述,本研究首次基于前人对联苯环辛烯类木脂素生物合成途径的推测开展了一系列基因家族鉴定和生物信息学分析,从五味子中克隆得到联苯环辛烯类Medial prefrontal木脂素生物合成途径上编码CFAT和IGS的cDNA全长基因,并且进行了功能验证,是联苯环辛烯类木脂素生物合成途径解析的开拓性进展。此外,这两个基因将有利于后续通过共表达分析结合基因家族分析发掘出更多可能参与下游催化反应的候选基因,旨在早日完全解析联苯环辛烯类木脂素的生物合成途径,从而实现利用微生物细胞工厂异源生产联苯环辛烯类木脂素以及通过分子选育开发优质新品种的目标。

目的：探讨4-辛基衣康酸(4-octyl itaconate,4-OI)对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的小鼠颅骨溶解的影响。方法：使用CCK-8法检测不同浓度4-OI对RAW 264.7巨噬细胞及小鼠原代骨髓来源巨噬细胞（bone marrowderived macrophages,BMMs）的细胞活性影响；使用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）、细胞免疫荧光和细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒（DCFH-DA）探究不同浓度（12.5μmmol/L和50μmmol/L）4-OI对巨噬细胞炎症反应的影响；使用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色探究4-OI对破骨细胞分化的作用；构建LPS诱导的小鼠颅骨溶解模型，通过micro-CT和组织学切片评价4-OI对炎性骨溶解的治疗效果。结果：CCK-8结果显示，浓度在50μmmol/L以下时，4-OI对RAW264.7巨噬细胞及小鼠BMMs无明显细胞毒性；RT-qPCR及免疫荧光结果显示，4-OI可以浓度依赖性地抑制促炎因子的表达；TRAP染色结果显示，4-OI可有效抑制核因子κB受体活化因子配体（receselleck化学ptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL）诱导的破骨细胞分化；micrimmediate postoperativeo-CT和组织学切片结果显示，4-OI可有效缓解颅骨溶解周围AG-221体外的炎症反应及骨吸收程度。结论：4-OI可有效抑制炎性骨溶解，在口腔颌面部骨溶解疾病的治疗方面具有极大的应用前景。

高性能聚对亚苯基苯并二噁唑(p-phenylenebenzobisoxazole,PBO)纤维具有优异的机械性能(刚度、强度和韧性)、高热稳定性和轻质性,广泛应用于汽车和航空航天复合材料、防弹衣和体育用品等。羟基修饰的PBO(hydroxy-p-phenylenebenzobisoxazole,HPBO)纤维表现出更好的光稳定性和界面剪切强度。HPBO纤维的单体2-羟基对苯二甲酸(2-hydroxyterephthalic acid,2-HTA)通常采用化学方法合成,包括2-溴对苯二甲酸催化水解,即在100℃、碱性环境下,铜粉催化2-溴对苯二甲酸生成2-HTA;Koble-Schmitt反应,温度为230-240℃,在K_2CO_3/CO_2和甲酸钾溶剂存在下,3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid,3-HBA)羧化为2-HTA。化学合成法存在空间选择性差,能耗高等问题。本论文开发了2-HTA的生物合成方法,构建了一条2-HTA的非天然生物合成途径,实现以葡萄糖为原料,利用微生物自身的莽草酸途径合成分支酸,随后分支酸经3-羟基苯甲酸合酶和羟基苯甲酸羧化酶催化最终生成2-HTA。主要工作如下:1.途径中关键催化元件的挖掘。酶促Kolbe-Schmitt反应可将酚类化合物与碳酸氢盐/CO_2反应,生成羟基苯甲酸。课题基于酶促Kolbe-Schmitt反应,筛选羟基苯甲酸羧化酶,以3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid,3-HBA)为底物,在芳香酸羧基的对位进行羧化反应,合成2-HTA。选择不同微生物来源的羟基苯甲酸羧化酶:包括来自米曲霉Aspergillus oryzae的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-Dihydroxybenzoic acid decarboxylase(2,3-DHBD＿Ao),来自尖镰孢Fusarium oxysporum的2,3-DHBD(2,3-DHBD＿Fo)和来自串珠毛孢子菌Trichosporon moniliiforme的水杨酸脱羧酶(SAD＿Tm)作为候选酶,在重组大肠杆菌中表达。采用全细胞催化方法,以3-HBA为底物,进行催化活性的测试。其中来自米曲霉的2,3-DHBD＿Ao显示出最高活性,2-HTA的产量达到108.97±2.21μg/L/mg_(蛋白)。2.进行酶工程改造,提高酶活。模拟2,3-DHBD＿Ao晶体(7WKM)和小分子2-HTA的结合,采用Discovery Studio预测酶的活性中心和结合口袋,对活性中心F193位和结合口袋T62进行突变研究。发现F193残基的苯环为催化所必须,当193位突变为脂肪族氨基酸193I、193L,酶活完全丧失,193Y虽然含有苯环,但是活性寻找更多仅为野生型的43%。T62位的突变为62G、62A、62V,酶活分别提高了3.3、8.2、3.7倍。说明减小结合口袋的空间位阻是提高酶活的有效策略。分析结合口袋的疏水性,发现疏水性与酶活呈正相关,表明酶催化活性受疏水性和空间位阻双重影响。结合理性设计的F27G突变,采用双位点突变F27G/T62A,使2-HTA的产量增加24.7倍,达到2.69±0.029 mg/L/mg_(蛋白)。3.优化酶促Kolbe-Schmitt反应工艺,从头合成2-HTA。首先,采用碳酸氢盐作为C1源,发现0.5 M KHCO_3对大肠杆菌和酵母菌株的生长均有抑制作用。而KHCO3浓度低于0.5 M时,羧化效率大幅度下降。改用CO_2作为C1源,进行胞内2-HTA的生产。在酿酒酵母BY4741中构建2-HTA从头合成途径,表达外源3-羟基苯甲酸合酶Hyg5,2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-immune risk scoreDHBD＿Ao此网站。工程菌株在CO_2环境下,在SC营养缺陷型培养基中发酵培养,48 h时发酵液中2-HTA滴度为5.50±0.71μg/L。4.采用提高生物量、增强中间体胞内积累、提高羧化酶活性等策略,提高2-HTA产量。敲除分支酸下游芳香氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)的合成基因aro7和trp3,可以使得分支酸在胞内积累。因此采用酿酒酵母菌株S228C(△ura3、△aro7和△trp3)作为底盘菌株,表达3-羟基苯甲酸合酶和羧化酶突变体2,3-DHBD＿Ao~(T62A)在CO_2环境中培养36小时合成45.40±0.28μg/L 2-HTA。本论文开发了2-HTA非天然生物合成新途径,为2-HTA工业生产奠定基础,证明了羟基苯甲酸羧化酶在固定CO_2生产对苯二甲酸及其衍生物方面的巨大潜力。

目的 探讨宏基因二代测序（Metagenomic next-generation seqDibutyryl-cAMP作用uencing,mNGS）技术在化脓性脊柱炎病原学诊断中的应用价值。方法 研究纳入自2021-01—2022-03诊治的54例化脓性脊柱炎，将54例标本同时送常规微生物培养及mNGS检测，并比较两种方法检测到的菌种、化脓性脊柱炎病原微生物的阳性检出率、检出时间的差异。结果 54例标本中，常规微生物培养检出32例，阳性率59.2%;mNGS技术检出49例，阳性率90.7%;mNGS组检测阳性率明显高于Tamoxifen细胞培养常规微生物培养组，差异有统计学意义（χ~2=14.272,P<0.001）；检测时间上，mNGS组平均耗时（1.4±0.3）dIn Situ Hybridization，短于常规微生物培养组的（7.3±2.5）d，差异有统计学意义（t=9.436,P<0.001）。结论 对于化脓性脊柱炎患者，采用宏基因二代测序技术能够更准确而且更早地检测出致病微生物种类，能够为化脓性脊柱炎的诊断及精准治疗提供重要的病原学依据，其临床应用价值较大。

目的 调查川东北地区某医学院校大学生精神健康素养的现状及影响因素，为高等院校有针对性地开展医学生精神卫生教育提供依据。方法 采用单纯随机抽样的方法，于STM2457生产商2022年6月在川东北地区某医学院校抽取在校大学生1 000人进行精神卫生与心理保健知识问卷（mental health and mental health knowledge questionnaire,MHMHKQ）、精神疾病有关态度问卷（devaluation-discrimination scale,DDS）调查，并对数据进行分析。结果 在校大学生MHMHKQ平均得分为（15.61±2.68）分，Bioconversion method合格率为93.4%;DDS平均得分为（36.07±5.43）分，合格率为61.2%。不同性别、年级、生源地、是否接受过精神卫生相关知识教育、是否学习过《精神病学》的MHMHKQ得分比较，差异均有统计学意VP-16使用方法义（均P<0.05）；不同年级的DDS得分比较，差异有统计学意义（P<0.05）；不同性别、年级、是否学习过《精神病学》的MHMHKQ合格率比较，差异均有统计学意义（均P<0.05）；不同年级和是否学习过《精神病学》的DDS合格率比较，差异均有统计学意义（均P<0.05）。多元线性回归分析结果显示，性别、年级、是否接受过精神卫生相关知识教育、是否学习过《精神病学》均是影响MHMHKQ得分的独立危险因素。多因素logistic回归分析结果显示，低年级和学习过《精神病学》的学生对待精神疾病患者的态度较好。结论 川东北地区某医学院校大学生具备较高的精神健康素养，精神卫生与心理保健知识掌握情况总体较好，尤其是女性、低年级、城镇生源、接受过精神卫生相关知识教育的学生，但对精神疾病的态度仍有待提高。学校应加强非医学专业学生的精神健康教育，传播精神卫生相关知识，以达到提高精神健康素养的目的。

目的 运用CRUSADE评分系统，探讨质子泵抑制剂在预防经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后消化道出血中的价值。方法 前瞻性纳入华北医疗健康集团峰峰总医院心内科2018年3月—2021年12月收治的接受支架植入治疗的冠心病患者600例，依据CRUSADE评分系统的危险分层，把极低危、低危的归为低危分层www.selleck.cn/products/Paclitaxel(Taxol)组，中危、高危、很高危的归为中高危组，各危险分层按1∶1比例随机分为对照组与试验组，各组患者在image biomarkerPCI术前、术后均给予阿司匹林肠溶片、硫酸氢氯吡格雷片口服，试验组在此基础上给予联合质子泵抑制剂（雷贝拉唑肠溶片每天20 mg或泮托拉唑钠肠溶片每天40 mg）自PCI术前至术后连续服药3个月。随访12个月，观察各组患者消化道出血事件以及主要心脑血管不良事件发生情况。结果 根据CRUSADE评分的不同，中高危分层对照组较低危分层对照组的消化道出血事件明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。同时，与低危分层对照组相比，低危分层试验组消化道出血事件发生率未见明显差异（P>0.05）。中高危分层试验组消化道出血事件发生率较中高危分层对照组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。在同一类CRUSADE评分系统危险分层中，试验组和对照组患者主要心脑血管不良事件发生率未见明显差异（P>0.05）。结论 应S63845分子式用CRUSADE评分系统进行危险分层，干预出血高危风险患者，PCI术后加用质子泵抑制剂可有效预防消化道出血，且未增加心脑血管不良事件风险。

结构复杂的天然产物是现代药物研发的重要源泉,在农业和医药应用中发挥着重要作用。对天然产物生物合成途径的解析,特别是对合成途径中关键酶的解析,不仅可以发现催化复杂反应的新型酶,作为合成生物学底盘元件应用于微生物细胞工厂,还可以用于构建仿生途径从而实现活性天然产物及其衍生物的异源高效合成。本论文针对课题组前期在植物内生真菌Cercospora sp.JNU001首次发现的复杂蒽醌类天LY2157299化学结构然产物贝第高林(beticolin)的生物合成基因簇(BTG),对其生物合成过程中关键酶的催化机制进行研究,实现了贝第高林生物合成途径的解析,并对其中部分关键酶进行理性改造,实现了药物中间体手性醇的合成。具体研究结果如下:1.解析了贝第高林生物合成过程中蒽酚还原酶BTG9催化大黄素还原的机制首先,对贝第高林生物合成途径中的蒽酚还原酶BTG9的催化特性进行研究,表明BTG9可以在无氧条件下高效地将大黄素对苯二酚还原为(R)-3,8,9,10-tetrahydroxy-6-methyl-3,4-dihydroanthracene-1(2H)-one(2),产物ee值大于99%,K_m值和k_(cat)值分别为0.2 m M和102.51 min~(-1)。此外,BTG9对雌酮(3a)及其类似物也表现出一定的催化活性。随后,为了揭示其催化机理,解析了BTG9-NADP~+和BTG9-NADP~+-大黄素的复合物晶体结构,发现处于氨基酸序列中的209-216柔性loop区域在底物识别和结合中发挥重要作用,其中的氨基酸残基Tyr210通过与His162形成氢键相互作用从而识别、结合和稳定底物,确保底物能够以催化构象稳定结合在BTG9的结合口袋中而获得单一手性的产物。2.基于BTG9的蛋白结构进行理性改造,实现了光学纯2,2-二取代-3-羟基环酮和β-卤代醇的合成为了进一步挖掘BTG9的催化能力,以实现复杂药物中间体光学纯2,2-二取代-3-羟基环酮和β-卤代醇的合成,首先以2-methyl-2-(4-methylbenzyl)cyclopentane-1,3-dione(5a)为模式底物,开展基于BTG9蛋MRTX849配制白结构的理性改造。实验表明通过突变Tyr210和His162而破坏潜在的氢键作用的三种突变体(BTG9-H162F、BTG9-Y210A和BTG9-Y210F),都能够催化底物5a合成光学纯的2,2-二取代-3-羟基环酮产物。相较于野生型,三种突变体均对底物5a的催化活性明显提升,其中最优突变体BTG9-H162F的催化效率是野生型的45倍。随后,对突变体BTG9-H162F的应用潜力进行进一步拓展,发现突变体BTG9-H162F不仅有效地将多种2,2-二取代-1,3-环二酮还原为光学纯2,2-二取代-3-羟基环酮(dr>99/1,ee>99%),而且也能将α-卤代苯乙酮转化为光学纯的β-卤代醇(ee>99%)。为了解释突变体BTG9-H162F催化2,2-二取代-1,3-环二酮和α-卤代苯乙酮获得相应光学纯产物的机理,分别解析了突变体BTG9-H162F-NADP~+-5a和BTG9-H162F-NADP~+-2-bromo-1-(4-bromo-2-hydroxyphenyl)ethan-1-one(6e)的复合物晶体结构,阐明了各自的立体选择性机制,这些研究结果为其它蒽酚还原酶催化机理研究和分子改造提供了基础。3.发现了一种新型非血红素铁依赖型金属酶BTG13,并解析其催化贝第高林生物合成过程中蒽醌环裂解的机制为了解析贝第高林生物合成过程中大黄酚蒽醌环裂解机制,通过生物信息学分析和体外实验,确认了来源于Cercospora sp.JNU001的BTG13是一种Questin氧化酶,参与催化大黄酚蒽醌环的裂解。为了揭示BTG13催化大黄酚蒽醌环断裂的机理,利用单波长反常散射法解析并获得了BTG13的晶体结构。通过电子密度图分析,发现BTG13的活性中心由His55、His158、His296、His374、潜在修饰的Lys377和水分子配位一个金属离子构成。为了确定金属离子种类,首先利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对纯化的BTG13进行分析,发现Fe~(2+)的比重最大,初步确定配位的金属离子为Fe~(2+);随后利用螯合剂EDTA对纯化的BTG13进行处理,通过不同金属离子的回补,结合生化实验,确定配位的金属离子为Fe~(2+)。随后,通过电子云密度图的构象分析和体外生化验证,确认活性中心的Lys377通过羧化反应形成羧化赖氨酸(Kcx377)参与配位。以上结果阐明了BTG13是一种尚未报道的新型非血红素铁依赖型金属酶。随后,通过晶体结构分析和突变验证,发现Thr299和His58会与Kcx377形成氢键作用,对BTG13的催化活性起到调节作用。最后,为了研究BTG13的底物识别机制,利用分子对接获得了BTG13与底物结合的surgical site infection模型,并通过突变体活性验证发现Arg48、His53、Phe292以及His181在BTG13的底物识别和结合中起关键作用,其中His53与底物反应位点的距离最近,可作为质子受体直接参与催化反应,并基于上述结果提出了BTG13催化蒽醌环裂解的酶促反应机制。

研究背景:恶性肿瘤严重威胁人类健康和生命。化疗是其主要治疗手段之一。肿瘤内药物递送屏障严重降低了药物的肿瘤基质转运效率及血管转运效率,从而阻碍了药物高效渗透到肿瘤细胞,导致药物递送效率低,不能有效杀死肿瘤细胞,反而容易引起肿瘤复发、进展和耐药。肿瘤药物递送障碍包括肿瘤病态血管及肿瘤内致密的细胞外基质。针对不同的肿瘤药物递送障碍陆续出现了相应的多种干预治疗方法,包括针对肿瘤病态血管的血管正常化策略,针对肿瘤内细胞外基质主要成分(如透明质酸)的抑制合成、促进分解策略以及一些机械破碎和热疗方法来破坏肿瘤内致密基质屏障作用等等。虽然不同治疗策略都在动物或临床试验中取得了一定的研究成果,但仍暴露出缺乏靶向性的问题,导致出现一些毒副作用而限制了部分药物的临床应用等问题。因此,如何更好地解决肿瘤内药物递送屏障问题以提升药物递送效率、减少毒副作用,仍是临床医生抗肿瘤治疗需要解决的巨大难题,有待大量的基础研究和临床应用的探究与检验。希望通过这些不断的努力以及新的改进、探索,肿瘤药物递送障碍问题最终能被解决,使得用更低的药物剂量就能达到较好的抗肿瘤治疗效果、毒副作用更低,最终使病人的生存率和生活质量得到显著改善。研究目的:1.合成一种新型高效靶向纳米化疗药物c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX,靶向肿瘤并降解其致密基质中大量的透明质酸而解除肿瘤致密基质屏障作用,从根本上提高药物递送效率,以达到更好的抑瘤效果。对其进行一系列表征,并评估新型纳米化疗药物的水溶性、稳定性及酶活性,计算载药量和包封率等。2.评估比较c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX在生理和酸性p H条件下的体外药物释放效率情况。3.评价c(RGDyK)-HAase-IONP纳米载体的肿瘤细胞靶向性,评估c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX纳米药物及相应纳米载体的细胞毒性作用。4.探讨c(RGDyK)-HAase-IONP的体内靶向性、生物分布及瘤内的递送效果,评价该新型高效靶向纳米化疗药物抗肿瘤治疗效果及体内生物安全性。研究方法:1.首先构建高效靶向纳米药物载体c(RGDyK)-HAase-IONP,再通过物理包埋的方式将疏水性化疗药物DOX装载到IONP两亲性聚合物涂层的疏水空间中,制备出能够解除肿瘤致密基质屏障的高效肿瘤靶向纳米化疗药物c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX。应用TEM、DLS、电位分析仪及荧光分光光度计等表征其形态、粒径、电位及吸收和发射光谱。通过浊度法验证c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX的酶活性。利用HPLC测定DOX的载药量和包封率。此外,我们还将其分别溶解到生legacy antibiotics理盐水、水、PBS和含10%FBS的DMEM培养基中,在室温静止存放7天后,测定其流体动力学尺寸及粒径分布,探究其在不同生理性分散介质中的可溶性及稳定性。2.将高效靶向纳米化疗药物c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX溶于p H分别为7.4和5.5的PBS缓冲溶液中,并将其转移至透析袋内。再将透析袋沉浸在装有20 m L相应selleck Barasertibp H的PBS溶液的离心管中,并用37℃恒温摇床轻微摇动。在每个预先设定的时间点,从20 m L PBS溶液中取出0.2 m L溶液此网站待测,并用等量相应PBS补充。通过HPLC测定并计算出每个时间点DOX的累积释放量,并分析研究两组药物释放效率的变化情况,以评估c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX在生理性和酸性p H条件下的体外药物释放效率。作为对照,单纯DOX和IONP/DOX的药物释放情况也用上述方法进行了研究。3.为了研究新型纳米载体c(RGDyK)-HAase-IONP的靶向性,我们选用鼠源结肠癌细胞MC38,分别用近红外荧光染料ICG标记的c(RGDyK)-HAase-IONP及ICG标记的IONP进行孵育。为了进一步验证c(RGDyK)对肿瘤细胞的靶向性,我们设置了c(RGDyK)阻断组。通过共聚焦显微镜观察各组细胞靶向性结合情况。在细胞毒性实验的研究中,我们采用在对数生长期、生长状况良好的鼠源结肠癌细胞MC38进行了研究,毒性实验分为四组:单纯DOX组,IONP/DOX组,HAase-IONP/DOX组和c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX组。我们分别用0.1、10、100、200、300和900 ng/m L的药物(DOX)浓度进行毒性研究,通过各组不同处理及孵育后,分别加入含10%Alamar Blue的培养基溶液100μL,培养约3小时后,用酶标仪测量590 nm处吸光度值。并计算不同浓度药物作用下细胞存活率。此外,各纳米载体对MC38的细胞毒性实验也用相同的方法进行了研究。4.构建MC38荷瘤小鼠模型。首先,我们对MC38肿瘤组织进行透明质酸抗体染色以表明肿瘤ECM中大量透明质酸的存在,为HAase的引入干预策略提供实验依据。而后,为了进一步确定不同纳米载体在肿瘤内的作用效果及瘤内具体分布情况,将荷瘤小鼠随机分为三组:ICG-IONP组、ICG-HAase-IONP和ICG-c(RGDyK)-HAase-IONP组,分别经尾静脉注射ICG标记的相应纳米载体(IONP的量为400 pmole)100μL。尾静脉注射后24小时在异氟烷麻醉下应用小动物活体成像系统进行体内荧光信号检测,以观察比较三组纳米载体在荷瘤小鼠体内的肿瘤靶向性、瘤内累积和生物分布情况。在瘤内递送效果及定位分析研究中,我们对冷冻的肿瘤组织切片进行HE染色,以观察肿瘤的组织形态,并进行相关分子标记物(CD31、CK19)的免疫荧光染色以便于更直观地分析纳米载体与血管和肿瘤细胞之间的位置关系,并使用荧光共聚焦显微镜与近红外荧光信号共聚焦,以定位不同ICG标记的纳米载体的瘤内分布。我们同样使用MC38荷瘤小鼠模型进行新型高效靶向纳米化疗药物抗肿瘤治疗效果的评估。将荷瘤小鼠随机分为五组:(1)单纯DOX组,(2)IONP/DOX组,(3)HAase-IONP/DOX组,(4)c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX组,(5)生理盐水对照组,每组5只。隔天监测肿瘤体积及小鼠体重,并在初次治疗后第16天处死小鼠,取各组小鼠的肿瘤及主要器官进行HE染色、Ki67、cleaved caspase-3及透明质酸抗体的组织学免疫荧光染色及分析,评估各组的抗肿瘤治疗效果及体内生物安全性。研究结果:1.成功构建了能够解除肿瘤致密基质屏障作用的靶向纳米载体c(RGDyK)-HAase-IONP,并成功装载了疏水化疗药物DOX,制备出高效靶向纳米化疗药物c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX。c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX的水合粒径约为27nm,粒径较均一,Zeta电位约为6.5 m V,在不同生理性溶液中均展示出良好的稳定性,载药量为21.7%。我们也通过浊度法证明了c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX的酶活性。2.在体外药物释放实验中我们发现,与单纯DOX相比,c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX能够有效地缓释药物,并且在生理和酸性p H条件下展示出不同的药物释放效能。在p H为5.5的酸性条件下,药物释放速率更快,累积药物释放量更高,这将有利于在肿瘤酸性微环境下快速高效地释放药物。3.体外细胞靶向性摄取实验表明,新型高效靶向纳米载体c(RGDyK)-HAase-IONP对MC38肿瘤细胞具有良好的主动靶向作用,从而增加药物向肿瘤细胞的靶向递送,以提升抑瘤疗效、减少毒副作用。在体外细胞毒性实验中,我们证明了本研究中应用的纳米载体剂量对细胞没有毒性作用,具有良好的生物安全性;DOX封装在新型高效靶向纳米载体c(RGDyK)-HAase-IONP中不影响其细胞毒性作用,c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX能够有效抑制MC38肿瘤细胞的生长,具有良好的体内抗肿瘤治疗应用前景。4.MC38肿瘤组织切片的透明质酸抗体免疫荧光染色证实了肿瘤细胞外基质中有大量透明质酸存在,这将阻碍抗肿瘤药物高效递送到肿瘤细胞中,同时该实验结果也为本研究中引入HAase解除肿瘤致密屏障作用的策略提供了实验基础的支持。在体内荧光成像中,c(RGDyK)-HAase-IONP展示了良好的肿瘤靶向性,可以更多的在肿瘤部位聚集,并通过与血管染色的共定位,确定了c(RGDyK)-HAase-IONP不仅在肿瘤中高度积累,而且能够有效地渗透到远离血管的深层位置,从而可将药物递送到更多的肿瘤细胞中,有利于药物的全面起效,以改善抗肿瘤治疗效果。在体内疗效评估中,我们从多个角度证明了c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX治疗组显著抑制了肿瘤的生长、抗肿瘤治疗效果最佳,并通过组织学实验证明了其能够有效降解肿瘤内致密透明质酸屏障,且具有良好的体内安全性。结论:在本研究中,我们通过c(RGDyK)的修饰提升了IONP的肿瘤靶向性,并引入HAase以降解肿瘤细胞外基质中大量的透明质酸屏障,成功构建了一种新型高效靶向纳米载体c(RGDyK)-HAase-IONP,并装载疏水性化疗药物DOX,获得了能够解除肿瘤致密基质屏障的靶向纳米药物c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX。我们通过一系列表征实验证明了c(RGDyK)-HAase-IONP/DOX的成功构建,且展示了良好的水溶性和稳定性。并通过体外、细胞及动物实验研究了其靶向性、瘤内递送情况、抗肿瘤治疗效果及体内生物安全性。该新型高效靶向纳米药物具有良好的肿瘤靶向性,能够有效降解肿瘤内致密透明质酸、破除其药物递送屏障作用,提升肿瘤部位、尤其是远离血管的肿瘤深部的药物递送效果,从而从根本上改善抗肿瘤疗效。