Achr receptor

目的：了解健康大学生尿道外口酵母菌带菌率、菌种分布及其对常用抗真菌药PF-07321332核磁物MK-2206的敏感性。方法：随机抽取云南省某高校健康大学生261名，采集尿道外口拭子进行酵母菌分离培养、鉴定和药物敏感性实验并进行统计分析。结果：分离出酵母菌39株，总携带率为14.9%;261份标本中男性130份、女性131份，男性标本分离出酵母菌6株，携带率为4.6%，女性标本分离出酵母菌33株，携带率为25.2%，不同性别人群携带率差异有统计学意义（χ~2=21.73,P=0.005）;39株酵母菌中白假丝酵母菌11株（占28.2%）、光滑假丝酵母菌24株（占61.5%）、其他假丝酵母菌4株（占10.3%）。分离出的酵母菌对氟康唑、氟胞嘧啶和两性霉素B的药物敏感性几何均数分别为22.03、0.16、4.37μg/mL，耐药率分别为15.4%、0.0%和100.0%。结论：健康大学生尿道外口酵母菌携带种类较少，以光滑假丝酵母菌为主；女性尿道外口Medical hydrology酵母菌携带率显著高于男性；部分酵母菌对常用抗真菌药物存在天然耐药现象。

历史上,RNA病毒曾多次引发人类、动物公共卫生事件,如1918年西班牙大流感、2003年非典、2014年西非埃博拉疫情以及最近的COVID-19等,其严重威胁了人类生命健康,阻碍了社会经济的发展。由于RNA病毒变异能力强,导致相关疫苗、药物研发难度大。本研究关注了两种典型的新发RNA病毒,发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)和新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2),围绕其与宿主的互作机制展开了相关研究。SFTSV是2009年在中国首次发现的一种新型蜱传布尼亚病毒,其分布广,致病率高,且发病率呈现逐年上升的趋势。SARS-Co V-2引发的COVID-19疫情更是肆虐全球,对世界公共卫生和经济体系造成严重冲击。虽然关于这两种病毒感染的分子机制已有很多研究,但是具体致病机制仍不明晰,有待进一步的研究。病毒-宿主互作的研究不仅可能加深对病毒感染机理的理解,也可能拓展对宿主响应与调控机制的认识,进而可能为靶向宿主的抗病毒干预策略研发提供新线索。本论文主要对宿主因子DDX1(DEAD-box RNA helicase 1)与上述两种新发RNA病毒(特别是病毒核衣壳蛋白)的相互作用开展了一系列功能与机理的研究。核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)是病毒的关键结构蛋白,参与病毒转录复制,并且可能参与调节宿主蛋白和一些生物学过程,或者反过来被宿主调节,从而影响病毒感染和发病的进程,是开发抗病毒研究的热门靶点之一。DDX1是一种依赖于ATP的RNA解旋酶,除了参与RNA代谢外,还可能正向或负向调控多种病毒复制。目前,DDX1与SFTSV和SARS-Co V-2的互作关系尚不清楚。基于此,我们以病毒关键结构蛋白N为切入点,研究了N与宿主的相互作用组,重点解析了宿主因子DDX1与N互作的功能与机理。具体内容如下:本研究首先关注了SFTSV与宿主因子DDX1的相互作用。我们通过过表达、敲低、敲除实验,证明了DWatch group antibioticsDX1是一种SFTSV的宿主限制因子,抑制了病毒复制和蛋白表达。机制研究发现,DDX1的C端结构域可能是抗SFTSV活性的关键结构域,且DDX1抗SFTSV活性可能不依赖其ATP酶和RNA解旋酶活性。在DDX1敲除的细胞系中,SFTSV诱导的IFN-β和TNF-α水平更低,提示DDX1可能通过诱导天然免疫反应来抑制SFTSV。同时对SFTSV与DDX1相互作用进行分析,发现DDX1以一种不依赖于RNA的方式与N相互作用,且DDX1的D1结构域可能是与N互作所必需的。微基因组报告系统实验,表明DDX1可能影响RNP活性,提示DDX1可能也可以直接靶向N,影响N的功能,从而抑制SFTSV。本研究还观察到DDX1与SFTSV的依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp)以及非结构蛋白(non-structural protein,NSs)存在相互作用,说明selleck HPLCDDX1与SFTSV之间的相互作用较为复杂,并非只依赖于N。NSs作为SFTSV一个重要毒力因子,免疫荧光结果显示,NSs劫持DDX1到包涵体中,这可能干扰DDX1抗病毒功能,具体的机理有待进一步研究讨论。总结来说,DDX1可能是通过诱导干扰素响应以及直接靶向SFTSV N等病毒复制机器蛋白两个途径发挥抗SFTSV功能,同时SFTSV可能利用NSs劫持DDX1到“包涵体监狱”中,逃逸DDX1的抗病毒功能,两者之间相互博弈。本研究同时还以SARS-Co V-2 N蛋白为研究对象,通过高特异性亲和纯化(S-pulldown)结合液相质谱分析(LC-MS)建立了SARS-Co V-2 N相互作用组。生物信息学分析表明,这些宿主因子主要参与翻译调控、病毒转录、RNA过程、应激反应、蛋白质折叠和修饰、炎症/免疫信号通路等,与N在病毒感染中的作用相符。通过生信分析和文献检索,挖掘了这些宿主因子中可能存在的药物靶点和靶向药物,生成了药物-宿主蛋白网络。并据此筛选鉴定了一种新的抗病毒小分子药物anisomycin,发现其可以有效抑制SARS-Co V-2Lapatinib小鼠复制,呈现剂量依赖效应,IC50为6.785μM,且细胞毒性低,CC50大于1000μM。此外,实验发现宿主因子DDX1可能与N多个结构域存在相互作用。功能丧失实验表明,DDX1可能是一种有效的抗SARS-Co V-2宿主因子,抑制病毒复制和蛋白表达。这些数据进一步描述了N与细胞的相互作用,可能为理解SARS-Co V-2感染、致病提供了新的线索,并可能有助于开发新的候选治疗方法。综上,本研究以新发RNA病毒SFTSV和SARS-Co V-2为研究对象,分析了这些病毒的关键结构蛋白N与宿主的相互作用,重点解析了宿主因子DDX1通过与N互作进而可能调控病毒感染的功能与机理。此外,还根据病毒N-细胞互作的认识,筛选鉴定了潜在的抗新冠病毒药物。本研究拓宽了对宿主因子DDX1功能的认识,加深了对SFTSV和SARS-Co V-2与宿主互作机制的理解,可能为后续药物、疫苗研发提供了理论基础。

目的:抑郁症是一种严重的精神疾病,预期到2030年,抑郁症将是全球死亡的首要原因?抑郁症的病因很复杂,主要包括单胺类?神经营养因子?神经传递?线粒体功能障碍?神经炎症和肠脑轴等因素,神经炎症目前被认为在抑郁症中起重要作用,同时也被认为是抗抑郁的新治疗方法?饥饿激素(Ghrelin)可抑制神经炎症,从而可以很大程度上对脂多糖(LPS)诱导的小鼠抑郁样行为起到改善作用,本研究旨在评估Ghrelin对抑郁行为的影响,通过建立LPS诱导的炎症相关抑郁模型小鼠,来探索Ghrelin对抑郁样行为改善作用机制的研究,这可能为临床上治疗抑郁症提供新思路?方法:临床实验:选择37名符合抑郁症诊断标准的患者作为抑郁组,另外还选择了37名健康人群作为对照组,经过临床资料对比后,然后采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定Ghrelin、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的水平。动物实验:选取60只健康雄性C57BL/6小鼠,随机分为6组,每组10只老鼠,依次为对照组、抑郁模型组(0.83mg/kg)、氟西汀组(10mg/kg)、Ghrelin低剂量组(5 nmol/kg)、Ghrelin中剂量组(12nmol/kgSB431542)、Ghrelin高剂量组(30 nmol/kg)。通过对小鼠腹腔注射LPS建立炎症相关的抑郁模型,同时探究Ghrelin对抑郁样行为改善作用机制的研究:1、在LPS造模成功后,对小鼠进行行为学测试(TST、FST);2、ELISA方法检测小鼠血清、海马及前额叶皮质中5-HT、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。结果:1、与对照组相比,抑郁组患者血清中5-HT水平明显降低(P<0.01),而血清中Ghrelin及炎性因子水平(IL-1β、IL-6、TNF-α)均明显升高(P<0.01)。2、与对照组相比,抑郁模型组小鼠TST、FST中相对不动时间显著延长(P<0.01);与抑郁模型组比较,氟西汀组、Ghrelin各剂量组小鼠TST、FST中相对不动时间显著降低(P<0.01),相对不动时间随Ghrelin给药剂量增加而降低,呈剂量依赖性,且Ghrelin高剂量组与氟西汀组药效相当。3、与抑郁模型组相比,氟西汀组、Ghrelin各剂量组小鼠血清中5-HT水平升高(P<0.01),5-HT水平随Ghrelin给药剂量增加而升高,呈剂量依赖性;与抑郁模型组相比,Ghrelin各剂量组小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.01),炎性因子水平随Ghrelin给药剂量增加而减低,呈剂量依赖性,且Ghrelin高剂量组与氟西汀组药效相当。4、与抑郁模型组相比,氟西汀组、Ghrelin中、高剂量组小鼠前额叶皮质中5-HT水平升高(P<0.01),5-HT水平随Ghrelin给药剂量增加而升高,呈剂量依赖性;与抑郁模型组相比,Ghrelin各剂量组小鼠前额叶皮质中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.01),炎性因子水平随Ghrelin给药剂量增加而减低,呈剂量依赖性,且Ghrelin高剂量组与氟西汀组药效相当。5、与抑郁模型组相比,氟西汀组、Ghrelin各剂量组小鼠海马中5-HT水平升高(P<0.01),5-HT水平随Ghrelin给药剂量增加而升高,呈剂量依赖性;与抑郁模型组相比,Ghrelin各tumour biomarkers剂量组小鼠海马中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.01),炎性因子水平随Ghrelin给药剂量增加而减低,呈剂量依赖性,且Ghrelin高剂量组与氟西汀组药效相当。结论:1.抑郁患者血清中炎性因子水平(IL-1β、IL-6、TNF-α)增加,提示炎症反应参与了抑郁症的发生发展过程。2.Ghrelin可以显著改善LPS诱导的小鼠抑郁样行为。3.Ghrelin对LPS诱导的小鼠抑郁样行NVP-TNKS656 molecular weight为的改善作用,可能是通过抑制海马、前额叶皮质中的炎症因子释放而发挥作用。

全球每年约有150万吨纳米材料废物进入环境,危害人类健康。纳米颗粒组成的超细颗粒物极容易悬浮在空气中,被人类吸入。因此肺部是纳米颗粒进入人体的主要途径,和其毒性作用的主要靶器官。面向纳米呼吸暴露导致的”人民生命健康”重大需求,需要发展纳米材料肺部健康风险高效评估方法。依赖活体动物实验的评价方法具有伦理问Dolutegravir IC50题、效率低下和机理不明等局限性。亟需发展计算毒理学模型替代动物实验。本研究基于高通量细胞测试和动物实验,构建了涵盖37种纳米材料理化性质、细胞毒性和动物毒性的数据库;开发了预测纳米材料诱导免疫细胞死亡和炎症效应的机器学习模型,测试集预测准确率分别达到96%和90%;模型的实验验证方面,选择了建模数据集范围之外的新材料对其免疫细胞毒性和炎症效应分别进行实验检测,然后将实验数据与两个模型预测结果相比对。经验证,免疫毒性和炎症效应模型对全新的实验数据预测准确率高达91%和86%。结构-效应关系分析和细Nirogacestat使用方法胞内成像实验结果共同表明,溶酶体中释放的有毒离子是MeONPs诱导免疫细胞毒性的重要决定因素。材料的ζ-电位、电负性和尺寸也是预测纳米毒性的关键特性。机器学习分析、密度泛函理论(DFT)计算和实验结果共同说明,细胞摄取,溶酶体损伤及组蛋白酶cathepsin B释放是金属氧化物造成炎症的关键事件。本研究通过人工智能和机器学习实现了金属氧化物诱导免疫毒性和炎症效应的高通量准确预测,并识别和证明了毒性机理。该研究开发的软件平台操作便利,可实现大批量纳米产品风险预测,为未来实现以计算模拟替代大规模动物实验SARS-CoV2 virus infection提供了可能。

探讨白果内酯(BB)通过抑制巨噬细胞/小胶质细胞炎症反应、促进神经营养因子分泌、干预外周免疫中CD4~+ T细胞活化分化，从而发挥神经保护作用及其机制。以质量浓度梯度为12.5、25、50、100μg·mDolutegravir小鼠L~(-1)的BB干预RAW264.7与BV2细胞，采用MTT、CCK-8法检测BB的细immediate hypersensitivity胞毒性并选取合适的药物浓度进行后续实验。分别以脂多糖(LPS)诱导RAW264.7、BV2细胞、小鼠骨髓巨噬细胞、原代小胶质细胞建立炎性模型，并使用ELISA法检测BB对细胞增殖、炎STM2457临床试验性因子和神经营养因子分泌的影响。选取7～8周龄C57BL/6雌性小鼠分离脾脏单核细胞，无菌条件下磁珠分选CD4~+ T细胞，用骨髓巨噬细胞模型中的条件培养基与CD3/CD28诱导分化Th17细胞，ELISA法检测上清中IL-17细胞因子含量，以测定对CD4~+ T细胞活化分化程度的影响。另将骨髓巨噬细胞与原代小胶质细胞模型中的条件培养基，孵育PC12细胞，观察细胞数量和形态，并用LDH法测定细胞毒性，结果显示BB在12.5～100μg·mL~(-1)对RAW264.7与BV2细胞无细胞毒性，对低炎症模型细胞的活性亦无明显影响。选取BB 50μg·mL~(-1)进行实验，结果显示BB可抑制LPS诱导的炎症细胞模型中炎性因子的分泌。使用条件培养基进行干预的CD4~+ T细胞模型实验，结果显示LPS诱导的骨髓巨噬细胞炎症模型条件培养基能够促进CD4~+ T细胞的活化分化，而进行BB药物干预的实验组条件培养基降低了CD4~+ T细胞的活化分化程度。另外，BB也可以促进骨髓巨噬细胞与原代小胶质细胞神经营养因子的释放，且BB干预后的条件培养基可显著减少PC12神经元的死亡，抑制神经元损伤，保护神经元。综上表明，BB通过抑制骨髓巨噬细胞与小胶质细胞介导的炎症反应，促进神经营养因子分泌，发挥神经保护作用。

在乳腺癌治疗中化疗是一种非常常见的方式,但化疗药物选择性低,会对人体造成不受控的损伤。开发生物相容性优秀、体内稳定性高、治疗效果强且对癌细胞具有靶向作用的药物载体具有重要的意义。本文在多肽链段中设计不同功能氨基酸序列制备多功能纳米线(PNFs),并与二甲双胍药物碳点(CDs)及八臂聚乙二醇(8-PEG)水凝胶微球结合负载阿霉素(DOX),最后构建应用于乳腺癌治疗的兼具细胞靶向识别以及协同治疗的复合型药物控释系统。具体内容如下:(1)制备用于载药的可降解且对细胞无危害的水凝胶微球。采用简易的乳液聚合法,以氨水作为交联剂,与单体进行迈克尔加成反应得到8-PEG水凝胶微球。该微球具有均匀的球形形貌以及内部网络结构,经过Image J软件得到微球平均尺寸为6.66μm,尺寸适用于注射治疗。另外,探究了不同单体比例、乳化剂质量比、交联剂含量和机械搅拌速度对微球尺寸的影响。研究发现,8-PEG与PEG的比例与微球尺寸成反比,交联剂含量以及搅拌速度与微球尺寸成正比,乳化剂的含量和成分主要影响微球的分散性。制备的水凝胶微球具有较好的溶胀性能和稳定性,在p H=6.6、p H=7.4以及p H=8下均具有较好的降解性能。细胞毒性实验证明,其还具有较好的生物相容性、较低细胞毒性,具备作为药物载体的功能条件。(2)制备了基于水凝胶微球的乳腺癌协同及靶向治疗的药物载体。设计序列为RGD-AEAKAEAK-YWYAF-CCY-RGD的多肽序列制备多功能PNFs,通过π-π共轭连接CDs后,以CCY中的巯基与8-PEG水凝胶微球的双键发生点击反应,制备了具有生物相容性、可降解性、药物协Bioactive coating同增强效果、靶向癌细胞特性的药物载体。DOX作为乳腺癌的治疗药物负载在载体上,药物负载率达90%。在药物释放实验中,p H=6.6和p H=7.4下的最高释放量分别为38.8%和27%。以MDA-MB-231作为实验细胞,证明药物载体及其功能组分对细胞均具有较好的生物相容性,细胞存活率均在80%以上。以药Tamoxifen体内实验剂量物浓度为基准,进行浓度梯度实验测试对乳腺癌细胞杀伤性。研究表明PEG/PNFs-CDs作为药物载体时释放药物对MDA-MB-231细胞的治疗具有最好的效果。在不载药时,含有CDs的材料对癌细胞的杀伤效果最好。PEG/PNFs做载体时效果远低GSK J4纯度于PEG/PNFs-CDs,证明CDs与DOX存在药物协同作用,因此治疗效果大大增强。通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪测试药物载体的靶向效果,将含有与不含RGD的多肽纳米线做对比,以Cy5.5作为成像因子。通过对比两者连接微球载体在细胞中的内吞效果以及荧光强度,证明载体的靶向效果,可以实现较好的治疗效果,具有较好的应用前景。

目的 分析米氮平联合团体生物反馈治疗伴焦虑症状的抑郁症心理的影响。方法 纳入2021年5月～2022年7月本院收治的120例伴有焦虑症状的抑郁症患者，采用随机数字表法将研究此网站对象分为对照组（60例）和治疗组（60例），两组均给予米氮平治疗，治疗组在药物治疗基础上联合团体生物反馈治疗。观察两组患者抑郁程度、汉密尔顿抑郁量表（HAMD）相关因子、精神性与躯体性焦虑症状评分及血清学指标。正态计量资料采用t检验。结果 治疗后，治疗组各项抑郁程度平均降低，且治疗组HAMD、汉密尔顿焦虑量表（HAMA）评分均显著低于对照组（P<0.05）；对照组焦虑/躯体化、体质量、认知障碍、迟缓、睡眠障碍均高于治疗组，差异Tezacaftor采购有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，在各个治疗阶段治疗组的精神性和躯体性指标评分均显著低于对照组（P<0.05）；治疗后，治疗组神经生长因子（NGF）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平显著低于对照组，检测指标涉及神经肽Y(NPY)、脑源性神经营养因子（BDNF）水平显著高于对照组（P<0.05）。结论 Symbiont-harboring trypanosomatids米氮平联合团体生物反馈治疗伴焦虑症状的抑郁症患者能够降低抑郁程度。

全球变暖导致高温胁迫频发,极大地影响了全球作物的产量。棉花作为世界上最为重要的经济作物之一,高温胁迫导致其雄性不育,造成严重减产。因此,深入研究棉花雄性发育过程并解析其响应高温的分子机制,对创制耐高温棉花新种质具有重大意义。本研究利用棉花高温最敏感的四分体时期花药进行了单细胞转录组和单细胞染色质开放性测序,构建了棉花中首张正常条件和高温胁迫下的单细胞水平的花药细胞类型发育全景图,分析了高温胁迫下棉花花药各类细胞的特异表达情况及其表观修饰变化情况,发现了高温下花药的不同组织细胞会共同开启逆境响应相关转录因子的结合基序的染色质,特异关闭发育相关转录因子结合基序的染色质,进而诱发逆境响应基因表达的上调和花药发育特异时期基因下调表达,从而增强对抗高温胁迫的能力。进一步我们揭示出一条在高温胁迫下的棉花雄性育性调控的新途径:即GhMYB66-GhMYB4-GhCKI调控途径,为后续培育抗高温棉花新种质提供了理论基础,具有重要的应用价值。本研究的具体结果如下:(1)常温和高温下棉花花药单细胞转录组和单细胞染色质可及性图谱构建。首先,通过优化细胞核提取过程,摸索出了一种可以快速提取棉花花药高质量细胞核的技术。利用该技术提取了敏高温棉花品系“H05”的常温和高温下四分体时期花药细胞核,分别获得17,732和15,906个高质量细胞,进行了单细胞转录组测序,完成了棉花花药单细胞表达图谱的构建,并成功分检出花药组织中所有的细胞类型,发现棉花花药各层细胞间具有高度的表达异质性。Landfill biocovers通过细胞类型之间的差异表达分析和RNA原位杂交实验,鉴定到了大量细胞类型特异的标记基因,填补了花药中多数细胞类型缺乏标记基因的空白。随后基于表达图谱,对减数分裂细胞、中层细胞、绒毡层细胞分别进行了拟时序分析,重构出了单细胞水平下的减数分裂过程,发现四分体时期绒毡层细胞间的表达也具有明显的异质性,且不同拟时间簇的绒毡层细胞具有不同的生物学功能。通过构建了绒毡层发育过程中转录因子间的调控网络,发现一些在绒毡层发育过程中起重要作用的转录因子如MYB4、MYB52、ZFN1等。此外,根据中层的拟时序和高精度半薄切片结果,提出了棉花中层细胞并不是在减数分裂结束后的第7个时期完成降解,而是在花药发育的第11时期协同绒毡层一起完成降解。进一步,通过正常条件和高温胁迫下的单细胞转录组比较分析,发现花药不同类型细胞对于高温有其独特的响应特性,存在强烈的异质性。其中负责花粉壁合成相关的绒毡层细胞对高温最为敏感,在受到高温胁迫后完全消失,并发现在这些绒毡层细胞中高量表达的GhNSP购买GSK126和GhCYP703A2可能是响应高温的核心关键因子。另一方面,完成了单细胞多组学(转录组+染色质可及性)测序及分析,鉴定了所有细胞类型特异的染色质开放区域,发现了常温和高温下基因的表达均与对应染色质开放活性成高度正相关,而高温下从转录组中消失的绒毡层细胞可能是由于其染色质关闭所导致。最后分析了高温下所有细胞类型中465类转录因子结合基序的染色质可及性变化,发现不同的转录因子家族在不同的花药细胞类型中具有独特的高温响应机制,其中在绒毡层细胞中高量富集的MYB类转录因子的结合基序染色质可及性在高温下呈现强烈的变化,推测MYB类的转录因子对于绒毡层细胞响应高温可能十分关键。(2)GhMYB66-GhMYB4-GhCKI是调节棉花高温下雄性不育的一个关键途径。单细胞转录组鉴定到大量MYB类转录因子对于绒毡层发育十分重要,且单细胞染色质开放性测序发现MYB类转录因子在绒毡层细胞中参与高温响应,深入分析发现MYB类转录因子其中的一个成员GhMYB4(Ghir＿A12G003840)在绒毡层细胞中受高温诱导表达。酵母单杂、双荧光素酶报告实验、凝胶迁移实验表明,GhMYB4可以结合到I型酪蛋白激酶GhCKI基因启动子序列中的两个MYB结合位点上,正向调控GhCKI的转录。在棉花花药发育早期,高温诱导GhMYB4上调表达导致雄性败育,与常温条件下过量表达GhMYB4导致雄性败育表型类似,同时伴随着GhCKI表达的增强。此外,酵母双杂、双分子荧光互补实验、GST-pull down实验表明GhMYB4可以与另外一个MYB转录因子GhMYB66互作。GhMYB66在高温下的表达模式与GhMYB4相似,但其并不能直接结合到GhCKI的启动子上。双荧光素酶报告实验、凝胶迁移实验发现GhMYB4与GhMYB6PS-341 IC506形成的异源二聚体,可以增强GhMYB4与GhCKI启动子的结合能力。此外,分析发现高温减少了si RNA介导的GhMYB4启动子上的CHH类型的DNA甲基化,进而增强了高温下GhMYB4在四分体时期花药中的表达,促进了GhMYB4/GhMYB66异源二聚体的形成,从而提高了GhCKI在绒毡层中的转录,导致雄性败育。综上所述,我们的研究揭示GhMYB66-GhMYB4-GhCKI通路在棉花花药响应高温中具有重要的调控作用。(3)棉花CKI基因的全基因组鉴定、进化估算和功能特征分析。GhCKI是高温下棉花雄性不育的关键枢纽基因,而对棉花CKI家族的系统研究未见报道,因此鉴定棉花中的CKI家族,研究CKI基因的进化历程和功能具有重要的理论价值。通过对陆地棉、海岛棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉、草棉五个棉种的CKI基因家族鉴定,分别获得了58、57、31、29、27个CKI基因,并揭示了棉花CKI家族分为type I和type II两大类。通过比较基因组分析发现,两类CKI家族成员随着棉花四倍体事件扩增,最终type I和type II两类CKI基因可能是分化于15亿年前的红藻和绿藻分化时期,因此推测CKI是参与植物一些基础生物学路径的古老基因。进一步从陆地棉CKI家族的表达分析发现,大部分CKI基因的确可以响应光信号和高温胁迫,且有的CKI基因受高温诱导产生可变剪切。该研究提供了全基因组水平下的棉花CKI基因的进化史特征,为进一步研究两类CKI基因在特定发育过程和环境胁迫条件下的功能分化奠定了理论基础。总之,我们的研究首次建立了在常温和高温条件下,棉花四分体花药单细胞水平的转录图谱和染色质开放性图谱,描绘出棉花雄性器官在高温胁迫下单细胞水平的表达和表观变化,鉴定出大量参与花药发育和响应高温的核心基因,挖掘出一条调控棉花高温下雄性不育的一个关键途径,对棉花的功能基因组研究和棉花抗高温育种具有重要促进作用。

目的 分析血清巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)作为活动性肺结核(TBpos)分诊检测的诊断效能。方法 选择2019年1月至2022年5月我院收治的肺结核(PTB)患者113例，根据诊断标准分为TBpos组63例及TBneg组50例。采用酶联免疫吸附测定法检测血清MIF水平。结果 TBpos组患者的血清MIF水平高于TBneg组[12.35(2.10,75.50)ng/ml vs. 6.50(1.60,1sleep medicine5.15)ng/ml,P=0.030]。在TBneg组[7.40(1.70,8.40)ng/ml vs. 5.20(1.50,7.70)ng/ml,P=0.042]及TBpos组[26.90(6.20,115.00)ng/ml vs. 4.20(1.70,31.90)ng/ml,P=0.025]中人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性(HIV~+)患者的血清MIF水平高于HIV阴性(HIV~-)患者。TBneg组及TBpos组患者血清MIF水平均随着患者症状总评分的增加而升高(P<0.05)。经单因素及多因素Logistic回归分析，TBpos组、痰涂片阳性、HIV~+、症状总评分6～9分与血清MIF水平>6.0 ng/ml相关(P<0.05)。经受试者工作特征曲线分析，血清MIF水平对TBpos的诊断曲线下面积为0.748(95%CI:0.650～0.846),截断值为9.05 ng/ml。使用血清MIF水平≥9.05 ng/ml为诊断依IACS-10759浓度据，需要进行结核分枝杆菌半巢式全自动实时荧光定量PCR检测(Xpert)的患者将减少62.0%,错过更多38.0%具有Xpert阳性结果的TBpos患者。血清MIF水平对高症状总评分、HIV~+患者的诊断灵敏度及特异度较高(P<0.05)。结论 血清MIF水平可有助于提高TBpos诊断具有意义。

新型冠状病毒感染疫情自2019年暴发以来,给全人类的健康和经济发展带来了极大的损失。新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome CoronavPR-171半抑制浓度irus2,SARS-CoV-2,简称新冠病毒)可以通过飞沫、气溶胶等途径在人与人之间快速传播。感染者表现为发烧、咳嗽等症状,严重者可能会引发肺炎。在疫情发生的早期阶段,人们曾经受到既无特效药又无预防疫苗的困扰。各国一方面利用戴口罩、保持社交距离、隔离感染者作为阻止病毒传播的主要手段,另一方optical fiber biosensor面投入大量人力物力,以最快的速度研发抗病毒药物及疫苗。新冠病毒属于正义单链RNA病毒,其基因组复制和转录由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)执行。由于靶向RdRp的小分子抑制剂能够阻断病毒的复制和转录,且人体内不存在RdRp同源蛋白,因此RdRp成为最有吸引力的抗病毒药物靶点之一。迄今为止已有多种以RdRp为靶点的药物获准上市,包括瑞德西韦(remdesivir)、莫努匹拉韦(molnupiravir)、阿兹夫定(azvudine)等,这些药物均属于核苷类似物,对于感染者的治疗具有一定效果。然而该类药物在临床应用中也存在较多问题,主要是引起不良反应和副作用,包括尿酸升高和溶血性贫血等,并且存在致突变致畸风险。因此开发更有效,副作用更小的抗病毒药物仍然具有重要意义。目前对RdRp催化功能的研究还不够深入,对RdRp的性质表征无疑有助于开发更好的药物。相对于抗病毒药物,新冠病毒疫苗的研发进展更为迅速,从2021年开始有多种新冠疫苗上市。但是目前的疫苗还存在一些缺点和不足,如核酸疫苗会引起不良反应,灭活疫苗生产条件要求较高并且存在病毒灭活不彻底的风险,蛋白质亚单位疫苗免疫原性较弱等。因此迫切需要开发一种副作用更小、免疫效果更强的疫苗。为了有助于开发更好的抗病毒药物和疫苗,我们对包括RdRp在内的新冠病毒的多个关键蛋白质做了深入细致的性质表征。这些研究结果启发了新型核苷类药物的设计策略以及全新的疫苗开发技术。本论文的主要研究内容和研究结果如下:1.新冠病毒RdRp可以利用核苷二磷酸(nucleoside diphosphates,NDPs)作底物并可以将莫努匹拉韦二磷酸(molnupiravir diphosphate,MDP)掺入RNA产物链(1)RdRp利用NDPs作底物,且具有模板特异性和保真性采用常规的RNA延伸率测定方法测定SARS-CoV-2 RdRp聚合酶活性,结果显示,无论以核苷三磷酸(nucleoside triphosphates,NTPs)或NDPs作底物,RdRp都能合成相同长度的RNA产物。说明RdRp可以利用NDPs作底物。同时检测了利用NDPs作底物时的模板特异性和保真性。当RNA模板的第一个碱基为U时,只有理应与之配对的ADP促进了 RNA的延伸,表明NDPs的掺入具有模板特异性。本论文采用两个实验验证保真性:Sanger测序法和PCR产物的高通量测序法,两个方法表明无论以NDPs或NTPs作为底物,均得到相同的保真性结果。(2)作为RdRp的底物,NDPs的掺入效率约是NTPs的三分之二动力学曲线表明,NDPs的相对掺入效率约为NTPs的三分之二(67.94%±2.66%),然而,用NDP替代任何单个NTP对RNA合成效率没有影响。这意味着RNA的合成速率只受NDPs连续掺入的影响,而不受间歇插入的影响。(3)SARS-CoV-2 RdRp 以 MDP 作底物,合成 RNA莫努匹拉韦是针对RdRp的靶向药物,一般认为在体内以三磷酸的活性形式(MTP)发挥作用。我们发现当CTP或UTP被MDP取代时,与使用MTP作为底物时类似,同样可以合成RNA。以高通量测序的方法检测突变率,发现当体系中添加相同浓度的MTP和MDP时,表现为相似的突变率。这说明在宿主体内,莫努匹拉韦在磷酸化为二磷酸形式时已经开始作为底物掺入RNA链中,并且与三磷酸形式底物具有同等掺入效率,并引发相同的突变率。(4)不同病毒RNA聚合酶底物特异性比较SARS-CoV RdRp可以使用NDPs、MTP和MDP作底物;寨卡病毒的NS5不可以利用NDPs作底物,当用MTP或MDP替代UTP时,寨卡病毒的NS5只能弱合成RNA;而T7 RNA聚合酶可以以较低的效率利用ADP作底物转录,而不能使用其他的NDPs、MTP和MDP作底物。2.靶向RdRp药物苏拉明和Evans blue的发现确认细节与探究前期的实验发现SARS-CoV-2 RdRp具有外切核酸酶活力,并且通过设计不完全配对(即有突变)的RNA模板,检测到RdRp可以自我校对,在另外添加nsp 14-ExoN 时,校正率增加。在这个发现的基础上设计了一个筛选RdRp抑制剂的方法,其效率比传统的凝胶电泳法更高。最终,筛选到抑制RdRp活性的Evans blue和苏拉明。尽管后来的实验表明RdRp的核酸酶活力很可能是杂蛋白污染造成的假象。但是,由此方法筛选到的Evans blue和苏拉明确实可以对RdRp的聚合酶活力起抑制作用。3.新冠病毒热减毒活疫苗的构想以及初步研究由于现有新冠病毒的疫苗存在各种各样的缺点,我们构想了一种减毒活疫苗:通过降低新冠病毒关键蛋白质的热稳定性,使病毒只能在温度较低的鼻腔和上呼吸道存活,而无法在37℃的体内环境存活,则可以获得一种全新的减毒疫苗,具有预防新冠的应用可能。这个技术能够实现的关键是精确地控制病毒关键蛋白质的热稳定性。通过对新冠病毒已有蛋白质结构nsp7、nsp8、nsp14、N蛋白、3CLpro、PLpro蛋白进行分析,选择结构核中的色氨酸、甲硫氨酸等氨基酸进行突变,突变蛋白质的立体结构变得松散,其热稳定性发生变化。利用3CLpro蛋白酶检测了蛋白变性温度与酶活力之间的关系,发现当突变体蛋白Tm值在41-43℃时,蛋白酶33℃孵育后丧失了 50%左右的酶活力,37℃孵育后丧失了约90%的酶活力。利用蛋白质变性温度降低的突变体或其组合,可以挑选出在鼻腔或上呼吸道存活而不能在体内存活的突变体,以达到构建减毒活疫苗的目的。综上所述,本论文首先对RdRp聚合酶活性进行表征,发现其可以利用NDPs作底物,并可以以莫努匹拉韦二磷酸作底物合成新的RNA,随后与其他病毒的RdRp进行了比较研究。此外,筛选到靶向RdRp的抑制剂Evans blue和苏拉明。最后,通过对几种新冠病毒关键蛋白质进行氨基酸突变和活力检测,提出一种构建新型减毒活疫苗的设想。关于RdRp功能的新发现不仅可以拓宽我们对SARS-CoV-2的了解,还可以为抗病毒药物设计提供新的策略。热减毒疫苗的构想也可以为预防新冠病毒以及其他呼吸道病毒提供新思路。