Achr receptor

1,2,4-三唑类杀菌剂被广泛用于农作物病害防治,同时其在水生态系统的污染问题与对非靶标生物的潜在RAD001半抑制浓度危害也受到越来越多的关注。已知三唑类杀菌剂主要通过抑制14α-羊毛脂醇脱甲基酶(CYP51)活性来阻止真菌细胞膜麦角甾醇的合成,造成杀菌效果,而CYP51同样在真核生物中发挥作用。研究已发现三唑化合物可引起非靶标生物的生殖内分泌干扰效应,但目前其对水生生物的毒性研究仍然不足,尤其对鱼类性别分化干扰机制的研究缺乏系统性和针对性。而基于化合物结构特征的计算毒理学方法在近几年得到了快速发展,但也仍然存在毒性预测的空白需要填补。针对以上问题,本论文研究首先结合激酶筛选、报告基因、实时荧光定量PCR、分子对接与酶活检测的手段对典型三唑类杀菌剂戊唑醇进行毒性机制探索,再以放射性~3H标记雄烯二酮作为反应底物,利用放射性同位素示踪技术,分析23种常用三唑类杀菌剂对芳香化酶(CYP19)活的抑制性,高效灵敏地分析药物间的活性差异,最后构建相关定量构效关系(Quantitative Structure-Activity Relationship,QSAR)模型。旨在一定程度上填补三唑类杀菌剂所引起的生殖内分泌干扰相关毒性数据的空白,为环境友好型的药物研发和政府对其相关毒性评估监测提供参考。主要结果如下:1.戊唑醇对斑马鱼性别分化分子机制及三唑类杀菌剂的芳香化酶活抑制作用研究。利用激酶抑制剂体外筛选实验发现戊唑醇并未对包括PIK3C2A、AKT、PKA等常见调控体内稳态的113种激酶表现拮抗作用,表明激酶可能不是戊唑醇直接作用靶点。而在CALUX细胞实验中,戊唑醇可引起雄激素受体拮抗效应,表明戊唑醇可引起体内性激素介导信号通路的紊乱。CYP19作为将雄激素向雌激素转化的限速酶,也是生殖系统中重要的生物标志物。将戊唑醇暴露于斑马鱼胚胎阶段(0～5 dpf)和性别分化前期(19～30 dpf),通过q PCR技术研究戊唑醇对斑马鱼芳香化酶相关基因(cyp19a1a,cyp19a1b,ar,esr2a,gata4,nr5a2等)的影响,结果表明在性别分化前期2 mg/L戊唑醇可造成cyp19a1b(0.64±0.04倍)、esr2a(0.49±0.01倍)、esr2b(0.12±0.02倍)、ar(0.42±0.09倍)、gata4(0.39±0.08倍)、cebpa(0.27±0.09倍)和ahr2(0.68±0.03倍)的基因水平显著性下降,而同时加入50 ng/L的雌二醇后cyp19a1b(2.03±0.46倍)、esr2b(0.22±0.02倍)和cebpa(0.45±0.07倍)表现出显著性的补偿效应,推测戊唑醇参与到芳香化酶的调控路径中。将戊唑醇与芳香化酶蛋白结构进行半柔性CDOCKER分子对接后发现其可与该酶形成范德华力、烷基作用等非共价作用力,并于活性中心Heme结构形成π–π堆积作用,推测戊唑醇可能具有竞争性结合芳香化酶催化位点的潜力。进一步通过蛋白序列匹配和同源建模技术发现,人源(CYP19A1)和斑马鱼源芳香化酶(cyp19a1a和cyp19a1b)的蛋白结构,尤其在活性位点具有结构相似性,可相互替代分析。使用荧光检测试剂盒验证了戊唑醇可造成芳香化酶的活性抑制。进一步利用~3H-H_2O释放法分析发现,23种具有三唑结构特征的三唑类杀菌剂对芳香化酶具有不同程度的抑制性,IC_(50)范围为44 n M(最强,氟硅唑)～330μM(最低,联苯三唑醇),其中200μM苯醚甲环唑、100μM腈菌唑和100μM氟环唑可造成酶活的完全抑制。2.三唑类杀菌剂对芳香化酶活抑制效应QSAR模型的构建。受试的23种三唑类杀菌剂对斑马鱼胚胎的急性毒性最高为苯醚甲环唑(LC_(50)=1.96 mg/L),最低为三唑醇(LC_(50)=59.15 mg/L)。在斑马鱼ZF4细胞毒性实验中,IC_(50)范围从71.05μM苯醚甲环唑至728.4μM环丙唑醇,硅氟唑、多效唑、灭菌唑、三唑酮的IC_(50)高于1 m M。将三唑类杀菌剂的胚胎急性毒性、细胞毒性和酶活抑制性进行皮尔逊相关性和线性回归分析发现,斑马鱼胚胎急性毒性与细胞毒性具有正相关性(R~2=0.51),而酶活抑制性与胚胎毒性和细胞毒性并无显著相关性,难以被直接预测。将斑马鱼胚胎急性毒性数据进行不同QSAR模型构建方法的评价,包括1D、2D和3D QSAR。在1D QSAR中,疏水性参数log P与生物活性构建的抛物线模型和双线性模型的R_(adj)~2分别为0.51和0.48。利用分子力场中的化合物空间信息进行Co MFA和Co MSIA分析后,3D QSAR模型显示交叉验证Q~2均远小于0.50。而2D QSAR中对化合物物理化学参数、电性参数和拓扑学参数进行收集,与胚胎急性毒性进行逐步回归分析,获得模型p LC_(50)=-7.24-0.30×X~VPC_4+0.76×log D-26.15×Q_(N1)-0.08×μ,其R~2和R_(adj)~2为0.91和0.88,表现出良好的拟合性和预测性。将同样的建模方法应用于三唑类杀菌剂对ZF4细胞毒性评价,获得p IC_(50)=-4.20-0.20×N_(Acceptor)+0.51×log P+0.017×PSA,该模型同样具有良好的预测性。https://www.selleck.cn/products/ferrostatin-1.html最Biomass estimation后应用于三唑类杀菌剂对芳香化酶活性抑制评价,获得模型p IC_(50)=-22.94-2.67×E_(HOMO)+0.94×log D-0.72×N_(Donor),模型经内部验证、外部验证、残差评估,均在可接受范围,应用域通过Williams Plot方法定义。3.三唑类杀菌剂对斑马鱼幼鱼性别分化验证。基于QSAR模型的预测性,烯唑醇、粉唑醇和腈菌唑被选择在斑马鱼性腺发育和性别分化阶段(2 hpf～100 dpf)暴露。经解剖分析发现,药物可造成斑马鱼发育的抑制、性腺指数降低和雄鱼比例的增加(VC、烯唑醇、粉唑醇和腈菌唑的雄性比例分别为50.95%±12.39%、74.52%±5.73%、83.33%±3.33%和70.00%±17.32%)。结果验证了三唑类杀菌剂的芳香化酶活抑制QSAR模型对斑马鱼的生殖干扰预测能力。本论文研究通过对戊唑醇的生殖毒性机理分析,推广至三唑类杀菌剂,并发现该类化合物对芳香化酶活性的抑制效应,研究进一步将该类化合物的斑马鱼胚胎急性毒性和细胞毒性进行测定,综合不同的毒性终点进行QSAR预测模型的构建,为三唑类杀菌剂在水生环境的潜在风险研究提供相关机制的数据支持,并为加快药物研发和风险评估提供理论指导。

R2R3-MYB家族是植物中最大的转录因子家族immune architecture之一，广泛参与各种生理响应和分子调控。本研究利用假俭草(Eremochloa ophiuroides(Munro.))基因组数据和生物信息学手段鉴定了R2R3-MYB转录因子，并对系统进CX-5461试剂化、结构、顺式作用元件等进行分析；同时对www.selleck.cn/products/epz-6438R2R3-MYB转录因子响应干旱胁迫的表达模式进行分析。结果显示，假俭草中有113个R2R3-MYB成员；蛋白二级结构和三级结构都表明R2R3-MYBs蛋白都含有螺旋-转角-螺旋结构；顺式作用元件分析发现启动子区含有大量植物激素响应和胁迫响应元件，为R2R3-MYB基因进化分析提供了依据。基因表达模式分析表明，与野生型相比，抗旱突变体叶中有39个基因、根中有58个基因在一个或多个干旱时期表达量提高，推测这些R2R3-MYB基因在响应干旱胁迫过程中发挥着重要作用。本研究结果为进一步深入研究假俭草R2R3-MYB基因家族的功能奠定了基础。

红曲霉菌是一种小型的丝状腐生真菌,其代谢产物红曲色素、洛伐他汀等在食品及医药领域有着广泛的应用。谷胱甘肽S-转移酶(GST;EC2.2.1.18)是一类保守的具有多种功能的超基因家族酶系,广泛参与到生物体的多种生理代谢过程。本研究以红曲霉菌GST基因家族为对象,进行了生物信息学分析、基因克隆、酶学特性及表达模式等研究,主要研究结果如下:1.在Monascus purpureus基因组中一共鉴定得到了17个GST基因,通过保守结构域分析具有典型的GST蛋白结构域,分属于Ure2p、e EF1Bγ、GTT1、Omega等不同的亚家族。以红曲霉菌菌株M.purpureus h2019为实验菌株成功克隆了17个GST成员,并对其进行了生物信息学分析,包括理化性质(分子量、等电点、疏水性等)分析,染色体定位,进化分析,序列分析(序列比对、基因结构、保守基序等),蛋白结构预测,以及启动子顺式元件和蛋白互作预测。结果表明:红曲霉菌的GST基因家族的不同成员在理化性质上存在差异。多数成员的分子量在25k Da左右,有52.3%的成员不稳定系数小于40,47.1%的成员等电点大于7属于碱性蛋白;同属e EF1Bγ和Ure2p类的成员序列相似度较高,表现出相似的基因结构和Motif结构。同源基因对的Ka/Ks小于1,在进化过程中可能经历了很强的负选择;序列比对分析发现不同GST成员的序列差异大,但通过同源模建方法获得的10个GST蛋白却具有相似的三维拓扑结构,均为同源二聚体;顺式元件及蛋白互作预测表明红曲霉菌GST基因可能参与到多种非生物胁迫响应过程,与红曲霉菌的生长发育及生理代谢过程有密切关联。2.利用q RT-PCR技术分析红曲霉菌GST基因的表达模式,研究结果表明:红曲霉菌GST的表达在不同生长时期呈现显著差异,Mp Decitabine半抑制浓度GST7在红曲霉菌生长的第五天开始表达。MCatalyst mediated synthesisp GST1是组成性表达基因,第二天表达量最高,可达到内参基因的21.56倍。相关性分析发现MpEPZ-6438化学结构 GST3、Mp GST14、Mp GST17等七个成员相关性较高,可能在红曲霉菌的不同生长时期发挥相似的作用。此外,红曲霉菌代谢产物红曲色素、洛伐他汀及桔霉素的关键基因的表达也与红曲霉菌GST的表达呈现出不同程度的相关性,表明红曲霉菌GST可能参与到重要代谢产物的合成与代谢过程;在0.5 m M双氧水胁迫下有15个成员的表达上调,表明红曲霉菌GST参与到氧化应激,且Mp GST3、Mp GST8和Mp GST17三个成员可能是红曲霉菌应对高浓度氧自由基胁迫的重要策略之一;HED诱导下所有成员表达下调,其他底物诱导时均有部分红曲霉菌GST成员上调。其中经典底物CDNB诱导时有7个基因显著上调,最值得注意的是Mp GST1,表达量可上调50倍以上。Ure2p类的三个基因正相关性较高,初步预测其具有类似的底物谱;不同金属离子胁迫下所有成员呈现不同程度的响应,在2m M的Zn~(2+)处理下表达上调的成员最多,在Fe~(3+)、Ba~(2+)胁迫下多数成员下调;红曲霉菌GST对温度响应也具有差异,6个成员在应对低温胁迫时有显著上调,且Mp GST17、Mp GST11在低温和高温胁迫下均有高表达。3.以同源模建的红曲霉菌GST蛋白为受体,CDNB、NBC等亲电子底物作为配体进行分子对接发现不同成员对不同底物的结合能及相互作用力均有差异,所有成员对第一底物GSH的结合能均高于第二底物表明其对GSH的亲和力较低。第二底物HED结合能最高,表明红曲霉菌GST对HED的亲和力较低。红曲霉菌GST蛋白对其余第二底物的结合能均较低,但部分结合口袋并未落在红曲霉菌GST的C-端结构域上,可能会导致其不能有效的催化GSH与其进行亲核反应;通过构建原核表达载体获得了8个可溶性的重组红曲霉菌GST蛋白,酶学活性检测发现仅有重组Mp GST1蛋白表现出以CDNB为底物的GST酶活性,而对其他底物并未检测出活性;以纯化的重组Mp GST1蛋白进行酶学性质研究发现对GSH和CDNB的Km值分别为0.78 m M和0.41m M,这表明Mp GST1对CDNB的亲和力相对GSH的亲和力高。Mp GST1的最适温度为20℃,最适p H为8,在40℃和p H 9.0下孵育5h残余酶活力仍可分别达到75.6%和70.3%。Zn~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(2+)、Mn~(2+)对Mp GST1的酶活力有抑制作用,而K~+、Ca~(2+)对其酶活力有促进作用,EDTA在10m M时对Mp GST1的抑制达到37.4%,SDS则使之完全失活;为进一步探究Mp GST1的催化类型,通过定点突变发现R135A突变体蛋白完全失活,N17A和V56A突变体的酶活力均下降至40%左右,表明Mp GST1是一种以Asn17,Val 56,Arg 135为催化活性位点的非典型催化类型的GST。综上所述,本研究从红曲霉菌基因组中挖掘到17个GST基因,并对其进行了生物信息学分析。基因表达模式及酶学性质研究表明GST基因功能发生分化,结合相关性结果表明红曲霉菌GST基因在红曲霉菌的生长发育及代谢过程中发挥了重要的作用。

本研究旨在探求持久性有机挥发物氯苯与α-Fe_2O_3颗粒在光诱导下的前体污染物与二次产物对A549细胞毒性的影响，以期为两种污染物毒性作用机制及安全性评价提供依据.采用自制反应器在无光、有AY-22989浓度光条件下生成反应前后两种污染物，从细胞增殖、细胞膜损伤、氧化应激、炎症反应、细胞微观形态等角度探究两者间的毒性效应差异.A549细胞微观形态学显示，污染物通过内吞作用进入细胞质，导致ROS和IL-6水平上升，对细胞增殖、细胞膜损伤呈明显剂量依赖.同时，光诱导后污染物染毒24 h下Gluten immunogenic peptides细胞形态损伤更严重，对A549细胞增殖的抑制作用更强，ROS生成时间提前Erdafitinib小鼠，100μg·mL~(-1)浓度下ROS和IL-6的生成增多，导致细胞膜损伤情况更严重.本实验为光诱导后污染物毒性增加提供了依据，并强调了需要重新评估大气前体污染物在二次转化阶段所可能产生的毒性影响.

目的：探究艾司唑仑与百乐眠胶囊联合应用对睡眠障碍患者睡眠质量、焦虑抑郁状态及血清因子的影响。方法：选取2022年11月至2023年1月北京市海淀区羊坊店街道翠微路社区卫生服务站收治的睡眠障碍患者120例作为研究对象，按照单双号信封法分为对照组和观察组，每组60例。对照组患者给予口服艾司唑仑治疗，观察组患者在对照组基础上联合口服百乐眠胶囊治疗。比较分析2组患者临床疗效、治疗前后焦虑抑郁状态、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子αConus medullaris(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)水平以及睡眠质量情况。结果：治疗14 d后，观察组临床总有效率为93.3%,高于对照组的81.7%(P<0.05);2组患者IL-1β、TNF-α和CRP检测数寻找更多值均较治疗前明显Imidazole ketone erastin生产商下降，且观察组低于对照组(P<0.05);2组患者汉密尔顿抑郁量表(HAMD)和汉密尔顿焦虑量表(HAMA)与评分较治疗前均显著降低，且观察组低于对照组(P<0.05);2组患者睡眠潜伏期、REM睡眠潜伏期、REM睡眠期比例、睡眠总时间均显著改善，且观察组优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：艾司唑仑与百乐眠联用能够有效降低睡眠障碍患者血清炎性因子水平，改善抑郁焦虑情绪，提高睡眠质量。

目的通过对小鼠胸部进行不同剂量及不同周期的X线照射,探讨放射性X线导致小鼠肺部损伤的病理变化及具体机制。材料和方法将75只C57BL/Y-27632作用6小鼠,采用6MV的X射线对小鼠进行单次胸部照射,照射位置在头部以下,剑突以上,剂量率为2Gneonatal pulmonary mediciney/min,按照不同照射剂量随机分为5组:Control组:15只小鼠,不作任何处理;8Gy照射组:15只小鼠,小鼠全肺一次性接受8Gy射线照射,其余条件同Control组相同;12Gy照射组:15只小鼠,小鼠全肺一次性接受12Gy射线照射,其余条件同Control组相同;16Gy照射组:15只小鼠,小鼠全肺一次性接受16Gy射线照射,其余条件同Control;20Gy照射组:15只小鼠,小鼠全肺一次性接受20Gy射线照射,其余条件同Control组相同。分别于5w,6w和7w后对小鼠进行解剖。通过RT-PCR技术检测肺组织中ACE2在mRNA水平的表达,采用HE染色法观察各组肺组织的病理改变,免疫荧光观察巨噬细胞极化,免疫组化技术检测肺组织中炎症因子IL-6和TNF-α的表达变化,Western blot检测NF-κB p65和P-NF-κB p65的表达情况。结果 RT-PCR结果显示:与Control组相比,ACE2整体上呈现下降的趋势,且5周,20Gy照射剂量组小鼠肺组织中ACE2下降最明显。HE染色结果显示:随着照射剂量的增加,肺泡结构的破坏程度越来越大,毛细血管扩张充血明显,炎细胞浸润也越来越明显;随着造模周期的增加,纤维化程度明显,在7周时,2IDN-6556试剂0Gy照射剂量组小鼠肺组织中已出现明显的成纤维细胞。免疫荧光结果显示:与Control组相比,模型组M1型巨噬细胞表达上调,炎症明显。免疫组化结果显示:与Control组相比,模型组炎症因子IL-6和TNF-α表达明显升高。Western Blot结果显示:与Control组相比,模型组P-NF-κB p65表达明显增高,NF-ΚB p65表达无明显变化。结论放射性X线可导致肺部的炎症反应,激活NF-κB信号通路,促进巨噬细胞向M1型极化,并抑制ACE2表达。

背景磷酸酶张力蛋白同源物(Phosphatase and Tensin Homolog,PTEN)是具有双特异磷酸酶活性的抑癌因子,PTEN在细胞生长、凋亡、粘附、迁移、浸润等方面具有重要作用。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)获悉更多(本文简称线虫)是在研究基础医学、遗传学、细胞生物学等领域都具有一定优势的模式生物。线虫的DAF-18与人类PTEN功能域及活性位点高度同源,研究发现人类PTEN在功能上可以完全替代DAF-18;蛋白磷酸酶功能缺陷的错义突变PTEN(Y138F)与线虫的DAF-18(D137A)突变相似。线虫生命周期由卵孵化为第一阶段(L1)幼虫时期,L1幼虫在没有食物的情况下孵化,后续发育过程停滞,这种发育性停滞被称为“L1 arrest”。daf-18/PTEN突变后,L1arrest时期线虫生存率急剧缩短,成虫时期寿命变化不如L1 arrest时期显著,daf-18/PTEN突变线虫L1 arrest时期的表型优势方便进行研究和有利于正向遗传学快速准确筛选新基因靶点。daf-18/PTEN可在L1 arrestPD-0332991生产商时期控制线虫存活和胚胎后细胞发育,研究发现多个基因靶点和信号通路参与调控细胞的发育,然而这些已知的靶点不能完全恢复daf-18/PTEN突变线虫的生存时间,这说明daf-18/PTEN调控细胞生长和个体生存的机制可能在一定程度上是相互独立的。探索daf-18/PTEN调控L1 arrest期线虫独立于细胞增殖的生存机制及寻找新的靶点,可能为提高人类PTEN相关癌症患者的生存年限的设想有所启发。目的探究在L1 arrest时期恢复daf-18突变线虫生存时间的机制。方法1.通过构建双突变体、遗传上位学检测等方法,探究目前报道的调控细胞分裂的信号通路能否恢复daf-18突变线虫生存时间。2.分别过表达DAF-18脂质磷酸酶缺陷、DAF-18蛋白磷酸酶缺陷、DAF-18双磷酸酶缺陷质粒探究双磷酸酶功能是否影响daf-18突变线虫的生存。3.EMS诱变和正向遗传学方法筛选突变体,同胞相减法和全基因组测序来鉴定突变体SNP和In Del突变基因的具体信息。4.使用RNAi、显微注射转基因技术、CRISPR/Cas9、构建双突变体等方法鉴定linc-133突变位点功能。单分子荧光原位杂交定位linc-133 RNA的位置。5.转录组测序技术评估linc-133获得功能(gain-of-function,GOF)突变线虫的差异基因表达变化,KEGG富集相关信号通路。6.生存检测、DAF-16细胞核易位检测、q RT-PCR和sod-3::GFP表达检测linc-133GOF是否激活转录因子DAF-16。7.RNA pull down、RIP、Western bolt等实验寻找daf-18突变线虫中与linc-133 GOF相结合的蛋白,并验证其在调控DAF-16中的功能。8.使用q RT-PCR、RNAi基因沉默、生存实验和突变株遗传上位性等实验,探究linc-133 GOF与DAF-18蛋白磷酸酶活性是否通过HSF-1相关热激蛋白调控daf-18突变线虫生存的机制。9.Western bolt泛素control of immune functions化蛋白检测和未折叠蛋白反应报告基因hsp-4p::GFP验证linc-133 GOF调控内质网未折叠蛋白泛素化降解途径在维持daf-18突变线虫和DAF-18蛋白磷酸酶缺陷线虫中的作用。结果1.调控daf-18突变线虫细胞分裂的基因或信号通路与生存无关。2.DAF-18脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶功能是维持L1 arrest时期线虫生存所必需的,而DAF-18蛋白磷酸酶功能可能在维持生存中发挥关键作用。3.EMS诱变筛选突变位点后并通过相关实验证明linc-133的突变为获得功能(gainof-function,GOF)突变,linc-133 GOF恢复daf-18突变线虫在L1 arrest时期的生存时间。sm FISH证实linc-133在AVK细胞中特异性表达(cell specific),linc-133 GOF发挥细胞非自主性(cell non-autonomous)调控作用。4.linc-133 GOF通过激活DAF-16转录因子来调控L1 arrest时期生存,而在daf-18突变线虫中,linc-133 GOF与14-3-3蛋白竞争性结合阻碍DAF-16从细胞核易位到细胞质,从而通过DAF-16调控L1 arrest时期生存。5.linc-133 GOF通过HSF-1和P97介导的内质网未折叠蛋白泛素化降解维持蛋白质稳态,从而延长daf-18突变线虫L1 arrest时期生存。结论:DAF-18双磷酸酶功能均参与调控L1 arrest时期线虫的生存。linc-133获得功能突变通过调控DAF-16功能和激活HSF-1相关分子伴侣参与的内质网未折叠蛋白泛素化降解途径来维持daf-18突变线虫生存。

研究背景和目的:牙周炎是一种由细菌感染引起的疾病,微生物与宿主之间的作用在疾病过程中起到了关键的作用。寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)YW002在宿主免疫调节和抑制炎症方面有着广泛的应用。在前期研究中,我们发现ODN YW002可诱导人牙周膜干细胞中早期成骨标志性因子碱性磷酸酶活性升高,下调炎症晚期RAW 264.7细胞一氧化氮的合成,为ODN YW002后续应用于牙周炎的研究奠定实验基础。然而,游离的ODN不易黏附细胞、极易被核酸酶酶INCB018424 IC50解,使ODN的临床应用受到了限制。通过特定的化学修饰可增强ODN的稳定性,但有文献表明,由于其序列选择性和专一性差,化学修饰存在副作用。因此,使用纳米粒子系统是目前递送ODN常用的解决策略。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)是目前最常使用的基因载体,但是它存在着生物毒性。研究表明,对PEI进行修饰可以降低其细胞毒性。硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是细胞外基质常见成分,具有良好的生物相容性。相较于PEI,CS修饰的PEI衍生物(PEI-CS)具有低细胞毒性,可实现核酸的高效递送,是一种良好的基因载体。本研究中,我们拟制备PEI衍生物PEI-CS,构建P此网站EI-CS/YW002纳米粒子用于YW002的递送,探究PEI-CS/YW002纳米粒子在牙周炎治疗中的新应用。研究方法:1、PEI-CS的合成和表征:采用Michael加成反应制备PEI-CS,利用~1H-核磁共振(~1H-nuclear magnetic resonance,~1H-NMR)对其进行表征,运用凝胶电泳实验、粒径和电位检测对PEI-CS/YW002纳米粒子进行评价。2、PEI-CS的转染效率和细胞毒性:使用共聚焦激光显微镜(confocal laser scanning microscopmedical competenciesy,CLSM)检测ODN YW002的细胞内吞和转染效率;使用小鼠巨噬细胞系RAW 264.7作为实验细胞,CCK-8法检测了PEI-CS/YW002纳米粒子对细胞的毒性。3、PEI-CS/YW002纳米粒子在牙周炎中的应用:本研究使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建体外RAW 264.7细胞炎症模型,通过定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测PEI-CS/YW002纳米粒子对牙周炎症介质白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因和蛋白表达的影响,并与游离的YW002和硫代修饰的YW002-s进行比较。研究结果:1、~1H-NMR结果显示,本实验制备的PEI-CS具有与PEI和CS相似的特征峰,这证明成功合成了PEI-CS;凝胶电泳实验结果表明,当PEI-CS与YW002的质量比为≥4:1时,PEI-CS可以有效阻碍YW002迁移,这表明PEI-CS与YW002之间结合形成了纳米粒子;粒径与电位检测结果显示,当质量比为4:1时,测得PEI-CS/YW002纳米粒子粒径是240.03±0.38 nm,Zeta电位是+9.10±1.78 m V。以上实验表明PEI-CS/YW002纳米粒子最适转染效率对应的质量比例,即4:1。2、CLSM结果显示,YW002与RAW 264.7细胞共同孵育后,可发现带Cy-5荧光标记的YW002在一定时间内通过胞吞作用进入细胞内。CCK-8法结果表明,当PEI-CS与YW002的质量比为≤8:1时,PEI-CS/YW002纳米粒子作用下RAW264.7细胞的细胞存活率与对照组无显著性差异,表明在一定质量比使用范围内,PEI-CS具有良好的生物相容性。3、qRT-PCR和Western blot结果表明,RAW 264.7细胞在LPS刺激下,炎症模型成功构建,PEI-CS/YW002纳米粒子组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达与LPS刺激组相比显著下降,证明了PEI-CS/YW002纳米粒子对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症模型有良好的抗炎作用,且抗炎效果优于化学修饰的YW002-s。研究结论:PEI-CS具有良好的生物相容性,在体外未见明显毒性,可实现ODN YW002细胞内高效递送,具有良好的抗炎作用,在未来有可能成为治疗牙周炎的一种新手段。

对新孢子虫过氧化物酶1(NcPrx1)重组蛋白(rNcPrx1)进行原核表达并分析其在新孢子虫速殖子和外分泌抗原中的表达情况；通过细胞增殖与毒性试验、ELISA和Western blot等多种手段筛选rNcPrx1安全质量浓度，LGK-974采购检测rNcPrx1selleck LBH589刺激巨噬细胞后促炎细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的分泌水平，TLR2、以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶B(AKT)信号通路相关蛋白表达及磷酸化水平的变化情况等；进一步利用TLR2~(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞和相关通路抑制剂明确rNcPrx1调控细胞因子分泌的信号通路。结果显示：成功构建pET-28a-NcPrx1原核表达载体，并纯化获得大小为28 kDa的rNcPrx1蛋白；免疫小鼠获得NcPrx1多克隆抗体，发现该蛋白可分泌于新孢子虫外分泌抗原中。rNcPrx1刺激小鼠腹腔巨噬细胞的安全质量浓度为20 mg/L,该质量浓度的rNcPrx1增加了TLR2的转录水平和表达水平，促进了IL-6、IL-12和TNF-α的分泌量，并显著提高小鼠腹腔巨噬细胞p38、ERK及AKT蛋白的磷酸化水平。与野生型小鼠腹腔巨噬细胞相比，TLR2缺失Familial Mediterraean Fever降低了细胞中IL-6、IL-12和TNF-α的分泌；此外，rNcPrx1刺激细胞后，p38、ERK和AKT的磷酸化水平在TLR2~(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞中降低；p38、ERK和AKT抑制剂抑制rNcPrx1诱导的IL-6、IL-12和TNF-α分泌量。结果表明，新孢子虫NcPrx1能够通过TLR2激活MAPK和AKT信号通路，从而诱导小鼠巨噬细胞IL-6、IL-12和TNF-α的分泌，为阐明NcPrx1蛋白功能及宿主抗新孢子虫免疫提供了重要参考。

DNA特异性位点是在DNA片段中表达特定功能的区域,通常由单个或多个碱基组成。生物体内很多复杂的运行机制都依赖于DNA特异性位点,如调节基因表达、控制转录以及生物进化等,由此DNA特异性位点的相关内容成为当下研究的重要课题。随着基因测序技术的快速发展,可测得的DNA特异性位点数量呈指数增长,传统实验方法难以满足高通量实验的需要,因此实现准确高效的DNA特异性位点预测十分必要。DNA特异性位点预测的主要困难在于其特征选择和模型构建。针对特征选择问题,设计了特征重要性度量以进行特征筛选,基于特征评分机制的DNA特异性位点预测算法更加强调重要特征,在减少学习任务的基础上有效提高了预测精度。对于特征单一问题,基于特征融合策略的编码方式在保留原有序列信息的基础上,进一步考虑特征的理化性质,为获取更多序列间的有效信息提供了可能。对于预测模型的构建而言,现有的机器学习方法克服了基于特征矩阵的传统DNA特异性位点预测算法不准确的缺Mirdametinib生产商陷。本文研究的DNA特异性位点预测算法优化了训练策略,进一步提高了预测实验的精度和广度。综上,在DNA特异性位点预测领域,本文对DNA特异性位点的研究现状进行了分析和概括,介绍了与机器学习相结合的DNA特异性位点预测技术,明确本文研究的内容和改进优化思路。本文的主要工作如下:1、本文提出基于特征度量机制和组合优化策略(Feature Metric and Combination Opbiotin protein ligasetimization,FMCO)的DNA特异性位点预测算法。为获取可靠的特征子集,FMCO采用特征度量机制来实现特征筛选。同时,为使特征筛选和模型预测达到良好的平衡状态,FMCO采用三种算法分别对特征序列进行评分,并采用十轮特征打分机制保证结果的稳定性和可靠性。此外,FMCO算法采用组合优化策略进行建模预测,交叉结合三种传统机器学习算法,避免了单一模型的缺陷。最后,输出的最终特征评分序列,进一步证明特征度量机制的必要性。本文构建的组合算法是对于训练策略的改进,相较于传统的机器学AZD9291溶解度习算法,FMCO具有更佳的预测性能。2、本文提出基于特征融合策略和卷积神经网络(Feature Fusion and Convolutional Neural Network,FFCNN)的DNA特异性位点预测算法。为保证特征描述的全面性,本文设计的FFCNN算法充分考虑位点序列特征和理化特性以实现基于多个融合特征的预测,寻求最优的特征编码方案。同时,FFCNN使用注意力机制获取重要的特征信息,强调对重要特征的关注。此外,FFCNN采用卷积神经网络解决小样本问题,并使用双向门控循环单元捕捉序列中的双向上下文信息,实现对综合特征的学习。最后,在六个测试物种的数据集上进行大量基准试验,实验证明,FFCNN能进一步提高预测模型的精度。本文对DNA特异性位点预测过程中的特征选择和模型构建两方面进行了细致深入的研究。首先,本文改进了传统的特征表示方法,通过构造特征矩阵来实现特征的筛选和融合,以提升算法的性能。此外,本文还综合考量不同算法对训练策略进行优化,使结果预测更加精准。经实验验证,本文所提出的FMCO算法和FFCNN算法能提高DNA特异性位点预测的准确性,为DNA特异性位点的后续研究提供有效依据。