伤口环境的复杂性使伤口治疗成为一个棘手的问题,因此,伤口管理给医疗行业带来了巨大的挑战。长期以来,人们一直在研究可以促进伤口愈合的伤口敷料。传统的伤口敷料,Wnt-C59使用方法如绷带、纱布和创可贴等,可以帮助伤口愈合但仍存在一定的局限性。在伤口愈合过程中,开放、湿润、营养的伤口环境为细菌Gait biomechanics的繁殖提供了有利的条件,细菌感染会导致伤口恶化,难以愈合,甚至会导致组织坏死和全身感染,对健康造成重大威胁。含银或抗生素的伤口敷料已被用于解决这一问题。但纳米银粒子的细胞毒性以及过度使用抗生素导致的耐药性细菌也带来了新的难题。纳米纤维膜具有高孔隙率,高比表面积和类细胞外基质的结构,在伤口修复方面显示出独特的优势。海藻酸钠具有良好的生物相容性和吸湿透氧性,且不黏附伤口,广泛用于伤口敷料的制备。本研究利用植物提取物连翘苷的天然抗菌性,通过静电纺丝将连翘苷掺杂进海藻酸钠纳米纤维膜中,制备抗菌、抗氧化和促愈性能良好的多功能伤口敷料。在此基础上,对纤维膜的结构进行设计,制备了纳米纤维气凝胶,探究了其细胞相容性和抗菌性,提出了海藻酸钠气凝胶作为伤口敷料应对复杂的伤口环境的潜在可能。(1)长期以来,通过静电纺丝制备高浓度海藻酸钠纳米纤维膜存在一定的挑战。本研究通过加入碳聚合物点制备了高浓度的海藻酸钙/碳聚合物点(CA/CPDs)纤维膜。通过紫外可见分光光度计测试,证明了碳聚合物点的成功掺杂。通过细胞相容性测试、应力-应变测试、接触角、溶胀测试等证明了碳聚合物点无毒害并改善了海藻酸钠纳米纤维膜的力学性能、亲水性和吸湿性。(2)细菌和自由基的清除对伤口愈合具有重要作用,本研究通过引入连翘苷(FGalunisertib纯度T)制备了具有抗菌、抗氧化性能的生物敷料(CA/CPDs/FT)。通过扫描电镜、紫外等测试探究了连翘苷的掺杂对CA/CPDs/FT纤维膜性能的影响;通过抗菌性测试探明了有效的连翘苷浓度。结果表明,掺杂0.5 wt.%连翘苷的CA/CPDs/FT纤维膜具有良好的抗菌和抗氧化性能。小鼠全层皮肤缺损模型表明,CA/CPDs/FT纤维膜可以有效地防止细菌入侵,清除自由基,促进伤口愈合。(3)通过匀质、冻干的技术将CA/CPDs/FT纤维膜制备为纳米纤维气凝胶,同时通过静电纺丝复合了聚己内酯纳米纤维,制备了双层气凝胶(PCCF)。探究了纳米纤维膜浓度对气凝胶结构的影响,该气凝胶具有蓬松的多孔结构,具备较好的透气性、透湿性、抗菌性和抗氧化性。气凝胶耐压能力强,但是在压缩恢复性上存在一定局限。PCCF气凝胶良好的各项性能展现出用于高渗出液的慢性伤口治疗的潜力。
贵州省部分PEDV流行株ORF3基因克隆与遗传进化分析
为探究贵州省猪hypoxia-induced immune dysfunction流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传进化情况，对2017—2022年贵州省不同地区13份PEDV阳性腹泻样本进行ORF3全基因扩增、克隆、测序，使用DNAstar、MEGA 7.0软件，对所得序列核苷酸和氨基酸同源性以及突变和遗传进化情况进行分析。结果显示：13份PEDV阳性样品的ORF3基因序列全长均为675 bp，编码224个氨基酸；13条克隆序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.1%～100%和96.4%～100%;13条克隆序列与经典毒株CV777株ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.9%～97.3%和94.7%～96.4%，同源性较低；与经典毒株CV777株相比，13条克隆序列在G160A、C243T、C274T、G301A、C450T、A497G存在相同的核苷酸突变，存在4个相同的氨基酸位点突变(V21A、V54I、A101T、N166S);13条克隆序列所在毒株在遗传进化上全部属于GⅡ型，其中GZ220514、GZ342、GZ224、GZ219、GZ423隶属于GⅡb亚型，GZ210112、GZ210129、GZ210220、GZ210714、GZ407、GZ210525、GZ330、GZ370属于GⅡa亚型(表明13份PEDV阳性样品所含毒株均为变异毒株)；同一基因型的PEDV毒株ORF3基因相对较保守，但不同基因型差异较大；对所有参比株ORF确认细节3基因推导的氨基酸序列与CV777株进行比对，分析认为可以将25S、70V/F、80F、107F/V/L氨基酸突变模式作为GⅡa亚型的分子标记。本试验为分析贵州省PEDV流行以及Z-VAD-FMK说明书遗传变异情况提供了参考，并丰富了贵州省PEDV ORF3基因序列。
贵州省部分PEDV流行株ORF3基因克隆与遗传进化分析
为探究贵州省猪hypoxia-induced immune dysfunction流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传进化情况，对2017—2022年贵州省不同地区13份PEDV阳性腹泻样本进行ORF3全基因扩增、克隆、测序，使用DNAstar、MEGA 7.0软件，对所得序列核苷酸和氨基酸同源性以及突变和遗传进化情况进行分析。结果显示：13份PEDV阳性样品的ORF3基因序列全长均为675 bp，编码224个氨基酸；13条克隆序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.1%～100%和96.4%～100%;13条克隆序列与经典毒株CV777株ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.9%～97.3%和94.7%～96.4%，同源性较低；与经典毒株CV777株相比，13条克隆序列在G160A、C243T、C274T、G301A、C450T、A497G存在相同的核苷酸突变，存在4个相同的氨基酸位点突变(V21A、V54I、A101T、N166S);13条克隆序列所在毒株在遗传进化上全部属于GⅡ型，其中GZ220514、GZ342、GZ224、GZ219、GZ423隶属于GⅡb亚型，GZ210112、GZ210129、GZ210220、GZ210714、GZ407、GZ210525、GZ330、GZ370属于GⅡa亚型(表明13份PEDV阳性样品所含毒株均为变异毒株)；同一基因型的PEDV毒株ORF3基因相对较保守，但不同基因型差异较大；对所有参比株ORF确认细节3基因推导的氨基酸序列与CV777株进行比对，分析认为可以将25S、70V/F、80F、107F/V/L氨基酸突变模式作为GⅡa亚型的分子标记。本试验为分析贵州省PEDV流行以及Z-VAD-FMK说明书遗传变异情况提供了参考，并丰富了贵州省PEDV ORF3基因序列。
杜仲胶与水凝胶复合伤口敷料的制备及应用性能研究
在日常生活中,烧伤、摩擦、划伤等都可以破坏皮肤的完整性而形成伤口,伤口一旦护理不当很容易发展为慢性伤口,严重者还会威胁生命。伤口敷料是伤口管理过程中不可缺少的医用材料。目前临床常见的伤口敷料(如纱布、绷带等),属于干性敷料,使用时因伤口表面干燥而容易粘附伤口,导致更换时容易对伤口造成二次伤害,给患者带来负担。随着“湿性愈合理论”的日趋成熟,湿润型伤口敷料的研究开发迫在眉睫。海藻酸钠是一种常见的天然高分子多糖,成本低廉、安全无毒且具有良好的生物相容性;同时,海藻酸钠优异的止血性使其在伤口愈合领域展现出巨大的应用潜力。此外,杜仲胶是从杜仲组织中提取而来的一种天然高分子橡胶,具有良好的成膜性;杜仲胶薄膜具有优异的柔韧性与水蒸气阻隔性能,用于伤口敷料既可以阻止伤口处水分的散失,也可以满足特殊部位(关节等)伤口的治疗需求。绿原酸是一种中药活性成分,具SGLT抑制剂有良好的抗菌活性,伤口敷料中添加绿原酸可以有效降低细菌等微生物对伤口的感染几率。本研究设计了药物层与基底层相结合的复合伤口敷料。首先,对海藻酸钠进行磺化改性、季铵化改性和复合绿原酸处理,将得到的凝胶溶液作为复合伤口敷料的药物层;对其形貌结构、Zeta电位、溶胀性能、流变性能以及细胞毒性进行表征与测试。其次,采用简便的溶液流延法得到均匀的杜仲胶薄膜,作为复合伤口敷料的基底层,二者通过物理结合得到抑菌型复合伤口敷料;研究了敷料的机械性能、水蒸气阻隔性能、药物释放行为与抑菌性能,通过动物试验评估了复合伤口敷料对伤口的治疗效果,并借助组织病理学与免疫组化学手段深入探讨了促愈机制。取得的主要结果如下:1.采用化学和物理方法制备磺化海藻酸钠(SSA)、季铵化海藻酸钠(QSA)和绿原酸复合海藻酸钠(CGA-SA)。SSA与QSA中因有新基团的引入导致其表面形貌发生了很大的改变,而CGA-SA与SA的形貌较为相似,只是孔径发生了改变,从50-150μm降低到5-15μm;与SA相比,SSA、QSA与CGA-SA的Zeta电位均降低,分别为-9.4 m V、-21.8 m V和-32.2 m V。细胞毒性测试结果表明:SSA、QSA与CGA-SA均达到毒性I级标准,用作复合敷料具有一定的生物安全性和可行性。2.通过药物层与基底层的结合设计SSA/EUR、QSA/EUR和CGA-SA/EUR复合伤口敷料。复合伤口敷料具有较高的拉应力Telaglenastat(10.81-12.55 MPa)、较高的杨氏模量(39.82-68.01 MPa)以及较高的断裂伸长率(253.13%-313.74%);所有复合伤口敷料的WVP值都较低,且依赖于相对湿度,在高相对湿度(RH=76%)时,CGA-SA/EUR伤口敷料的WVP值最高,仅为0.39×10~(-7)g/m/h/Pa;用著名的Korsmeyer-Peppas模型确定了伤口敷料的药物释放行为,药物累积释放量依赖于介质的p H值;SSA/EUR伤口敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用(抑制圈直径分别为19 mm和16 mm),而QSA/EUR和CGA-SA/EUR伤口敷料对金黄色葡萄球菌的抑菌效果相同,抑菌圈直径为15 mm,但对大肠杆菌没有明显的抑制作用。综合来看,复合伤口敷料具有较强的机械性能、良好的水蒸气阻隔性能、较高的药物累积释放量与一定的抗菌性能。3.利用小鼠全层皮肤伤口模型评估复合伤口敷料的应用潜力。与对照组相比,复合伤口敷料可以加快伤口的愈合。特别是,CGA-SATORCH infection/EUR复合伤口敷料的治疗效果最好,在治疗11 d后伤口愈合率可达98%,优于市售敷料。组织病理学和免疫组化分析结果表明,复合伤口敷料可以通过促进肉芽组织的形成、胶原纤维的沉积和早期新血管的生成来促进伤口愈合过程。
基于抗菌肽/聚四氢嘧啶修饰的高效抗菌纤维的制备及应用研究
采取有效措施预防和治疗细菌感染一直是人类共同努力的目标。用于个人防护装备的纤维材料如棉纤维等因不具备抗菌能力,且结构疏松多孔易携带或滋生细菌,造成细菌交叉感染,严重危害公众生命健康。同时,抗生素滥用导致细菌产生耐药性,增加治疗细菌感染的难度。此外,传统的抗菌材料存在细胞毒性大、血液相容性差、生产成本高等问题,已无法满足人类需求,因此,亟需开发不易诱导细菌产生耐药性、高效广谱抗菌活性和具有实际应用价值的生物友好型抗菌剂和抗菌纤维。本文设计并制备以JNJ-42756493临床试验氨基酸及其衍生物为基元的具有高效广谱抗菌活性短链抗菌肽WRIIIKK和聚四氢嘧啶(PTHP)有机抗菌剂。在充分研究其生物化学性能的基础上,采用接枝、物理吸附等方法将该有机抗菌剂与纤维材料结合,开发出具有高效广谱抗菌活性、生物相容性好、有实际应用价值的抗菌纤维。通过对纤维的理化性质、生物学性能等进行评估,最后探究其在细菌等病原体防控中的应用潜力。本文的主要研究内容及结果如下:(1)采用固相合成法合成短链抗菌MDV3100试剂肽肽库,再将抑菌圈法和二分法结合,对多肽库进行筛选,最终得到目标短链抗菌肽WRIIIKK。该短链抗菌肽的稳定性好、细胞毒性小、生物相容性好、低耐药性、对细菌及真菌均表现出较高的抑菌活性。该肽链的金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度可达75μg/m L,大肠杆菌的最小抑菌浓度为90μg/m L,白色念珠菌的最小抑菌浓度为100μg/m L。通过建立小鼠开放性伤口细菌感染模型评估抗菌肽的体内抗菌能力,证实抗菌肽能有效抑制细菌感染伤口,且具有促进小鼠伤口愈合的作用。将抗菌肽WRIIIKK进行改性,并将其接枝到棉纤维上,抗菌肽修饰的棉纤维依旧保持着抗菌肽原有的高效抑菌活性。这一性能优良的抗菌纤维有望扩展应用到其他个人防护设备和纺织品中。(2)以炔基单体和胺基单体为起始原料,采用“一锅法”合成以氨基酸衍生物为基元的聚四氢嘧啶(PTHP),并将PTHP负载到聚酯纤维(PET)上,从而制备出PET-PTHP纤维。该纤维具有高效抗菌活性,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率高达99.9%,且抗菌持续性好,72 h内抗菌效果无明显变化。此外,与抗生素相比,细菌不易对PTHP产生耐药性。PET-PTHP纤维对慢病毒具有明显的抑制作用,能够使慢病毒对细胞的感染率从25.4%降低至9.7%。该纤维还具有机械性能好、无明显细胞毒性、血液相容性好等优点。在此基础上,将PET-PTHP纤维作为细菌病毒的杀灭层应用到新型口罩的制备当中,该新型口罩消除了传统口罩只吸附过滤病原体而无法起到杀灭效果的弊端,进一步quinoline-degrading bioreactor降低了人体感染疾病的风险。
梓醇对IL-1β诱导软骨细胞损伤的保护机制研究
目的 探讨梓醇对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导软骨细胞损伤的影响及其可能作用机制。方法 分离培养人膝关节软骨细胞，分为对照（Con）组、IL-1β组（用10μg/L IL-1β处理48 h）,IL-1β+梓醇-低组、IL-1β+梓醇-中组、IL-1β+梓醇-高组（分别用10、20及50 ng/L的梓醇处理软骨细胞后，用10μg/L IL-1β处理24 h）,IL-1β+miR-NC组、IL-1β+miR-140-5Panobinostat说明书p组（分别转染miR-NC和miR-140-5p mimics后，用10μg/L IL-1β处理24 h）,IL-1β+梓醇+anti-miR-NC组、IL-1β+梓醇+anti-miR-Captisol供应商140-5p组（分别转染anti-miR-NC和anti-miR-140-5p后，用50 ng/L梓醇和10μg/L IL-1β处理24 h）。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞活力；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素（IFN-γ）的水平；流式细胞术检测细胞凋亡；采用实时荧光定量PCR检测miR-140-5p的表达水平；Western blot检测活化的胱天蛋白酶3(Cleaved-caspase 3)、Cleaved-caspase 9蛋白表达。结果 与IL-1β组比较，IL-1β+梓醇-低组、IL-1β+梓醇-中组、IL-1β+梓醇-高组IL-6、TNF-α、IFN-γ水平，细胞凋亡率和Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平降低（P<0.05），细胞活力和miR-140-5p表达水平升高（P<0.05）；与IL-1β+miR-NC组比较，IL-1β+miR-140-5p组IL-6、TNF-α、IFN-γ水平，细胞凋亡率和Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平降低（P<0.05），细胞活力和miR-140-5p表达水平升高（P<0.05）；与IL-1β+梓醇electron mediators+anti-miR-NC组比较，IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p组IL-6、TNF-α、IFN-γ水平，细胞凋亡率和Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平升高（P<0.05），细胞活力和miR-140-5p表达水平降低（P<0.05）。结论梓醇可能通过上调miR-140-5p表达，抑制细胞炎性因子释放及细胞凋亡，减轻IL-1β诱导的软骨细胞损伤。
躁狂症患者血清NT-3、IGF-1表达水平及其临床意义
目的 探讨躁狂症患者血清神经营养素3(NT-3)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)表达水平及其临床意义。方法 选取87例躁狂症患者作为躁狂症组，同期选取90例健康体检者作为对照组。给予躁狂症组患者常规药物治疗。根据贝克拉范森躁狂量表(BRMS)评分将躁狂症组患者分为轻度躁狂class I disinfectant组(n=35)、中度躁狂组(n=28)、重度躁狂组(n=24)。比较对照组研Naporafenib小鼠究对象和躁狂症组患者之间，以及不同躁狂程度患者之间治疗前的血清NT-3、IGF-1水平。采用Pearson法分析躁狂症患者治疗前血清NT-3、IGF-1水平与BRMS评分的相关性。比较治疗前后躁狂症患者血清NT-3、IGF-1水平及BRMS评分。采用受试者工作特征曲线分析血清NT-3、IGF-1及二者联合检测对躁狂症的诊断价值。结果 治疗前，躁狂症组患者血清NT-3、IGF-1水平较对照组升高，轻度躁狂组、中度躁狂组、重度躁狂组患者血清NT-3、IGF-1水平依次升高(均P<0.05);躁狂症组患者血清NT-3、IGF-1水平与BRMS评分均呈正相关(均P<0.05)。治疗后，躁狂症组患者血清NT-3、IGF-1水平及BRMS评分均较治疗前降低(均P<0.05)。血清NT-3、IGF-1水平单独检测及二者联合检测诊断躁狂症的曲线下面积分别为0.854、0.812、0.887,二者联合检测诊断躁狂症的曲线下面积与血清NT-3、IGF-1水平单独检测诊断的曲线下面积差异无https://www.selleck.cn/products/VX-765.html统计学意义(P>0.05)。结论 躁狂症患者血清NT-3、IGF-1水平升高，血清NT-3、IGF-1水平与躁狂症患者病情严重程度相关，两者有望成为诊断躁狂症的生物学指标。
基于单细胞测序数据的骨肉瘤预后相关细胞亚群特征分析
目的 通过分析不同骨肉瘤患者肿瘤组织的细胞组成，探究与骨肉瘤预后相关的细胞亚群及特征。方法 下载不同患者骨肉瘤单细胞测序数据及bulk测序数据，提取细胞样本信息进行降维tumor suppressive immune environment、注释、细胞功能分析，明确与骨肉瘤预后相关的细胞种类，鉴定骨肉瘤预后相关细胞特征。分析具有预后意义的巨噬细胞发育轨迹，根据分化空间差异基因构建骨肉瘤预后模型。结果 不同骨肉瘤患者的细胞组成存在异质性。骨肉瘤中浸润的单核巨噬细胞具有显著预后意义(P=0.003)。4类巨噬细胞组成关键预后单核巨噬细胞亚群，其特征性转录调控因子包括RUNX3(+)、ETS1(+)、HOXD11(+)、ZNF281(+)、PRRX1(+)。巨噬细胞亚群的预后能力随骨肉瘤的恶性进展而增强，其中Prog＿Macro2及Prog＿MacRegorafenib半抑制浓度ro4亚群巨噬细胞位于发育轨迹终端。基于巨噬细胞分化差异基因的预后模型能够有效区分不同风险骨肉瘤患者的生存率(P<0.001)。结论 巨噬细胞亚群与骨肉瘤预后密切相关，可作为骨肉瘤免LXH254疫治疗的关键靶细胞。
具有抗菌性能的光响应聚乙二醇水凝胶的构建及其预防CIED囊袋感染的研究
背景:心脏植入式电子装置(CIED)治疗已成为治疗心律失常及严重心力衰竭的重要手段之一,可以明显改善患者的生活质量。CIED相关感染是CIED术后最常见也是最严重的并发症之一,随着CIED治疗的广泛应用,其发病率也在不断上升,甚至超过了CIED治疗的增长速度。尽管医疗技术已经取得了巨大的进步,但CIED植入术后一年内感染的发生率仍在2.3-3.4%之间。目前用于预防CIED感染的主要手段为术前抗生素的使用,然而,随着全球范围内抗生素滥用,病原体相关耐药性的上升,导致了术前抗生素效果下降。因此,开发一种不依赖抗生素且可有效预防CIED感染的材料迫在眉睫。聚乙二醇(PEG)水凝胶因其高亲水性、生物安全性,已广泛应用于生物医学领域中。除此之外,由于PEG水凝胶可产生的立体屏障、排除体积效应和渗透性排斥作用,因此其可明显减少生物材料表面的蛋白质吸附、细菌吸附、生物膜形成以及感染。壳聚糖是自然界中唯一含有氨基的阳离子多糖,具有优良的生物相容性,其带正电荷的氨基可与微生物细胞膜中的脂多糖和表面蛋白等阴离子成分结合,通过破坏生物细胞壁而起到广谱抗菌作用。然而,壳聚糖的低溶解性限制了其作为抗菌材料reactive oxygen intermediates在人体组织的微环境中的应用。通过壳聚糖季铵化反应制成的2’-O-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(2’-O-HTACCS)不仅可以提高水溶性,而且由于阳离子基团的增加其抗菌活性也获得了明显增强。同时,我们将PEG及其它一些光敏材料组成光响应PEG水凝胶,光响应水凝胶不仅具有时空可控性,还可精准控制水凝胶形状,以此在术前迅速完成对CIED的表面修饰。综上,本研究拟构建一种可快速反应的光响应PEG/2’-O-HTACCS抗菌水凝胶用于预防CIED囊袋感染。方法:1、光响应PEG/2’-O-HTACCS水凝胶的构建及表征:通过化学交联且部分改进工艺,我们首先合成光响应PEG水凝胶及2’-O-HTACCS。钛片样品依次使用硫酸/过氧化氢溶液(H_2SO_4/H_2O_2)、氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理在钛表面修饰上羟基、氨基。然后,将预先混合的PEG/2’-O-HTACCS水凝胶匀覆盖在钛片表面,在紫外光的照射下,2’-O-HTACCS的氨基、PEG的羟基及钛表面的氨基通过羟胺化反应进行化学交联从而使水凝胶粘附在钛表面。最后,通过扫描电镜、X射线光电子能谱仪(XPS)、接触角分析等表征钛片硅烷化是否成功;通过粘附力试验检测水凝胶在不同钛表面的粘附力。2、光响应PEG/2’-O-HTACCS水凝胶的安全性评价:本研究选用NIH/3T3细胞评价PEG/2’-O-HTACCS水凝胶的体外细胞毒性,以及将负载水凝胶的钛片植入SD大鼠的皮下囊袋证明其生物相容性。体外实验中,本研究将NIH/3T3细胞与PEG/2’-O-HTACCS水凝胶的浸渍液共培养,使用CCK-8试剂盒检测水凝胶的细胞毒性及活死细胞染色来评估水凝胶的体外安全性。体内实验中,本研究将负载水凝胶的硅烷化钛片植入SD大鼠的皮下囊袋中,通过囊袋、心、肝、肾组织的HE染色及血常规、肾功能、肝功能结果以评估水凝胶的生物安全性。3、光响应PEG水凝胶的抗菌有效性评价:(1)在体外抗菌有效性实验中,根据CIED相关感染的病原学特征,本研究选用了革兰阳性菌(表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌)和革兰阴性菌(肠杆菌、铜绿假单胞菌)四种代表性菌株。我们将四种细菌的菌液分别与对照组(单纯钛片组)及实验组(负载抗菌水凝胶的硅烷化钛片组)样品共培养,通过菌落计数、活死细菌染色及扫描电镜,评价PEG/2’-O-HTACCS水凝胶的杀菌能力、抵抗细菌粘附力能力及其对细菌膜结构的影响。(2)在体内抗菌有效性实验中,我们在SD大鼠双侧背部制作了两个独立囊袋,并分别植入对照组、实验组样品及金黄色葡萄球菌菌液用以构建囊袋感染模型。在植入术后第3天、第7天,重新切开囊袋,通过对囊袋的大体观察、活死细菌染色及细菌定量分析评估炎症反应程度、细菌数量及细菌活力情况;通过HE染色评估囊袋组织的炎症细胞浸润情况;通过免疫组化及实时荧光定量PCR(qPCR)评估囊袋组织的炎症因子IL-1β和TNF-α表达水平。结果:1、光响应PEG/2’-O-HTACCS水凝胶的构建及表征:(1)扫描电镜发现在高倍镜下观察到纯钛片的表面是平坦的,羟基化钛片表面的粗糙程度明显增加,硅烷化钛片表面则出现了结节结构。(2)XPS结果发现羟基化钛片表面氧元素明显增加,硅烷化钛表面氮、碳和硅元素分别增加到9.32%、9.21%和42.82%;而氧元素含量降至37.19%,钛含量降至1.46%。(3)接触角测量发现羟基化钛片水接触角从65.5±0.51°下降到41.3±1.0°,样品的亲水性增强;硅烷化钛表面水接触角增加到76.3±2.6°。(4)水凝胶粘附力检测结果发现,与钛片、羟基化钛片相比,水凝胶与硅烷化钛片的粘附力明显增强,粘附性能增加了2倍。综上,本阶段实验可证实钛片硅烷化成功,且可使水凝胶的粘附力明显增加。2、光响应PEG/2’-O-HTACCS水凝胶的安全性评价:(1)体外安全性评价:(1)细胞活死染色显示NIH/3T3细胞与水凝胶浸EPZ-6438分子式渍液共培养1天、3天后细胞的数量、形态正常,未观察到明显的细胞死亡。(2)在共培养1天、3天及7天后,细胞增殖毒性实验未发现水凝胶有明显的细胞毒性。除此之外,在共培养3天、7天后,实验组的细胞活力比对照组更高。(2)体内安全性评价:植入术后第1天、7天及14天,实验组囊袋组织、心肌、肝脏、肾脏的HE染色均未见组织出现明显炎症细胞浸润、血管扩张、渗透性增加及纤维化。与对照组相比,实验组在血常规、肝功能和肾功能均未发现明显统计学差异。综上,本阶段实验证实PEG/2’-O-HTACCS水凝胶具有良好的生物安全性。3、光响应PEG/2’-O-HTACCS水凝胶的抗菌有效性评价:(1)在体外抗菌有效性实验中:(1)菌落计数实验发现,在共培养的各个时间段实验组菌Panobinostat IC50落计数都明显低于对照组,尤其是在金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及铜绿假单胞菌组,细菌数目下降90%以上。(2)细菌活死染色实验显示,实验组样品表面细菌染色都呈红色荧光,未见明显绿色荧光,且细菌数量明显减少。(3)微生物扫描电镜发现实验组样品表面粘附细菌数量显著减少,且细菌形态不规则,甚至出现了裂解。(2)在体内抗菌有效性实验中:(1)切开后囊袋的大体观察显示对照组出现大量白色脓性分泌物,而实验组未见明显脓性分泌物。(2)细菌定量分析及细菌活死染色结果发现相较于对照组,实验组细菌数量、细菌活力均明显降低,差异具有统计学意义。(3)HE染色发现对照组囊袋组织筋膜层有大量渗出液,并出现明显炎症细胞浸润情况,而实验组未发现明显渗出物及细菌浸润;(4)免疫组化及qPCR实验显示对照组囊袋组织的炎症因子IL-1β和TNF-α表达水平明显升高。综上,本阶段实验证实PEG/2’-O-HTACCS水凝胶具有优异的体外、体内抗菌性能。结论:本研究成功构建了一种光响应PEG/2’-O-HTACCS抗菌水凝胶,不仅拥有良好的生物安全性,还具有优异的体内、体外抗菌性能,可在术前快速固定于CIED表面,最终可用于预防CIED囊袋感染。
O-GalNAc糖基化关键糖基转移酶的功能和性质研究
相较于小分子药物,重组蛋白药物的靶向性强、免疫原性小,逐渐成为各大制药公司关注的热点。目前临床上使用的重组蛋白药物多为糖基化蛋白,糖基化修饰会极大的影响药物的治疗效果。O-GalNAc糖基化与恶性肿瘤、病毒感染等多种疾病的发生与发展存在着密切联系,因此,O-GalNAc糖基化相关糖基转移酶的功能与性质研究对开发治疗性药物有着重要的意义。N-乙酰氨基半乳糖转移酶(polypeptide UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosaminyltransferase,ppGalNAc-T,EC:2.4.1.41)是催化O-GalNAc糖基化起始的糖基转移酶,负责将乙酰氨基半乳糖(GalNAc)残基转移到蛋白的Thr/Ser/Tyr糖基化位点上形成Tn抗原结构;进一步,β1,3半乳糖基转移酶(C1GALT1,EC:2.4.1.122)催化半乳糖(Gal)残基转移到Tn抗原结构上形成T抗原结构,并可以进一步延伸形成生物体内最普遍的Core1结构的O-GalNAc糖链。因此,ppGalNAc-Ts和C1GALT1对于O-GalNAc糖基化机制的研究以及O-糖蛋白药物的生产具有重Ceralasertib供应商要的意义。目前体外O-GalNAc糖蛋白/糖肽合成中常用的ppGalNAc-T为哺乳动物细胞或者昆虫细胞中生产的人源ppGalNAc-Ts,存在产量低、成本高等缺点,无法满足工业化生产O-GalNAc糖蛋白药物的需求。大肠杆菌作为最成熟的蛋白质表达系统,具有生产周期短、产量高、成本低和没有自身的糖基化途径带来的干扰等特点,具有改造成生产高等生物来源糖基转移酶的潜力。在本论文中,通过共表达人源蛋白质二硫键异构酶PDI(Proteindisulfide-isomerase,PDI,EC:5.3.4.1)在大肠杆菌中获得多种结构稳定、酶活性强的ppGalNAc-Ts,并通过融合表达等方法进一步提高ppGalNAc-Ts在大肠杆菌中高效可溶性表达。该工作为高等生物来源的糖基转移酶在大肠杆菌中高效可溶性表达提供一个有力平台。不同于哺乳动物体内的ClGALT1生物活性需要依赖分子伴侣COSMC,果蝇来源的DmC1GalT1具有不依赖分子伴侣、活性高等特点可被用于T抗原结构修饰的糖蛋白/糖肽的合成。本论文使用上文中构建的大肠杆菌表达系统,成功获得具有生物学活性的果蝇来源的DmC1GalT1。为了更好的探究DmC1GalT1的功能和性质,扩展其应用范围,本论文通过结构信息学分析后对DmC1GalT1进行定点突变改造,并建立一锅酶法检测突变体对糖基供体的选择性,筛选具有更宽泛的糖基供体选择性的突变体,为DmC1GalT1在糖蛋白药物合成中的应用奠定了基础。在肿瘤中ppGalNAc-Ts的异常表达可以通过影响底物蛋白的糖基化水平,进而调控底物蛋白的表达、稳定性和功能,促进肿瘤发生和发展。ppGalNAc-Ts以及其调控的哪些特异性O-糖基化底物能促进肿瘤发生发展的作用机制尚未被阐明。在生存率低的乳腺癌病人中,ppGalNAc-T5往往高表达。本论文在不同的人乳腺癌细胞株中使用CRISPR-Cas9技术进行GALNT5基因敲除或GALNT5活性缺失突Staurosporine试剂变体基因敲入,构建了一系列的乳腺癌细胞系。通过细胞实验证实,敲除GALNT5基因并不会影响乳腺癌细胞的增殖,但会较大的抑制细胞的迁移和侵袭。对GALNT5基因影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭的机制进行探究,发现GALNT5并不是通过常规的PI3K-Akt通路和MAPK通路等来发挥作用。最后,通过定量差异糖蛋白组学分析,初步筛选到了一些ppGalNAc-T5的潜在特异性底物,并有多个底物蛋白与肿瘤转移密切相关,我们推测ppGalNAc-T5可能是通过这些糖基化底物来影响肿瘤的发生发展。综上,本文通过共表达人源蛋白质二硫键异构酶PDI和融合表达等方法,构建了高效的生产高等生物来源糖基转移酶的大肠杆菌系统,并成功表达了人ppGalNAc-T1,ppGalNAc-T2,ppGalNAc-T11以及果蝇来源的DmC1GalT1。同时,通过基因定点突变尝试筛选具有更加宽泛的糖基供体选择性的DmC1GalT1突变体,以扩展其在体外合成O-糖蛋白药物中的应用。进一步的,我们利用基因敲除技术和差异糖蛋白组学技术,研究了 ppGalNAc-Tnon-alcoholic steatohepatitis5在乳腺癌中的特异性糖基化底物,为研究O-GalNAc糖基化修饰在乳腺癌中的作用机制以及相关药物研发提供新的思路。