目的:慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的患病率高且发病率上升,造成了巨大的经济负担。酮酸类似物(ketoacid analogues,KA)可补充机体的必需氨基酸,同时不增加肾脏的负担,可延缓CKD进展,但作用机制不完全清楚。肠道菌群和肾脏之间呈现为复杂的相互作用关系,CKD会干扰宿主器官和肠道微生物区系的共生关系。因此本研究拟通过探索KA对CKD小鼠肠道菌群及血清代谢物的影响,为临床使用KA治疗CKD提供理论参考和科学依据,同时进一步探讨CKD的肠道菌群及代谢特点。方法:1、建立CKD小鼠模型:选取C57小鼠,分为对照组、LPD组及KA组,选取单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型结,干预28天后收集小鼠大便、血标本、肾脏标本,测定血肌酐、血尿素氮。2、肠道菌群分析:对大便标本进行16s RNA测序,通过多样性分析、物种组成分析、相关性分析等分析方法研究CKD小鼠肠道菌群的改变。3、血清代谢组学研究:基于超高效液相色谱-高清质谱联用(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer,LC-MS)技术鉴定小鼠血清中的差异代谢产物,随后进行代谢通路富集,筛选出差异代谢产物主要参与的代谢通路。4、肠道菌群与差异代谢物相关性研究:通过Pearson相关分析,探讨CKD小鼠的肠道菌群改变与差异代谢产物之间关系。结果:1、各组生化指标:对照组diABZI STING agonist抑制剂的血肌酐21.08±5.83μmol/L,血尿素氮3.75±1.89 mmol/L,LPD组的血肌酐85.73±14.21μmol/L,血尿素氮19.46±RAD001核磁3.36 mmol/L,KA组的血肌酐56.93±8.86μmol/L,血尿素氮16.70±5.58 mmol/L。可见KA组、LPD组的血肌酐、血尿素氮显著升高,具有统计学意义(F=60.03,p<0.001;F=27.48,p<0.001)。2、CKD小鼠肠道菌群改变:α多样性分析提示对照组、KA组和LPD组的Shannon指数分别为5.970±0.91、6.42±0.48、5.32±0.41,无统计学差异(F=3.76,p=0.05);Simpson指数分别为0.92±0.08、0.97±0.01、0.91±0.04,无统计学差异(Fhealth biomarker=0.67,p=0.527)。门水平上,KA组和LPD组的厚壁菌门(p=0.014,p=0.007)、脱硫菌门(p=0.04,p=0.01)显著升高。属水平上,与对照相比,KA组的脱硫弧菌属(p=0.001)、大肠埃希菌(p=0.003)水平显著升高,乳杆菌属(p=0.039)、普雷沃特拉菌(p=0.015)、梭状芽孢杆菌(p=0.005)明显减少。与LPD组相比,KA组的另枝菌属(p=0.021)水平明显升高,Odoribacter(p=0.003)显著减少。3、CKD小鼠血清代谢产物改变:与LPD组相比,KA组的柠檬酸、瓜氨酸、L-乙酰基肉碱、L-(+)-古洛糖、半乳糖、葡萄糖、谷胱甘肽、3-(3-吲哚基)-2-氧丙酸、Lyso PC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、左棕榈酰肉碱、丙酰肉碱、二甲基精氨酸、神经节苷脂显著升高,磷酸丝氨酸、安替比林、黄嘌呤显著降低。这些代谢产物主要富集于癌症中的胆碱代谢、脂肪酸代谢(亚油酸、甘油磷脂)、氨基酸代谢(精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢),柠檬酸循环(TCA循环)、GABA-神经突触等代谢通路。4、CKD小鼠肠道菌群改变及差异代谢产物的关系:另枝菌属与瓜氨酸(r=0.53,p=0.026)、PC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)/16:1(9Z))(r=0.49,p=0.041)水平正相关;文肯菌属-RC9肠道群与磷酸丝氨酸水平正相关(r=0.53,p=0.026),与瓜氨酸(r=-0.49,p=0.041)、氧戊二酸(r=-0.64,p=0.006)、葡萄糖(r=-0.49,p=0.041)、谷胱甘肽(r=-0.67,p=0.003)水平负相关;幽门螺杆菌与柠檬酸(r=-0.49,p=0.041)、瓜氨酸(r=-0.49,p=0.041)水平负相关。结论:1.UUO模型可作为CKD研究的动物模型。2.CKD小鼠的厚壁菌门、脱硫菌门显著升高;乳杆菌属、普雷沃特拉菌、水平降低,大肠埃希菌属增多。3.KA可影响CKD小鼠肠道菌群,改变血清代谢物水平,延缓CKD进展。4.KA可能通过上调瓜氨酸影响精氨酸的生物合成。5、KA可能通过上调柠檬酸来影响丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢。
果蔬中11种典型农药的免疫分析方法研究
果蔬中农药残留超标问题的频发,严重威胁我国食品安全和居民身体健康。随着食品安全监管范围的不断扩大,传统的仪器分析技术难以满足高通量的现场检测需求,亟需研发快速、高效、廉价的检测手段,为基层食品安全监测提供有效工具。因此,本研究以果蔬中高频或超标检出的11种农药(灭多威、霜霉威、甲拌磷、乙霉威、苯醚甲环唑、咪鲜胺、恶霜灵、乙螨唑、哒螨灵、氯吡脲和二甲戊灵)为研究对象,设计并合成半抗原,制备单克隆抗体,开发胶体金免疫层析检测方法,应用于芹菜、黄瓜、柑橘和猕猴桃中上述农药残留的现场快速检测。1、通过引入苯环合成半抗原并制备单克隆抗体针对灭多威、霜霉威和甲拌磷的结构特征,通过引入刚性苯环作为连接臂合成半抗原,有效暴露各靶标农药的特异性化学结构。在此基础上,与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)偶联制备了完全抗原,并经小鼠免疫、血清筛选、细胞融合和杂交瘤筛选,获得了各农药的特异性杂交瘤细胞(灭多威1D10、霜霉威3G9和甲拌磷4C12),进一步获得各农药的单克隆抗体:半数抑制率(IC_(50))分别为49.83、3.24、8.61 ng/m L;抗体亚型分别Ig G2b、Ig G2b、Ig G2a;亲和力常数K_D分别为2.76×10~(10)、3.64×10~(10)、5.43×10~(10) L/mol;上述抗体与其结构类似物的交叉反应率<1%,均为高特异性抗体。2、从中间体出发合成半抗原并制备单克隆抗体根据苯醚甲iCCA intrahepatic cholangiocarcinoma环唑、咪鲜胺、恶霜灵和乙螨唑的合成路线,筛选其合成路线中的关键中间体,引入3～6碳原子长度的碳链作为间隔臂,使其抗原决定簇得以充分暴露,通过引入的羧基或氨基与载体蛋白BSA偶联,制备完全抗原,并以此为基础获得了高特异性单克隆抗体:苯醚甲环唑2F3、咪鲜胺2F2、恶霜灵4B8、乙螨唑2C6,IC_(50)分别为0.64、0.88、3.68、4.04 ng/m L;亲和力常数K_D分别为6.30×10~(10)、4.90×10~(10)、3.56×10~(11)、3.00×10~(10) L/mol,均为高亲和力抗体;抗体亚型分别是Ig G2b、Ig G2a、Ig G2a、Ig G2a。、3、用原药和类似物衍生合成半抗原并制备单克隆抗体针对哒螨灵、氯吡脲、乙霉威和二甲戊灵的结构特征,从原药或其类似物的母核结构衍生半抗原,最大程度保留原有结构完整性的同时,引入了羧基作为Gefitinib价格活性基团。在此基础上制备了单克隆抗体:乙霉威2H7、哒螨灵3C2、氯吡脲4H5和二甲戊灵1E3,IC_(50)分别为:2.93、2.36、0.13和0.46 ng/m L;亚型分别为Ig G1、Ig G2b、I此网站g G1和Ig G2a;亲和力常数K_D分别为2.96×10~(10)、1.40×10~(11)、3.83×10~(10)和1.85×10~(10) L/mol,均为高亲和力抗体;交叉反应实验表明,上述抗体与其结构类似物的交叉反应<1%,均为高特异性抗体。4、建立胶体金免疫分析方法以上述单克隆抗体为核心原料,优化抗体抗原工作浓度以及样品稀释液,制备了胶体金免疫层析试纸条。蔬菜样本用甲醇/水(v/v=1/4)溶液提取后用样本稀释液(0.01 M PBS,p H 7.4,含1%ON-870)稀释两倍后检测,水果样本用甲醇/水(v/v=1/4)溶液提取后,调节p H至中性再稀释三倍后检测,10 min内肉眼判读检测结果,结果显示试纸条在芹菜中苯醚甲环唑、咪鲜胺、甲拌磷、二甲戊灵、哒螨灵和灭多威的肉眼可视检测限(v LOD)低于100 ng/g;黄瓜中的霜霉威、苯醚甲环唑、咪鲜胺、乙霉威、哒螨灵和恶霜灵的v LOD低于25 ng/g;柑橘和猕猴桃中的苯醚甲环唑、乙螨唑、咪鲜胺、哒螨灵和氯吡脲的v LOD低于20 ng/g。更为重要的是通过在层析试纸条上设置5条检测线,优化胶体金标记抗体浓度以及包被抗原浓度,实现了黄瓜样本中咪鲜胺、乙霉威、苯醚甲环唑、霜霉威和恶霜灵的同时检测,v LOD值分别为:2、20、5、20、和2 ng/g;借助胶体金读数仪实现定量检测,对上述5种农药的检测限(LOD)分别为0.24、2.56、0.52、1.31和0.36 ng/g,均低于国家最大残留限量。综上,本论文建立了11种高特异性抗体,研制了满足果蔬中11种农药的免疫层析试纸条,其检测结果和仪器分析方法的结果一致,适合应用于现场快速检测,满足国家最大残留限量的检测要求,为我国食品安全领域的基层高通量快速检测提供了可靠、有效的检测工具。
果蔬中11种典型农药的免疫分析方法研究
果蔬中农药残留超标问题的频发,严重威胁我国食品安全和居民身体健康。随着食品安全监管范围的不断扩大,传统的仪器分析技术难以满足高通量的现场检测需求,亟需研发快速、高效、廉价的检测手段,为基层食品安全监测提供有效工具。因此,本研究以果蔬中高频或超标检出的11种农药(灭多威、霜霉威、甲拌磷、乙霉威、苯醚甲环唑、咪鲜胺、恶霜灵、乙螨唑、哒螨灵、氯吡脲和二甲戊灵)为研究对象,设计并合成半抗原,制备单克隆抗体,开发胶体金免疫层析检测方法,应用于芹菜、黄瓜、柑橘和猕猴桃中上述农药残留的现场快速检测。1、通过引入苯环合成半抗原并制备单克隆抗体针对灭多威、霜霉威和甲拌磷的结构特征,通过引入刚性苯环作为连接臂合成半抗原,有效暴露各靶标农药的特异性化学结构。在此基础上,与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)偶联制备了完全抗原,并经小鼠免疫、血清筛选、细胞融合和杂交瘤筛选,获得了各农药的特异性杂交瘤细胞(灭多威1D10、霜霉威3G9和甲拌磷4C12),进一步获得各农药的单克隆抗体:半数抑制率(IC_(50))分别为49.83、3.24、8.61 ng/m L;抗体亚型分别Ig G2b、Ig G2b、Ig G2a;亲和力常数K_D分别为2.76×10~(10)、3.64×10~(10)、5.43×10~(10) L/mol;上述抗体与其结构类似物的交叉反应率<1%,均为高特异性抗体。2、从中间体出发合成半抗原并制备单克隆抗体根据苯醚甲iCCA intrahepatic cholangiocarcinoma环唑、咪鲜胺、恶霜灵和乙螨唑的合成路线,筛选其合成路线中的关键中间体,引入3～6碳原子长度的碳链作为间隔臂,使其抗原决定簇得以充分暴露,通过引入的羧基或氨基与载体蛋白BSA偶联,制备完全抗原,并以此为基础获得了高特异性单克隆抗体:苯醚甲环唑2F3、咪鲜胺2F2、恶霜灵4B8、乙螨唑2C6,IC_(50)分别为0.64、0.88、3.68、4.04 ng/m L;亲和力常数K_D分别为6.30×10~(10)、4.90×10~(10)、3.56×10~(11)、3.00×10~(10) L/mol,均为高亲和力抗体;抗体亚型分别是Ig G2b、Ig G2a、Ig G2a、Ig G2a。、3、用原药和类似物衍生合成半抗原并制备单克隆抗体针对哒螨灵、氯吡脲、乙霉威和二甲戊灵的结构特征,从原药或其类似物的母核结构衍生半抗原,最大程度保留原有结构完整性的同时,引入了羧基作为Gefitinib价格活性基团。在此基础上制备了单克隆抗体:乙霉威2H7、哒螨灵3C2、氯吡脲4H5和二甲戊灵1E3,IC_(50)分别为:2.93、2.36、0.13和0.46 ng/m L;亚型分别为Ig G1、Ig G2b、I此网站g G1和Ig G2a;亲和力常数K_D分别为2.96×10~(10)、1.40×10~(11)、3.83×10~(10)和1.85×10~(10) L/mol,均为高亲和力抗体;交叉反应实验表明,上述抗体与其结构类似物的交叉反应<1%,均为高特异性抗体。4、建立胶体金免疫分析方法以上述单克隆抗体为核心原料,优化抗体抗原工作浓度以及样品稀释液,制备了胶体金免疫层析试纸条。蔬菜样本用甲醇/水(v/v=1/4)溶液提取后用样本稀释液(0.01 M PBS,p H 7.4,含1%ON-870)稀释两倍后检测,水果样本用甲醇/水(v/v=1/4)溶液提取后,调节p H至中性再稀释三倍后检测,10 min内肉眼判读检测结果,结果显示试纸条在芹菜中苯醚甲环唑、咪鲜胺、甲拌磷、二甲戊灵、哒螨灵和灭多威的肉眼可视检测限(v LOD)低于100 ng/g;黄瓜中的霜霉威、苯醚甲环唑、咪鲜胺、乙霉威、哒螨灵和恶霜灵的v LOD低于25 ng/g;柑橘和猕猴桃中的苯醚甲环唑、乙螨唑、咪鲜胺、哒螨灵和氯吡脲的v LOD低于20 ng/g。更为重要的是通过在层析试纸条上设置5条检测线,优化胶体金标记抗体浓度以及包被抗原浓度,实现了黄瓜样本中咪鲜胺、乙霉威、苯醚甲环唑、霜霉威和恶霜灵的同时检测,v LOD值分别为:2、20、5、20、和2 ng/g;借助胶体金读数仪实现定量检测,对上述5种农药的检测限(LOD)分别为0.24、2.56、0.52、1.31和0.36 ng/g,均低于国家最大残留限量。综上,本论文建立了11种高特异性抗体,研制了满足果蔬中11种农药的免疫层析试纸条,其检测结果和仪器分析方法的结果一致,适合应用于现场快速检测,满足国家最大残留限量的检测要求,为我国食品安全领域的基层高通量快速检测提供了可靠、有效的检测工具。
CTRP6对阿霉素诱导的心肌细胞损伤的保护作用
目的 探讨C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6（CTRP6）对阿霉cholesterol biosynthesis素（DOX）诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤的影响及其相关作用机制。方法 H9C2心肌细胞损伤模型建立如下：设对照组（NS组），DOX（1μmol/L）组，DOX（1μmol/L）+浓度梯度CTRP6组（CTRP6浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、5μg/mL），培养24h后检测心肌细胞生存率，结果表明CTRP6浓度3μg/mL时心肌细胞的生存率提高最显著，因此后续实验CTRP6浓度选择3μg/mL。后续H9C2心肌细胞实验分组为：对照组（NS组），CTRP6组，DOX（1μmol/L）组，DOX（1μmol/L）+CTRP6（3μg/mL）组。荧光实时定量PCR（real-timePCR）技术和WesternBlot技术检测DOX刺激后CTRP6转录及翻译水平改变，TUNEL检测细胞凋亡水平，使用ELISA试剂盒检测细胞总谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，WesternBlot检测脂联素受体1（AdipoR1）蛋白水平改变，检测AKT/GSK-3β信号通路蛋白表达改变。结果 与对照组（NC）相比Secretase抑制剂，DOX组细胞CTRP6蛋白表达水平及转录水平显著降低（分别降低46.26%及67.74%，P＜0.05）；与DOX组相比，DOX+CTRP6组CTRP6蛋白表达水平显著提高（P＜0.05）；加入不同浓度梯度的CTRP6蛋白，其中DOX+3μg/mselleck激酶抑制剂LCTRP6处理组心肌细胞存活率显著提高了26.48%（P＜0.05）；TUNEL染色显示凋亡减少，Bcl-2表达升高；抗氧化分子GSH-Px及SOD活性分别升高20.49%及36.89%，MDA水平受到显著抑制（降低47.09%，P＜0.05）；AdipoR1蛋白水平显著提高（P＜0.05）；AKT/GSK-3β信号通路蛋白磷酸化水平显著升高。结论 CTRP6改善DOX诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤，可能是通过AKT/GSK-3β通路发挥的保护作用。
汉黄芩素体外抗猪流行性腹泻病毒感染作用的初步研究
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性高度接触性胃肠道传染病。近年来,PEDV的广泛流行及高致病性给我国养猪业造成了巨大的经济损失immune memory。目前,相关研究报道汉黄芩素(Wogonin)对冠状病毒主蛋白酶(Main protein,Mpro,又名3CL蛋白酶)表现出较好的抗病毒活性。研究表明,Mphttps://www.selleck.cn/products/smoothened-agonist-sag-hcl.htmlro在PEDV的复制中起着至关重要的作用,已成为抗PEDV药物设计的重要靶点。本试验首先确定了汉黄芩素的抗PEDV活性,并进一步解析其具体的分子机制。试验方法和结果如下:1.汉黄芩素安全用药浓度的筛选:本试验以Vero和IPEC-J2细胞为研究对象,用不同浓度的汉黄芩素(6.25～400μM)3-MA作用处理细胞,48h后收集细胞样本,通过检测CCK-8含量分析汉黄芩素对细胞活力的影响。结果表明,汉黄芩素对Vero和IPEC-J2细胞的安全浓度为6.25～100μM,其CC_(50)值分别为475.3μM和499.4μM。2.汉黄芩素抗PEDV活性研究:以12.5～100μM浓度的汉黄芩素处理感染PEDV的Vero和IPEC-J2细胞,分析汉黄岑素抗PEDV活性。免疫荧光、RT-PCR和病毒载量结果表明,25～100μM浓度的汉黄芩素均极显著抑制PEDV的感染(P<0.01),其IC_(50)值分别为54.87μM和114.55μM。进一步检测汉黄芩素对PEDV复制周期的影响,结果表明汉黄芩素可以显著抑制PEDV的复制(P<0.05),极显著抑制PEDV的内化和释放(P<0.001),并可以直接体外灭活PEDV(P<0.01)。3.汉黄芩素抗PEDV活性的分子机制研究:通过同源建模和分子对接技术发现汉黄芩素能稳定嵌入到Mpro蛋白活性口袋的凹槽中,从而抑制Mpro结合底物。首先通过表达纯化的PEDV-Mpro蛋白与汉黄芩素的体外结合试验,包括差式扫描荧光法(DSF)、微尺度热泳(MST)和表面等离子体共振技术(SPR),验证了汉黄芩素与PEDV-Mpro之间的稳定性和中等亲和力;其次荧光共振能量转移分析技术(FRET)验证了表达纯化的PEDV-Mpro蛋白的酶活并证实汉黄芩素能够抑制PEDV-Mpro酶活性。综上:汉黄芩素表现出对PEDV的抗病毒活性,能够显著抑制PEDV内化、复制和释放,同时能够直接体外灭活PEDV。通过靶向PEDV-Mpro蛋白底物结合位点抑制Mpro酶活性介导PEDV感染。本研究为深入了解汉黄芩素的抗病毒活性以及抗PEDV药物的研究提供了新方向。
益母草注射液联合缩宫素治疗产后出血的临床效果
目的 观察益母草注射液联合缩宫素治疗产后出血的临床效果。方法 选取2019年1月—2020年12月CX-5461 MW在江西省都昌县妇幼保健院进行分娩的产后出血产妇84例，采用随机数字表法分为研究组和常规组，各42例。常规组采用缩宫素治疗，研究组采用益母草注射液联合缩宫素治疗。比较2组产妇产后1 h、3 h和24 h出血量、产前和产后24 h凝血功能指标、血压水平及产后子宫收缩能力。结果 研究组产妇的产后1 h、3 h和24 https://www.selleck.cn/products/gsk126.htmlh出血量少于常规组(P<0.01);产后24 h, 2组产妇的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)及纤维蛋白(Fib)水平与产前比较无明显变化，且2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。产后24 h, 2组产妇的收缩压、舒张压均高于产前，但infective endaortitis研究组低于常规组(P<0.01)。研究组产妇的子宫收缩幅度、强度和张力明显大于常规组，子宫收缩频率少于常规组(P<0.01)。结论 益母草注射液联合缩宫素治疗产后出血可有效减少产后出血量，维持血压水平稳定，改善子宫收缩能力，且对产妇的凝血功能无明显影响。
桃褐腐病菌MfHOX1基因功能研究
桃褐腐病是一种世界性分布的真菌病害,RNA Isolation严重危害桃果实产量与品质,对我国的桃产业造成巨大的损失。桃褐腐病发病迅速,化学防治是控制桃褐腐病的重要手段之一,经过多年使用,病原菌对广泛用于防治其的DMI类杀菌剂逐渐产生抗性,其机理为DMI靶标基因CYP51的过量表达。因此为进一步探究桃褐腐病菌产生DMI抗性的原因,前期通过DNA pull-down数据比对分析,筛到一些Bucladesine分子式候选的MfCYP51调控蛋白,其中包括Homeobox转录因子MfHOX1。笔者通过同源重组技术敲除了桃褐腐病菌中的MfHOX1基因,构建了该基因的敲除突变体(ΔMfHOX1)。对转化子的生长发育情况、胁迫表型、抗药性等进行测定,结果显示:ΔMfHOX1突变体生长速率显著下降,其对盐胁迫敏感性显著降低,且对DMI类杀菌剂戊唑醇的抗性显著增强。与此同时,致病力试验结果表明,ΔMfHOX1突变体致病力显著降低。转录因子磷酸化/去磷酸化修饰对于其发挥功能具有重要意义,因此更多本研究通过同源重组技术敲除了桃褐腐病菌中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因Pmk1。抗药性试验表明,ΔMfPmk1突变体对DMI类杀菌剂的抗性也有所增强。综上所述,MfHOX1是桃褐腐病菌生长发育、盐胁迫、DMI抗性、致病性的关键调控因子。
木姜叶柯中根皮苷和三叶苷生物合成途径相关基因的鉴定及研究
木姜叶柯[Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun]为壳斗科柯属常绿乔木,主要分布在中国长江以南的山区,印度、泰国也有所分布,其嫩叶可被直接煎煮做成茶汤,长期服用有养生保健功效。木姜叶柯中主要成分为类黄酮和三萜类,根皮苷和三叶苷属于二氢查尔酮类化合物,是木姜叶柯中的主要的活性成分,具有降血糖、降血脂、抗炎和抗肿瘤的生物活性。除此以外,三叶苷还是一种健康的天然甜味剂,其甜度是蔗糖的300倍。但是天然生长的木姜叶柯植株分散,且树形高大,采摘叶片困难,费时费力,不利于有效成分的提取。随着合成生物学技术的发展,基于根皮苷和三叶苷生物合成途径中高效关键酶基因的发现,构建细胞工厂实现相关化合物的异源生产成为一种新的可持续的生产方式。目前,苹果中根皮苷和三叶苷生物合成途径已基本被阐明,多个可以催化根皮素糖苷化的糖基转移酶已经被鉴定,但多存在催化活性低、专一性弱的问题。所以进一步从植物中鉴定催化活性更高、专一性更强的糖基转移酶,是提高根皮苷和三叶苷生物合成产量的重要前提。木姜叶柯中根皮苷和三叶苷的含量丰富,然而目前该植物中尚未有参与根皮苷和三叶苷生物合成途径基因的报道。基于此,本课题对木姜叶柯进行了高通量全长转录组的测序。深入开展了木姜叶柯中根皮苷和三叶苷生物合成途径中关键酶基因的克隆和功能研究,以期发现能够高效催化根皮苷和三叶苷形成的关键酶。主要研究内容如下:1.木姜叶柯不同组织部位根皮苷和三叶苷的含量测定使用UPLC-Q-TOF-MS对木姜叶柯嫩叶、老叶、嫩茎、老茎、根及根茎混合物当中的根皮苷和三叶苷含量进行定量。实验结果表明,根皮苷在木姜叶柯不同组织部位的含量由高到低分别为老叶、嫩茎、根茎混合物、老茎、嫩叶和根,而三叶苷仅在叶中积累,且嫩叶中的积累量是老叶的两倍之多。木姜叶柯中根皮苷和三叶苷的积累为根皮苷和三叶苷合成途径基因的筛选提供了稳定可靠的实验材料,其积累规律为制定转录组测序策略提供了参考。2.木姜叶柯不同组织部位的转录组测序及基因注释结果基于化合物含量检测的结果,采用高通量测序技术对木姜叶柯的根、茎、老叶和嫩叶进行了转录组测序,原始数据经过组装、拼接、去冗余后,共得到34,215个PF-02341066 molecular weightUnigene。比对到NR、Swiss Prot、KEGG、KOG、GO、NT、Pfam等数据库中共注释得到33,669个基因。根据注释信息,从转录组中共筛选到3条PAL基因、15条4CL基因、35条DBR基因、2条CHS基因以及135条UGT基因参与根皮苷和三叶苷生物合成的关键酶基因,为后续基因的全长克隆提供了基础。3.双键还原酶的克隆及生物信息学分析从转录组中筛选到12条候选双键还原酶基因,分别命名为Ll DBR1～Ll DBR12。设计特异性扩增引物,通过PCR技术克隆到12条全长序列。构建p ET28a-HIS-MBP原核表达载体,进行测序分析后获得14条DBR基因序列,其中Ll DBR9测序获得了4条基因序列,Ll DBR11测序获得了2条基因序列。对14条序列进行了生物信息学分析,Ll DBR1～Ll DBR12Hepatic angiosarcoma的ORF区长度在1000～1070 bp之间,编码氨基酸数量在340～360之间。亚细胞定位显示,14个蛋白主要定位在细胞质。多序列比对分析结果表明,14个蛋白均具有保守的GXXS区域和甘氨酸富集区域(AXXGXXG或GXXGXXG)。系统发育树表明,14个蛋白均与已报道功能的蛋白聚在一起,且序列一致性较高。为后期基因的功能鉴定提供了理论依据。4.糖基转移酶的克隆、功能验证和生化特性分析从转录组中筛选到24条候选糖基转移酶基因,分别命名为Ll UGT1～Ll UGT24。设计特异性引物,利用PCR技术克隆得到了20条全长序列。构建p ET28a-HIS-MBP原核表达载体,最终得到21条候选UGT基因,其中Ll UGT9测序获得了3条基因序列。异源表达及体外酶促反应表明,Ll UGT4、Ll UGT7、Ll UGT8、Ll UGT9-1、Ll UGT9-2、Ll UGT9-3、Ll UGT15均能催化根皮素生成糖苷化产物。对这7个蛋白进行了相应的生物信息学分析,选择可以在体外高效催化根皮素生成根皮苷和三叶苷的Ll UGT8和Ll UGT9-3进行酶促反应动力学分析(载体更换为p ET28a)。结果表明,Ll UGT8最佳反应时间为8 h,最适温度在50℃,最佳p H值为8.8的Na_2CO_3-Na HCO_3缓冲体系。Ll UGT9-3最佳反应时间为8 h,PUN30119作用最适温度为40℃,最佳p H值为8.8的Na_2CO_3-Na HCO_3缓冲体系。Ll UGT8的k_m值47.54μM,k_(cat)为0.02 s~(-1),k_(cat)·k_m~(-1)为365.97 mol~(-1)·s~(-1)。Ll UGT9-3的k_m值79.92μM,k_(cat)为0.04 s~(-1),k_(cat)·k_m~(-1)为441.06 mol~(-1)·s~(-1)。底物谱筛选结果表明,Ll UGT8以UDP-Glc为糖基供体,可以催化6种不同结构类型的黄酮类化合物发生糖基化反应,而Ll UGT9-3以UDP-Glc为糖基供体,可以催化15种不同结构类型的黄酮类化合物发生糖基化反应,这表明Ll UGT9-3比Ll UGT8具有更高的底物杂泛性。糖基转移酶生化特性的全面解析为酶的改造提供了理论基础,也为后续在木姜叶柯植物体内的功能研究奠定了基础。本研究基于木姜叶柯转录组数据分析,克隆了可能参与根皮苷和三叶苷生物合成途径的12条DBR基因和24条UGT基因。体外酶促反应发现了7条可以催化根皮素糖基化的糖基转移酶,其中2条可以在体外高效催化根皮素生成根皮苷和三叶苷。同时也对这两个糖基转移酶进行了深入的生化特性研究。本研究为实现根皮苷和三叶苷的合成生物学生产奠定了基础。
基于组学技术探究抗坏血酸对3-MCPD酯致大鼠肾脏损伤的干预作用及维生素C饮料的开发
3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯简称3-氯丙醇酯(3-MCPD酯)是3-MCPD与脂肪酸结合而形成的产物。3-MCPD酯是油脂加工的过程中产生的食品危害物,其危害性目前已被证明。然而,由于目前尚没有合适的方法来减少油脂加工过程中3-MCPD酯的产生,进而减少膳食中3-MCPD酯的摄入,因此营养干预是目前缓解或抑制3-MCPD酯对机体危害的最佳选择之一。本课题基于SD大鼠并结合脂质组学及蛋白质组学技术,探究了抗坏血酸对3-MCPD酯致肾脏损伤的保护作用,具体实验结果如下:(1)以SD大鼠为研究对象建立为期28天的体内实验,分别设立对照组,抗坏血酸组,毒性组以及治疗组,研究不同剂量的抗坏血酸对3-MCPD酯致肾脏毒性的干预效果。研究发现抗坏血酸可以干预由3-MCPD酯摄入引起的肾脏脏器指数升高,可以抑制有3-MCPD酯摄入引起的血清肌酐及尿素氮含量的升高。组织病理学结果显示抗坏血酸可改善由3-MCPD酯诱导的肾小球结构损伤,肾selleckchem Cobimetinib脏炎症等症状。对大鼠肾脏的氧化应激指标进行检测时发现,与毒性组相比抗坏血酸摄入后大鼠肾脏的MDA、GSH水平降低,T-AOC水平升高,且均呈剂量依赖性改变。以上结果表明,抗坏血酸的摄入能改善大鼠肾脏的氧化/抗氧化平衡,降低肾脏的炎症,恢复肾脏功能。(2)基于UPLC-Q-Exactive技术对大鼠肾脏样本进行非靶标脂质组学分析。结果显示,3-MCPD酯摄入后共有183个脂质发生了显著改变,而在抗坏血酸的干预下46个脂质发生了显著改变。进一步分析显示3-MCPD酯的摄入主要干扰了肾脏的甘油磷脂代谢和鞘脂;抗坏血酸主要通过干预大鼠肾脏的甘油磷脂代谢来缓解3-MCPD酯摄入引起的肾脏损伤。经ROC分析筛选后38种脂质被定义为3-MCPD酯诱导肾脏损伤的脂质生物标志物,包括16种TG、14种PC、2种LPC、2种Me PC、1种GM3、1种CER、1种MGDG和1种Zy E;MGDG(20:3＿22:4)、SM(d18:1＿23:1)及TG(16:0＿22:6＿24:0)被确定为抗坏血酸干Immune mechanism预3-MCPD酯诱导肾脏损伤的关键脂质。(3)基于UPLC-Q-Exactive技术并结合TMT定量蛋白质组学技术对大鼠肾脏样本进行分析。结果显示,共有807个蛋白质的表达在3-MCPD酯的摄入后发生了显著变化,在抗坏血酸的干预下共有41个蛋白质的表达发生了显著变化。GO功能富集分析的结果显示,3-MCPD酯的摄入主要影响了肾脏的生物过程是氧化还原过程,分子功能是氧化还原酶活性,主要影响了线粒体的分子构成,抗坏血酸的摄入主要干预了肾脏细胞的生物SB431542溶解度过程是胆固醇运输,分子功能是赖氨酸转运,主要干预了高密度脂蛋白颗粒的分子构成。KEGG通路富集分析的结果显示缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解,药物代谢-P450,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢,细胞色素P450对外源性物质的代谢作用及氧化磷酸化等生物过程随着3-MCPD酯的摄入而发生了改变;胆固醇代谢等通路在抗坏血酸的干预下发生了改变。蛋白质互作分析结果显示Ndufa13、Ndufb10、Ndufa9、Ndufa15、Uqcrb、Cat、Acox3、Dao、Ehhadh及Cox5a等蛋白质的连接度较高,可能在3-MCPD酯诱导肾脏损伤的关键蛋白质;而Apoa1、Bccip、Commd9、Snrpd1、Snrpd3、Snrpb2、Snrpc及Prpf19等可能是抗坏血酸干预的关键蛋白质。(4)开发了一种利用干酪乳杆菌发酵维生素C的诺丽果饮料。采用干酪乳杆菌发酵诺丽果,并对饮料的相关指标进行检测。结果显示,发酵能明显改善诺丽果饮料的口感,对诺丽果饮料的组织状态、口感、气味及总体可接受度上均有明显提升,但是对色泽得分无明显改变。发酵会降低饮料的p H值及可溶性固形物含量,且与发酵时间成正比关系。对色泽指标进行检测后发现,发酵对诺丽果饮料的色度值无显著影响,但是会显著降低其色调值。此外,饮料中的维生素C含量不随干酪乳杆菌的发酵而改变,该工艺制备的发酵诺丽果饮料中维生素C的含量约为12.5 mg/100g。
氮掺杂二维黑磷材料的合成及其在肿瘤治疗中的应用
恶性肿瘤是一个国际性的健康挑战,它对人类健康造成了重大威胁。化疗是一种有效的治疗癌症的方法,但化学药物会对正常细胞产生一定毒性。因此,开发一种更加安全、更加高效的肿瘤诊断治疗纳米平台,将为癌症患者带来福音。其中,光学治疗具备损伤小、危害性低和副反应少等优点,其治疗原理是在特定的光照下,产生单线态氧(~1O_2)或产生高温,杀死肿瘤细胞。同时,在二维纳米材料家族中,黑磷(Black phosphorus,BP)具有出色的生物降解性和生物安全性,可以有效地减少对生物体的危害,从而为患者提供更加安全、更加有效的治疗方法。遗憾的是,目前关于BP在肿瘤微环境荧光成像的研究仍然相对较少,荧光成像能够对细胞加以标记,记www.selleck.cn/products/CP-690550录细胞的变化。基于此,本文在溶剂热法制备蓝色荧光黑磷纳米片(BPNs)的基础上,通过不同含量氮元素掺杂黑磷纳米片制备出多色荧光黑磷纳米片(N/BPNs),然后利用光动力-光Cell Biology热疗法原理协同660 nm激光诱导抑制肿瘤生长。首先,借助透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)表征所制备材料的横向尺寸大小、厚度以及形貌。荧光分光光度计(FL)分析多色荧光黑磷纳米片的图谱与365 nm紫外灯和405 nm激光器照射下的荧光现象相符合,紫外吸收光谱在218 nm处的吸收峰证明掺杂后对黑磷自身未造成不利影响。傅里叶变换红外(FLBH589T-IR)谱图与X射线光电子能谱(XPS)均证明不同含量氮掺杂造成黑磷表面不同程度氧化是其荧光出现红移的重要原因。同时,BPNs和N/BPNs在不同p H值环境下的荧光稳定性,1,3-二苯基异苯并吠喃(DPBF)降解实验和电子自旋共振(ESR)结果表明制备的多色黑磷纳米片不仅稳定性好,在可见光下还可以生成~1O_2且生成速率随波长梯度递增,具有优异的光动力特性。接下来,探究材料的生物安全性,细胞成像示踪效果,以及在无激光照射下和有激光照射下不同材料处理后肿瘤的治疗效果。首先从细胞毒性层面和小鼠尾静脉注射后生理指标正常,证实了材料的生物安全性。然后用相同浓度的BPNs和N/BPNs分别处理肝癌细胞,细胞中分别出现明显的蓝色荧光,绿色荧光,黄色荧光,橙色荧光以及红色荧光,达到了示踪标记细胞的效果。最后,构建小鼠肿瘤模型,经过14天的治疗周期后,材料组小鼠均表现出一定抑制肿瘤的效果。加入激光后,材料组均表现出更明显的抑制效果,其中R-N/BPNs的治疗效果最好。综上所述,所制备的BPNs和N/BPNs不仅具有优异的光学性能,在肿瘤的治疗过程中也表现出极大的应用潜力。