Achr receptor

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。世界范围内,膀胱癌发病率位居恶性肿瘤的第9位,男性恶性肿瘤的第7位(9.5/10万),女性为第10位(2.410/10万);死亡率居恶性肿瘤的第13位,其中男性死亡率为3.2/10万,女性为0.9/10万。目前手术、放疗和化疗是治疗膀胱癌的常规手段,但由于手术之后的高复发率,以及放疗和化疗的毒副作用这使得癌症治愈率维持在一个极低的水平。光热治疗(Photothermal therapy,PTT)作为一种新兴的无创肿瘤治疗技术,凭借其局部、高效、副作用小等优势成为了肿瘤治疗领域的热点。在PTT中,光热剂在近红外激光照射下将光能转化为热能来诱导癌细胞凋亡。其中,光热剂是PTAirborne microbiomeT的核心,通过对光热纳米材料的修饰,光热纳米材料的功能性也越来越强。其中无机纳米光热材料因其易制备、易于修饰、高效的光热转化率以及价格低廉等优势备受研究者们的关注。尽管如此,光热剂的光热转换效率、生物相容性和安全性以及生物降解性等仍是目前急需解决的重要因素。基于此本论文设计构建基于贵金属的新型纳米粒子,同时结合放射疗法(RT)、化学动力疗法(CDT)获得了高效协同治疗膀胱癌的效果,同时也探讨了贵金属纳米颗粒在生物医用的潜在价值。本文主要包括四部分:(1)第一部分选择通过一锅原位还原法合成了纳米棒Pd Te(Pd Te NR),通过理化性质和结构的研究,Pd Te不仅光热转换效率高、光稳定性好等特点,而且Pd Te具有类CAT性质可以分解H_2O_2转化为O_2,以克服缺氧,提高热放疗的效果。由于Pd和Te都是典型的高Z元素可以增强X射线的剂量沉积,因此Pd Te纳米酶在肿瘤细胞中表现出显著的放射增敏能力,随后以MBT-2肿瘤细胞为模型,研究表明Pd Te纳米粒子增强热放疗的治疗效果并且具备良好的生物安全性。(2)第二部分通过以MBT-2荷瘤小鼠为模型,构建了Pd Te NR纳米制剂协同热放疗的纳米治疗平台。研究结果表明Pd Te NR介导的热放射疗法成功诱导了肿瘤的消融。与此同时,经过光热治疗后,小鼠肿瘤部位缺氧情况得到明显的改善,放疗的治疗效果大大提高。动物的血液生化指标表明Pd Te NSC 127716NR在体内具有良好生物安全性,因此Pd Te NR是一种有潜力的多功能纳米粒子,在增强放射治疗方面具有巨大的潜力。(3)第三部分制备了高催化活性的超小铜钯纳米粒子(CP NPs),并用于协同CDT和PTT的肿瘤治疗。CP NPs在肿瘤区域积累并进入肿瘤细胞后,铜离子(Cu~(2+))与细胞内GSH发生反应,使其水平降低。接下来,形成的亚铜离子(Cu~+)与肿瘤部位过表达的H_2O_2反应生成大量有毒的羟基自由基(·OH),从而诱导细胞死亡。此外,在近红外光808 nm激光照射下,CP NPs表现出显著的光热转换率,对肿瘤Compound C molecular weight组织进行了特异性消融,这也进一步增强了CDT的治疗效果。在细胞实验中,CP NPs在协同CDT和PTT联合治疗中显著的抑制了膀胱癌细胞(MB-49)的生长,这充分证实了CP NPs高效的化学动力—光热协同治疗效果。(4)第四部分中以MB-49小鼠动物为模型,继续深入探究CP NPs体内抗肿瘤治疗效果。研究结果表明,CP NPs介导的CDT/PTT成功诱导了肿瘤的死亡。与此同时,动物的血液生化指标表明在体内具有良好的稳定性和生物安全性,这为肿瘤精准治疗的提供了新思路。综上所述,本论文立足于医学、无机化学与生物学的多学科交叉研究,为贵金属纳米颗粒在膀胱癌的光热治疗方面进行了较为深入的研究,为纳米药物治疗膀胱癌提供新的科研思路及理论依据。

目的 观察米氮平联合西酞普兰治疗抑郁症伴睡眠障碍的临床疗效及对睡眠质量的影响。方法 选取2021年5月—2023年5月宁德市康复医院收治的80例抑郁症伴睡眠障碍患者作为研究对象，采用随机数字表法分为西酞普兰组和联合米氮平组，各40例。西酞普兰组患者采用西酞普兰治疗，联合米氮平组患者在西酞普Dibutyryl-cAMP体外兰组基础上联合米氮平治疗，2组用药周期均为2～4周。比较2组临床疗效，治疗前后匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)、汉密尔顿焦虑量表(HAMA)、汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分及治疗后多导睡眠图指标、不良反应。结果 联合米氮平组患者治疗总有效率高于西酞普兰组(92.50%vs. 75.00%,χ~CHIR-99021半抑制浓度2=4.501,P=0.034)。治疗结束后，2组PSQI、HAMA、HAMD评分低于治疗前，且联合米氮平组低于西酞普兰组(P<0.01);联合米氮平组总睡眠时间、慢波睡眠时间长于西酞普兰组，睡眠潜伏期短于西酞普兰组，觉醒次数少于西酞普兰组，睡眠效率高于西酞普兰组(P<0.01)。联合米氮平组与西酞普兰组不良反应总发生率比较，差异无统计学意义(10.00%vs. 7.50%,P=1.000)。结论 米氮平联合西酞普兰治疗抑郁症伴睡眠障碍患者可增强疗效，有效地提高患者的睡animal component-free medium眠质量，缓解焦虑、抑郁情绪，且安全性较高。

目的 利用介孔生物活性玻璃纳米颗粒(mesoporous bioactive glass nanoparticles, MBGN)增强聚己内酯(poly-caprolactone, PCL)静电纺丝纳米纤维制备3D骨组织工程支架，并探究该支架材料的体外抑炎功能。方法 通过静电纺丝获得PCL静电纺丝膜，溶胶-凝胶法制得MBGN。经过分散、均质化、筛选、冻干、明胶热自组装、羧甲基壳聚糖表面修饰等步骤，制备得到MBGN增强PCL静电纺丝纳米纤维3D骨组织工程(bone tissue engineering, BTE)支架PCL@MBGN。扫描电镜、能谱仪等检测支架表征。CCK-8法和活死细胞染色法检测支架的生物相容性。采用脂多糖(lipopolysaccharSBE-β-CD molecular weightide, LPS)刺激RAW264.7细胞12 h,诱导巨噬细胞向M1型极化后用含不同MBGN添加量的PCL@MBGN支架浸提液刺激细胞48 h,流式细胞术检测M1、M2型巨噬细胞特征性表面标记分子CD86、CD206表达水平，并使用qRT-PCR法检测炎性相关细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1 beta, IL-1β)、白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOs)的转录水平。结果 随着MBGN添加量增加，扫描电镜下支架表面球状微粒增加，但没有显著影响支架的宏观形貌。PMedical illustrationsCL@MBGN在体外不仅拥有良好的生物相容性，而且可抑制LPS诱导的促炎型M1巨噬细胞极化，CD86表达降低(P<0.05),在一定程度上促进抑炎型M2巨噬细胞极化，CD206表达增高(P<0.05);抑制IL-1β、TNF-α、iNOs等促炎细胞因子的基因转录(P<0.05),同时还促进抑selleckchem炎细胞因子IL-4表达(P<0.05),发挥体外免疫调节作用。结论 本研究成功制备了具有3D结构的纳米纤维支架PCL@MBGN,MBGN的加入没有显著影响支架的形貌且支架无细胞毒性，具有抑炎作用。PCL@MBGN在炎症环境下的骨缺损修复中具有很大的应用前景。

作为临床常见危重症之一,急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是指多种病因引起的短时间内肾功能快速减退而出现的临床综合征。尽管AKI的发生率和死亡率较高,但目前临床的主要治疗方式为对症支持疗法,包括纠正电解质紊乱、维持酸碱平衡和提供营养支持等措施,尚无更积极有效的针对性治疗方法。由于AKI病因的复杂性和肾脏的特殊结构,其靶向药物递送系统一直是研究难点,亟需开发更有效的药物、设计更具针对性的靶向递送系统来预防和治疗AKI。AKI的损伤机制通常包括氧化应激、炎症、细胞凋亡、细胞膜损伤、细胞内酸碱平衡失调等。因此,通过降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、抑制炎症、减少细胞凋亡等机制有可能改善AKI。为筛选治疗AKI的化合物,通过检索PUBMED、SciFinder等文摘数据库,知网、万方等全文数据库,Web of Science、Chinese Science Citation Database 等引文数据库,以及药渡、药易云等新药研发数据库,建立了包含341种化合物的AKI候选化合物库。经过细胞毒性模型、细胞损伤模型、细胞炎症模型,以及大鼠AKI模型的筛选,发现小分子化合物磷酸芦可替尼(ruBLZ945临床试验xolitinib phosphate,RP)可以通过炎症抑制作用和细胞保护作用来改善AKI,具有良好的治疗肾脏疾病的潜力。但芦可替尼具有一定的血液学毒性,可能导致循环中的白细胞、淋巴细胞、血小板、中性粒细胞水平降低,在一定程度上限制了其临床应用。因此,本课题设想通过制剂学手段提高芦可替尼的肾脏靶向性,降低其对非靶组织的毒副作用,增强芦可替尼对AKI的治疗效果。近年来,新型二维材料黑磷纳米片(black phosphorus nanosheets,BPNSs)在生物医学领域得到了广泛的关注和应用。BPNSs在肾脏靶向递送领域具有以下优势:首先,其较高的表面积与体积比利于CCRG 81045提高载药量;其次,它的片层结构可以形状依赖性的被动靶向肾脏;除此之外,BPNSs在较低的pH环境下可以加速释放药物,AKI中患病肾脏在炎症情况下存在酸性微环境,BPNSs载药的pH响应性释放有利于肾脏给药;最后,BPNSs可以快速清除病变部位过度累积的ROS,有效保护肾脏。因此,本课题选用BPNSs作为药物递送载体,高效装载芦可替尼进行肾脏靶向给药。肾小管损伤是AKI的主要表现之一,因此肾小管上皮细胞是AKI治疗的重要靶点。带正电的肾小管靶向肽G3-C12能够通过巨蛋白介导的内吞作用在近端小管被重吸收,有效提高偶联药物在肾脏中的累积。为提高BPNSs的靶向性,使用G3-C12肽通过静电相互作用进行修饰,构建了 RP@BPNSs@G3-C12功能化纳米递药系统。该系统通过静脉注射进入血液循环,主动靶向至肾小管上皮细胞,被肾小管上皮细胞内吞后释放芦可替尼,缓解肾脏损伤。本课题使用液相剥离法制备BPNSs,通过静电相互作用制备RP@BPNSs@G3-C12;设计正交试验对制备方法进行优化,考察芦可替尼与BPNSs的质量比、搅拌时间、离心转速和离心时间对RP@BPNSs@G3-C12的包封率的影响,以确定最佳制备条件;然后对优化后的制备方法进行验证,发现RP@BPNSs@G3-C12的包封率为87.4%,表明该制备方法具有良好的稳定性和可行性。接下来对纳米递送系统进行了理化性质表征。DLS结果表明,非靶向BPNSs的粒径为 106.0 nm,Zeta 电位为-29.6±6.81 mV;靶向 BPNSs@G3-C12 的粒径为 122.4 nm,Zeta电位为-13.3±4.59 mV;RP@BPNSs@G3-C12的粒径为132.8 nm,Zeta电位为-5.31±4.83 mV,Zeta电位的改变提示芦可替尼和G3-C12通过静电相互作用成功吸附在BPNSs表面;透射电子显微镜观察到BPNSs具有片层结构;体外释放结果表明,与pH=7.4的情况下相比,芦可替尼的释放速率在pH=5.0时大大增加,说明递送载体在酸性环境中快速释放药物,有利于对疾病状态下的肾脏给药;稳定性评价结果显示,递送载体在储存和体内循环中均具有较好的稳定性;同时,本课题研究了递送系统的细胞毒性和细胞摄取机制,发现在0～200μg/mL的浓度范围内,BPNSs及其制剂没有明显的细胞毒性;并且,研究发现G3-C12修饰后递送系统的细胞摄取增加,其内吞过程主要是通过能量依赖的巨胞饮作用介导的。采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的NRK-52E细胞模型评价了RP@BPNSs@G3-C12的体外抗炎作用。NRK-52E细胞与递送系统共孵育后,发现LPS诱导的细胞上清液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素6(interleukin6,IL-6)的含量降低;LPS诱导的细胞中TNF-α、IL-6的mRNA水平和JNK、NF-κB蛋白的磷酸化水平均下降,说明递送载体可有效抑制LPS诱导的NRK-52E细胞炎症。采用阿霉素和过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)诱导的NRK-52E细胞损伤模型评价了 RP@BPNSs@G3-C12的细胞保护作用。发现递送载体以浓度依赖的方式保护细胞免受阿霉素诱导的细胞死亡,并抑制H2O2诱导的细胞氧化应激,降低ROS水平;在体外抗细胞凋亡作用研究中,发现递送载体抑制了 H2O2诱导的细胞凋亡,递送载体预处理后,细胞内cleaved Caspase-3的蛋白水平和Caspase-3的活性均显著降低,表明递送载体对阿霉素诱导的细胞损伤、H202诱导的体外氧化应激和细胞凋亡具有良好的保护作用。采用阿霉素诱导的AKI大鼠模型评价了 RP@BPNSs@G3-C12的体内药效学,并进行了作用机制研究。首先对递送载体的生物相容性进行了评价,发现其具有良好的生物安全性,对芦可替尼的血液学毒性具有较好的改善作用,并且其在尾静脉注射后可以快速靶向并特异性地积聚在AKI大鼠的肾脏中;接下来检测了大鼠的肾功能指标,并对肾脏进行H&E染色、TUNEL染色、CD68免疫染色,发现递送载体给药后AKI大鼠的肾功能明显改善;提取大鼠肾脏mRNA并进行RNA-Seq研究递送载体的作用机制,发现其治疗作用是通过细胞凋亡、炎症、氧化磷酸化等通路介导的;进一步对相关通路进行验证,发现递送载体给药后,大鼠血中TNF-α、IL-6及白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)的水平下降,提示全身炎症状态的改善;AKI大鼠的肾损伤分子1(serum kidney injury molecule-1,KIM-1)、中性粒细胞相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)的水平,以及 Caspase-3 的活性降低,提示其对肾脏损伤的修复作用;最后,检测了大鼠肾脏中ROS、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量变化,发现递送载体可以显著提高肾脏的SOD活性,降低ROS活性及MDA含量,说明递送载体给药抑制了大鼠肾脏的氧化应激状态。综上,本课题发现了芦可替尼作为AKI治疗药物的巨大潜力,并构建了RP@BPNSs@G3-C12药物递送系统,具备良好的AKI肾脏靶向能力和pH响应性释药特性。体内外研究均显示出RP@BPNSs@G3-C12对炎症、氧化应激和细胞凋亡的显著抑制作用,并对阿霉Arbuscular mycorrhizal symbiosis素诱导的AKI损伤具有明显的治疗效果,表明RP@BPNSs@G3-C12作为一种新型肾脏给药递送系统,在AKI治疗方面具有巨大的优势和潜在的临床应用价值。

目的通过对恒河猴单次肌肉注射新冠病biocontrol efficacy毒mRNA疫苗后观察14天,观察其可能引起的毒性反应,包括毒性反应的性质、程度、剂量-反应关系、时间-反应关系和可逆性等;判断毒性靶器官或靶组织;为评价临床使用的安全性提供参考。材料和方法选取3.6～4.1岁的恒河猴6只,雌雄各半,按体重、性别随机分成3组,分别为生理盐水对照组、空白LNP对照组、疫苗组,每组各2只动物(♀、♂各半),双侧前肢三角肌多点肌肉注射给予生理盐水更多、空白LNP、疫苗(4剂/400μg),给药体积均为2 mL/只。临床观察:给药后密切观察6 h,以后每天观察1次,连续观察14天。体重:药前、给药D2、D3、D7、D14称体重。摄食量:药前、给药D1～D2、D3～D4、D7～D8、D12～D13称摄食量。体温:药前、给药0.5 h、5 h、24 h、D3、D7、D14检测。眼科、心电图、血液学、血生化、尿液:药前、给药D3、D7、D14检测。所有动物均在给药D15用3%戊巴比妥钠溶液,体积1 mL/kg,在前肢头静脉注射麻醉后放血实施安乐死,并进行大体解剖及肉眼观察,发现异常情况进行组织病理学检查。结果临床观察:各组动物均未观察到任何不良反应和异常体征。体重:在给药D2,疫苗组♂3#、♀6#动物,空白LNP对照组♂2#、♀5#动物,生理盐水对照组♀4#动物的体重均一过性降低,降低幅度≤0.16 kg;各组动物其余时间点的体重均随时间变化稳定增加,增加幅度基本一致。摄食量:各组动物摄食量均未见异常。体温:给药后疫苗组动物体温均一过性升高,其中♂3#动物在给药0.5 h体温开始升高,在给药D3达到最高至39.7℃,升高幅度为1.2℃;♀6#动物在给药5 h体温达到最高至39.7℃,升高幅度为0.9℃;各组动物其余时间点的体温均未见异常。眼科、心电图:各组动物眼科和心电图检查均未见异常。血液学、血生化、尿液:各组动物血液学(含凝血)、血生化、尿液各指标均未见异常。大体解剖:大体解剖观察,各动物组织脏器均未见异常改变。结论在本试验条件下,新冠病毒mRNA疫苗单次肌肉注射给予恒河猴4剂/400μg,给药体积2 mL,在15天观察期内所有动物均出现一过性的体温升高,但未见动物死亡,NVP-TNKS656试剂故新冠病毒mRNA疫苗单次肌肉注射给予恒河猴的最大耐受剂量(MTD)为4剂/400μg。

玉米(Zea mays L.)是世界上重要的粮食作物、饲料作物和工业原料,其种植范围几乎遍及全球。随着重工业的快速发展和环境污染的加剧,重金属污染已成为全球最严重的生态环境问题之一。铅(Pb)是一种毒性较强的重金属污染物,对植物的生长发育和生理功能等产生负面影响,它通过食物链、空气和水进入人体对健康造成不可逆的损害。因此,挖掘玉米铅耐受性相关基因并深入解析其遗传和分子机制,对培育低积累或高富集Pb的玉米品种、推进玉米安全生产和Pb土壤生物修复具有重要意义。植物碱性亮氨酸拉链(b ZIP)转录因子是真核生物中广泛分布且相对保守的一个基因家族,其调控植物的生长发育和生理过程,在植物抗寒、抗旱、抗盐和抗热等非生物胁迫中也发挥着重要作用。迄今为止,鲜有关于b ZIP基因调控玉米Pb胁迫耐受性的分子机制报道。课题组前期发现,ZmbZIP54和ZmbZIP107转录因子能够增强玉米幼苗对Pb胁迫的耐受性。因此,本研究进一步探索这两个b ZIP转录因子在玉米幼苗响应Pb胁迫过程中的调控网络和耐受性机制。本文结合候选基因关联分析、转基因过表达系和突变系表型鉴定、异源表达等方法证实了ZmbZIP54和ZmbZIP107可以增强幼苗对Pb胁迫的耐受性且降低了根系对Pb的吸收。通过Pb离子绿色荧光探针、透射电镜(TEM)、能谱分析(EDS)及不同化学形态测定等技术对细胞中Pb离子的分布、形态及耐受性生理机制进行了鉴定。利用酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H)、双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)、酵母单杂交(Yeast one hybrid,Y1H)、双荧光素酶(Luciferase assay,LUC)和转录组分析等技术构建了b ZIP转录因子调控玉米铅耐受性的分子网络。取得的主要结果如下:(1)对272份玉米自交系中ZmbZIP54启动子LXH254溶解度区和基因本体进行了根耐铅系数(RW-LTC)表型的候选基因关联分析,结合启动子LUC活性验证,揭示了ZmbZIP54基因5′-UTR的变异调控了Pb胁迫下ZmbZIP54表达水平,导致了不同玉米自交系对Pb耐受性的变异。证明了水杨酸(SA)信号通过抑制玉米根系中ZmbZIP54表达促进玉米根系对铅的吸收并抑制铅胁迫下根系的发育。(2)酵母突变株Δycf1异源表达ZmbZIP54增强了酵母细胞对Pb胁迫的耐受性。Δycf1-ZmbZIP54的Pb含量相较于WT-p YES2和Δycf1-p YES2分别显著降低了25.7%和42.3%。玉米原生质体亚细胞定位显示ZmbZIP54基因定位于细胞核。q RT-PCR结果显示,ZmbZIP54在玉米各组织部位均有表达,其在三叶期的根中表达量最高。同时,ZmbZIP54的表达受Pb胁迫的诱导,其在根系中的表达水平随胁迫时间的增加呈现先升高后下降的表达趋势。(3)Pb离子绿色荧光探针检测结果显示,Pb主要积累在玉米根尖的分生区和伸长区,ZmbZIP54玉米过表达(OE)株系根尖的荧光强度与野生型对照相比降低了47.57%-77.97%;zmbzip54突变体根尖中的荧光强度与野生型相比增加了42.61%-41.73%。TEM和EDS结果显示,OE株系中的Pb主要以针状沉积物的形式附着在细胞壁上或以聚合物的形式存在于细胞间隙,只有微量的Pb进入细胞内部;突变体株系中的Pb透过细胞壁进入细胞质,与细胞质中的物质形成聚合物并富集在细胞器和细胞质中,使玉米根细胞产生质壁分离,至组织失水死亡。在zmbzip54突变体、野生型W22、OE和野生型B104株系的根尖沉积物中分别检测到了6、5、5、5个含Pb化合物的峰值。其中,突变体中Pb的峰值明显高于野生型W22;OE株系中Pb的峰值明显较低。Pb不同化学形态测定结果显示,在B104和OE株系中,Pb的主要成分是由盐酸取的草酸铅和醋酸取的难溶性磷酸铅,分别占总量的50%-61.7%和12.9%-25%;而W22和zmbzip54突变体株系中,主要是盐酸取态的Pb和由乙醇取的易转移且毒性较大的无机物形态的Pb,分别占总量的42.7%-47.5%和23%-25.7%。(4)双荧光素酶实验(LUC)、酵母单杂交(Y1H)和玉米原生质体LUC活性分析表明,ZmbZIP54与ZmPRP1的启动子结合并促进其转录。时空特异性表达模式分析显示,ZmPRP1在玉米根中表达量最高,被Pb处理诱导表达,且随着Pb处理时间的增加逐渐上调。在zmbzip54突变体的原生质体中回补ZmPRP1,转化体的单位面积内未受损的原生质体数量显著高于阴性对照,表明回补ZmPRP1可以高玉米突变体zmbzip54对Pb的耐受性。酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(Bi FC)分析表明,ZmbZIP5NSC125066 IC504与ZmFdx5在细胞核内发生蛋白互作,二者的互作抑制了ZmbZIP54对ZmPRP1的转录促进作用。在所有遗传材料中,ZmFdx5在对照条件下玉米根的表达量远远高于铅处理条件,说明ZmFdx5与ZmbZIP54主要发生在正常条件下。(5)对ZmbZIP54的过表达、突变体和野生型材料进行Pb胁迫下转录组分析,结果表明,ZmbZIP54基因调控下游非生物胁迫响应通路和植物激素信号传导通路。结合RNA-Seq数据和基因功能注释筛选到了一个编码重金属转运的蛋白ZmNRAMP6,结合Y1H和LUC实验验证了ZmbZIP54通过与ZmNRAMP6的启动子上的G-box元件结合并抑制其转录表达,从而调控玉米对重金属Pb的吸收及转运。(6)构建了由ZmbZIP54介导的玉米幼苗Pb耐受性的分子调控网络。ZmbZIP54蛋白与ZmPRP1启动子结合并促进其转录,ZmPRP1通过改变氧化还原系统的平衡来介导玉米对Pb的耐受性。作为ZmbZIP54的互作蛋白,ZmFdx5作为一个分子开关,控制ZmbZIP54对ZmPRP1表达的调控的转换。在正常条件下,高表达的ZmFdx5通过与ZmbZIP54相互作用抑制ZmPRP1的表达,有助于玉米的节能机制。在Pb胁迫条件下,ZmFdx5表达量显著降低从而减少其与ZmbZIP54的互作,促使ZmbZIP54与ZmPRP1结合并促进其表达,从而调节玉米对Pb胁迫的耐受性。另一方面,ZmbZIP54通过与ZmNRAMP6启动子结合并抑制其表达有效地减少了根系中Pb离子向地上部分的转运,一定程度上保护了地上部分免受Pb的毒害。(7)烟草叶片亚细胞定位表明,ZmbZIP107定位于细胞核。组织表达模式分析显示,ZmbZIP107在玉米三叶期的根组织中高表达。在水稻中异源表达ZmbZIP107增强了幼苗对Pb的耐受性,在Pb胁迫处理条件下OE系的总根长(TRL)、根表面积(TSA)、根delayed antiviral immune response数比(BSH)、初生根长(PRL)、最大根数(MNR)和株高(SHL)相较于野生型显著高了7.3%-21.9%。对Pb含量测定发现与野生型相比,OE株系的根系中Pb含量显著降低了42.3%和41.4%,但地上部分的Pb含量无显著差异。表明高ZmbZIP107在水稻株系中的表达可以有效抑制根系对Pb的吸收,进而缓解Pb对幼苗的毒害。

Zn~(2+)是人体内第二大必需微量元素,其稳态对维持生命功能至关重要。在海马苔藓纤维束中的Zn~(2+)主要通过锌转运蛋白ZnT3转运到突触小泡内,而海马体是大脑中涉及学习和记忆的区域。ZnT3的缺乏会导致大脑中锌稳态的失调,被认为与一些神经类疾病如帕金森和发热性癫痫的发生发展有密切关系。通过对癫痫状态的小鼠的研究,发现ZnT3蛋白的表达上调。因此,ZnT3可能成为治疗这类神经类疾病的一个新靶点。解析ZnT3的结构以及了解ZnBMN 673价格T3转运锌离子时的构象变化对这些神经类疾病的治疗有一定的参考价值。最近解析的4.1(?)分辨率的人ZnT8冷冻电镜结构揭示了Zn T家族结合锌离子时,朝向囊腔侧开放的构象。在本研究中,我们在胞质侧p H 7.6的条件下纯化人源ZnT3蛋白,获得了ZnT3结合锌离子时,朝向胞质侧开放的构象(分辨率为3.14(?)),有助于深入理解Zn T家族质子驱动锌离子转运的机制。同时,在囊腔侧p H 6.0的条件下进行纯化,并未获得朝向囊腔侧开放的构象。通过与囊腔侧开放的ZnT8的构象进行比较,可以得出Zn T家族锌离子转运的构象变化过程:跨膜螺旋(transmembrane helix)TMH3和TMH6与C-末端结构域(C-terminal domain,CTD)一起参与二聚化的形成,在由朝胞质侧开放转化到朝囊腔侧开放的状态时,TMH1和TMH2以胞质侧为支点,向外打开,TMH4和TMH5以囊腔侧为支MDV3100核磁点,向内收拢,完成整个转运的过程。研究发现高脂肪低碳水化合物的生酮饮食对于耐药难治疗性癫痫有治疗的效果,锌代谢和脂质代谢之间可能存在着某些关联。我们从结构密度图中发现了一个可能为磷脂酰甘油的密度,并设Universal Immunization Program计了细胞转运锌离子活性实验,验证了在磷脂酰甘油附近第286位点的精氨酸可能对ZnT3转运活性有影响,而关于磷脂在ZnT3中发挥的作用还需要进一步的研究。总之,本研究为ZnT家族的锌离子转运机制提供了结构上的见解,为小分子药物的虚拟筛选提供了结构基础。

甜味蛋白monellin具有甜味强度高、产生热量低、在体内可分解成氨基酸供人体吸收利用等优点,并可以作为一种甜味替代品供一些爱糖人士或一些需要严格控制糖摄入的糖尿病患者使用。但是,该蛋白的耐高温能力较弱,严重限制了其在食品、饮料和医药行业中的应用。此外,尽管甜味蛋白monellin在酵母及大肠杆菌中获得成功的异源表达,但考虑到其本身的耐酸碱性和耐热性较差,产量偏低,不能满足工业化生产。因此,通过蛋白质工程的方法优化其性质,是提高该蛋白应用潜力的重要策略。本研究中,将含有单链monellin(MNEI)基因的重组质粒(p ET15b-MNEI)转化到大肠杆菌BL21中进行异源表达,获得的总蛋白液经过离心、超声破壁以及镍柱亲和层析纯化收集目的蛋白,随后由专业小组成员采用双PCI-32765化学结构盲法测定目的蛋白的甜味阈值,测得野生型monellin阈值为1.12μg/m L。通过圆二色谱仪测定波长190-260 nm处蛋白溶液二级结构的光谱变化情况。然后测定蛋白样品在固定波长222 nm处,从50℃到95℃逐渐升温中的光谱变化情况,代入公式求得蛋白熔点温度(T_m),野生型monellin T_m值为74℃。为了提升monellin蛋白的甜度和耐热性,根据蛋白表面氨基酸的带电性、蛋白内部的疏水性及蛋白内部的范德华力,设计了一系列的突变位点,进而成功构建出数个该蛋白突变体。通过对异源表达的突变体蛋白进行甜味和热稳定性检测,成功筛选出两个优良的突变体蛋白D21N和E2Q/E50N,与野生型monellin相比,突变蛋白的甜味明显增强,甜味阈值分别为0.70μg/m L和0.64μg/m L。其中,突变体E2Q/E50N的热稳定性明显增强,熔点温度上升至78℃。本研究进一步对活性增强的突变体蛋白D21N、E2Q/E50N进行了结构上的模拟,并对蛋白表面电荷的分布进行研究。结果表明,与野生型monellin相比,将蛋白表面带负电荷的氨基酸突变为极性不带电荷的gluteus medius氨基酸,甜味明显得到增强,原因可能是蛋白表面负电荷的减少增强了其与甜味受体T1R2/T1R3的结合。其中,突变体E2Q/E50N稳定性明显提升,分析发现蛋白三维结构发生了一定的局部变化,导致其亲水性增强从而增加了稳定性。本研究采用定点突变的方法增强了甜味蛋selleckchem白monellin的甜度和耐热性,优良性状突变体的构建有利于推动该蛋白的规模化生产,并为monellin蛋白的商业化生产提供了有益的素材。

筛选贵www.selleck.cn/products/forskolin州白山羊FHL3基因单核苷酸变异位点(SNPs),并分析基因多态性与生长性状的关联性，为培育贵州白山羊优良品系提供参考依据，也为进一步研究FHL3基因生物学功能奠定基础。通过混合池测序对116只不同地区贵州白山羊FHL3基因进行SNPs鉴定，以188只贵州白山羊进行关联性分析。采用PopGene32.0软件计算等位基因频率、基因型频率、遗传纯合度(H_o)、期望杂合度(H_e)、有效等位基因数(N_e),应用PIC软件计算群体多态性信息含量(PIC),以卡方(χ~2)检验分析基因Hardy-Weinberg平衡状态；应用MIZ-VAD-FMK体内NTAB软件中的一般线性混合效应模型分析核苷酸变异与生长性状关联性。结果表明，贵州白山羊FHL3基因的6个检测区域中，仅在P3区域检测到1个核苷酸变异位点g.215 C/T,且该位点的H_o低于Hmedical anthropology_e,PIC检测为中度多态，χ~2检验结果表明，该位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。关联分析结果表明，贵州白山羊FHL3基因g.215 C/T位点变异构成的不同等位基因和基因型在体高、体长和胸围方面表现出显著差异性(P<0.05),存在等位基因C的群体和CC基因型群体具有更高的生长优势。贵州白山羊FHL3基因具有一定的多态性，且g.215 C/T位点变异与体高、体长和胸围具有显著相关性，可作为培育贵州白山羊优良品系的候选基因分子标记。

黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivaleno,DON)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)在饲料及原料中混合污染严重,对动物和人类健康产生严重的危害。霉菌毒素通过诱导细胞氧化应激导致细胞线粒体损伤,进而产生免疫毒性。绿原酸已被证Chemical and biological properties明具有抗霉菌生长、增强机体抗氧化和免疫等功能。但是目前关于绿原酸对霉菌毒素诱导的线粒体动力学失衡和RLR损伤的研究还未见报道。本研究首先从绿原酸、异绿原酸A、新绿原酸中筛选出拮抗联合霉菌毒素效果最好的药物,然后探究该药物对联合霉菌毒素诱导的猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)线粒体动力学和RLR通路破坏的保护作用。为临床生产中联合霉菌毒素污染的防控以及绿原酸的应用提供理论依据。具体试验内容如下:试验一:绿原酸、异绿原酸A、新绿原酸对AFB1、DON、OTA联合暴露药物和浓度筛选本研究首先筛选拮抗联合霉菌毒素效果最好的绿原酸同分异构体。采用CCK-8法检测三种绿原酸同分异构体(2、4、8、16、32、64、128μg/m L)对PAM细胞的细胞毒性的影响。结果表明128μg/m L的三种绿原酸同分异构体明显表现出细胞毒性,浓度在64μg/m L时PAM细胞活力保持在85%以上。然后分别选取低、中、高(16μg/m L、32μg/m L、64μg/m L)的三种绿原酸同分异构体与AFB1、DON、OTA(0.94μg/m L、0.185μg/m L、1.255μg/m L)联合霉菌毒素共同处理细胞24 h,检测PAM细胞活力。结果发现与单独添加联合霉菌毒素组相比,添加64μg/m L的三种绿原酸同分异构体后PAM细胞活力最大,说明64μg/m L的三种绿原酸具有最佳的抗联合霉菌毒素效果。然后使用64μg/m L的三种绿原酸同分异构体与联合霉菌毒素共同处理PAM细胞24 h,检测细胞ROS水平和GPX4的含量,结果发现64μg/m L异绿原酸A较其他两种绿原酸极显著降低联合霉菌毒素诱导ROS水平,升高GPX4表达量(P<0.05)。所以后续试验选用64μg/m L的异绿原酸A。试验二:异绿原酸A对联合霉菌毒素致PAM细胞线粒体动力学失衡的影响试验设置对照组(C组)、联合霉菌毒素组(M组)、异绿原酸A组(ICCA组)、异绿原酸A与联合霉菌毒素共同处理组(ICCA+M组)。(1)通过流式细胞术检测PAM细胞的线粒体ROS水平。结果发现,PAM细胞经www.selleck.cn/products/cx-5461联合霉菌毒素处理24 h后,相较于C组线粒体ROS的水平显著升高(P<0.05)。与M相比,同时添加霉菌毒素和异绿原酸A组的线粒体ROS水平显著降低约40%(P<0.05)。综上,异绿原酸A能够有效缓解由联合霉菌毒素诱导线粒体ROS升高。(2)通过q PCR和WB检测线粒体动力学相关蛋白Drp1、Opa1、Fis1、Mfn1以及Mfn2的m RNA和蛋白表达情况。结果表明,与C组相比PAM细胞经联合霉菌毒素处理24 h后,细胞内线粒体融合蛋白Opa1、Mfn1和Mfn2的m RNA和蛋白表达量均降低(P<0.05或0.01);线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1的m RNA表达量升高(P<0.05或0.01)。ICCA+M组相较于M组PAM细胞融合蛋白的m RNA水平均升高(P<0.05或0.01);分裂蛋白的m RNA和蛋白表达情况极显著降低(P<0.01)。表明异绿原酸A能够有效改善由联合霉菌毒素诱导的线粒体动力学失衡。试验三:异绿原酸A致联合霉菌毒素对PAM细胞RLR通路的影响试验设分组同试验二。(1)将64μg/m L的异绿原酸A与联合霉菌毒素(0.94μg/m L AFB1、0.185μg/m L DON、1.255μg/m L OTA)共同处理PAM细胞24 h后,检测RIG-I、MAVS、IRF3、NF-κB的基因和蛋白表达情况。结果表明,联合霉菌毒素感染能够使PAM细胞RIG-I、MAVS、NF-κB的m RNA和蛋白表达显著升高(P<0.05或0.01),使IRF3的m RNA和蛋白表selleck Telaglenastat达极显著降低(P<0.01)。经异绿原酸A处理后,细胞中RIG-I、MAVS、NF-κB的基因和蛋白表达显著降低(P<0.05或0.01),IRF3的基因和蛋白表达有所恢复(P<0.01)。(2)然后我们利用q PCR法和ELISA对细胞内的RLR通路下游的细胞因子进行检测。结果发现,联合霉菌毒素感染后细胞内IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的m RNA和蛋白表达升高(P<0.05或0.01),IFN-α蛋白水平极显著降低(P<0.01)。与M组相比,ICCA+M组显著降低了细胞内促炎细胞因子的m RNA和蛋白表达水平,升高了IFN-α的m RNA和蛋白表达量。表明异绿原酸A能够改善由联合霉菌毒素诱导的炎症反应以及调节机体免疫功能。结论:(1)64μg/m L的绿原酸、异绿原酸A、新绿原酸均能够拮抗联合霉菌毒素诱导的细胞毒性、ROS升高以及GPX4表达降低,后续试验选取64μg/m L的异绿原酸A进行。(2)霉菌毒素联合暴露能导致PAM细胞线粒体ROS水平升高,使线粒体动力学失衡。64μg/m L的异绿原酸A能够改善联合霉菌毒素诱导的线粒体损伤,减少线粒体ROS释放,平衡线粒体分裂融合蛋白的表达。(3)异绿原酸A能够有效改善由联合霉菌毒素诱导的RLR通路激活,降低RIG-I、MAVS、IRF3、NF-κB以及下游细胞因子的表达,升高IRF3及IFN-α的表达。表明异绿原酸A能够抑制霉菌毒素诱导的炎症反应,提高机体免疫功能。综上异绿原酸A有望用于临床上霉菌毒素的防控。