Achr receptor

胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)是由微生物产生的一种具有结构多样性的生物聚合物。因其结构的多样性决定了EPS具有多种生物学活性,如抗氧化、抗病毒、抗癌和免疫调节等。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)是属于芽孢杆菌属的益生菌,具有较强的酶和碳水化合物合成能力,其产生的EPS具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和抗氧化等多种生物学活性。芽孢杆菌属中越来越多的益生菌被发现,但对这些益生菌相关的研究却较少,所以对芽孢杆菌属益生菌产胞外多糖的研究具有重要意义。本研究对具有高产EPS能力的B.amyloliquefaciensRoxadustat临床试验 JM033进行全基因组测序,从基因层面探究其EPS合成潜力。根据功能基因注释结果结合单因素试验对B.amyloliquefaciens JM033发酵基质碳源进行筛选,通过Box-Behnken设计进行响应面优化发酵条件提高EPS产量。对B.amyloliquefaciens JM033所产EPS进行提取、分离和纯化,选取中性多糖组分(BAP-1)进行结构解析。根据结构解析结果进行构效分析,通过体外细胞试验研究BAP-1的安全性和免疫调节能力。通过环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)建立免疫抑制小鼠模型,在体内从细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞吞噬作用、NK细胞活性和肠道菌群调节能力等方面研究BAP-1在肠道菌群和宿主免疫方面的作用。通过上述研究得到如下结果:(1)B.amyloliquefaciens JM033全基因组显示具有完整的EPS合成基因簇和较强的EPS合成潜力。通过对功能基因进行注释在eggNOG和KEGG数据库中分别得到220个和363个与碳水化合物代谢相关的基因;在CAZy数据库中注释到108个与EPS合成相关的酶的基因。在B.amyloliquefaciens JM033全基因组发现了从糖基转移到多糖聚合以及转运的一条完整的EPS合成基因簇。(2)B.amyloliquefaciens JM033具有较高的EPS产量。根据功能基因注释结果结合单因素试验对备选发酵碳源进行筛选,并通过Box-Behnken设计进行响应面优化发酵条件。得到以蔗糖作为碳源、发酵温度为37℃、初始pH值为7.0、发酵时间为50 h时可将EPS产量从0.75 mg/mL提高至5.34 mg/mL,增加了6.12倍。(3)BAP-1是一种新型的混合型果聚糖。B.amyloliquefaCB-839作用ciens JM033产EPS通过阴离子柱纯化分离出两个组分(BAP-1和BAP-2),选取中性多糖组分(分子量为17.6k Da的BAP-1)进行结构解析。结果显示BAP-1由两种单糖组成,其中果糖占99.15%,葡萄糖占0.85%。结合甲基化和核磁共振波谱分析得出BAP-1是一种重复单元主链为13个(2→1)链接的β-D-呋喃果糖,支链是(2→6)链接的β-D-呋喃果糖的混合型果聚糖(4)BAP-1在体内体外均具有免疫增强能力。通过体外细胞试验探究了BAP-1不具有细胞毒性并能促进RAW264.7细胞的中性红吞噬作用与NO、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌。体内通过利用CTX构建免疫抑制小鼠模型研究BAP-1体内免疫增强功能作用,发现BAP-1的摄入可以从体液免疫(提高抗体分泌水平)、单核-巨噬细胞吞噬能力和NK细胞杀伤能力三个方面显著提高宿主免疫能力。(5)BAP-nanoparticle biosynthesis1的摄入可以缓解免疫抑制小鼠的肠道菌群紊乱,使菌群组成向正常组转变。BAP-1的摄入可在门水平上显著提升有益菌如Verrucomicrobia的菌群丰度,同时降低潜在致病菌如Actinobacteria和Proteobacteria的菌群丰度。属水平上BAP-1的摄入可以显著提高免疫抑制小鼠肠道菌群中Akkermansia、Lachnospiraceae和Oscillospiracea等可以产生短链脂肪酸的下一代益生菌的菌群丰度。BAP-1的摄入还可以刺激免疫抑制小鼠的肠道中乙酸、丙酸和丁酸含量的显著升高。BAP-1具有潜在的通过调节肠道菌群进而影响宿主免疫的作用。

恶性肿瘤是严重威胁着人类健康的主要疾病之一,化疗一直是肿瘤的主要治疗手段,但其仍然存在较大的毒副作用以及多药耐药问题。因此,亟需研究安全性高、效果显著的新方法用于肿瘤治疗。近年来光动力、光热、联合治疗等潜在新策略广泛引起科研人员的兴趣,光动力治疗(PDT)和光热治疗(PTT)因具备无创、治疗部位精确可控、副作用小等特点而被备New Metabolite Biomarkers受青睐。然而肿瘤细胞内高水平的抗氧化剂(谷胱甘肽GSH)严重的影响了PDT的效果。吲哚菁绿(ICG)是一种获FDA批准使用、并能同时产生光动和光热效应的光敏剂,可是ICG的半衰期短、稳定性差等缺点限制了其应用效果。因此,对PDT和ICG的局限性进行理性的改进,有望研发治疗恶性肿瘤的新策略。本课题利用生物相容E7080体外高、稳定性好的白蛋白作为载体,共递送ICG和羟基茜草素(Purpurin),不仅提高了ICG的稳定性,而且Purpurin可抑制谷氨酸脱氢酶(GDH1)的功能,限制线粒体谷氨酰胺分解,从而下调谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)的水平,最终降低细胞内GSH含量,减少活性氧(ROS)被GSH消耗的程度,进而提高了光动力治疗效果,增强PDT/PTT协同的作用。本研究的内容和结果主要分为以下两个方面:(1)首先以牛血清白蛋白(BSA)为载体,采用温和的方法制备牛血清白蛋白药物递送系统(BSA@ICG/Purpurin,简称BIP),探究联合治疗策略的有效性。BIP递药系统成功制备后,采用不同的方法对其理化性质进行表征,结果显示BSA不仅能够提高ICG的光热性能,而且BIP能够实现温和的光热效果(46.6℃)。通过不同细胞抑制效果比较,结果表明He La细胞对BIP最为敏感,细胞抑制率为80.6%,选择He La细胞进行深入研究。体外细胞摄取实验证实He La细胞对BIP摄取具有时间依赖性。通过ROS含量分析评价BIP中Purpurin对胞内ROS含量的影响,结果发现BIP组中ROS含量比对照组提高了1.86倍。血液相容性研究证明BIP比游离药物具有更好的生物安全性。抗肿瘤实验结果显示BIP光照组肿瘤生长抑制率比与游离ICG光照组提高了32.6%,验证BIP能够增强游离药物的抗肿瘤效果。另外,从体内光热实验结果可知,BIP能够实现温和的光热效果(45.1°C)。病理学分析发现相比于游离药物组,BIP经光照后能够对肿瘤组织造成更多的损伤。综上表明BIP中Purpurin与ICG共递送的有效性且Purpurin能够一定程度上增强ICG的PDT治疗效果。(2)利用人血清白蛋白(HSA)为载体,以相同方法制备人血清白蛋白药物递送系统(HSA@ICG/Purpurin,简称HIP)。采用上述既定的研究模式,表征HIP理化性质、验证光热稳定性、探究对MDA-MB-231细胞的抑制效果、研究对细胞迁移能力的影响及GPx1蛋白的表达情况,通过以上方法探讨HIP治疗效果。综上所述,基于ICG、Purpurin一体化的白蛋白递药系统可以通过Purpurin降低细胞内GSH含量,减少ROS的消耗,最终实现温和BLZ945试剂的光热、协同增强的光动力治疗策略。该系统在体内、体外实验中均展现出良好的治疗效果,为开发高效低毒的肿瘤治疗方案提供了潜在的新途径。

至2050年耐药细菌感染将导致全球上千万人死亡,而耐药现象伴随着抗生素在临床的使用广泛发生,是药物治疗面临的严峻挑战。因此,亟需设计和开发新的给药策略以改善细菌乃至耐药菌感染的预防和治疗效果。成孔毒素(Pore-forming toxins,PFTs)属细菌外毒素,是多种细菌感染的主要毒力因子,破坏上皮屏障和免疫系统协助病原菌的侵袭和定殖,是抗细菌感染的主要靶点之一。抗毒力因子策略通过抑制毒素来治疗细菌感染,以非直接的方式杀灭病原菌从而避免产生耐药性。疫苗用于细菌感染防治帮助机体免疫系统识别病原体,产生能有效抵抗细菌感染的免疫反应。抗毒素疫苗将抗毒素策略与疫苗策略进行结合,尽可能地减少细菌耐药现象的产生,传统的抗毒素疫苗(类毒素疫苗)通过变性蛋白的方法来减少毒素抗原的毒性,存在的主要问题是难以同时保证类毒素疫苗的安全性和免疫原性。因此根据成孔毒素的生物特性和作用机制,结合仿生纳米策略构建新的疫苗载体系统具有研究意义。游离成孔毒素可与细胞膜表面的特异性受体结合,折叠组装成多聚体,识别、组装插入细胞膜表面的特定区域,红细胞是众多成孔毒素发挥毒性的主要靶细胞之一,因此可以作为毒素吸附的载体。纳米载体应用于机体后,吸附各种血浆蛋白可以使其维持特定的内源性蛋白功能,产生更多生物学效应。如血液中的免疫球蛋白IgM可以作为天然佐剂,增强纳米疫苗的体内免疫应答。研究表明脂质体吸附IgM后,脾脏B细胞分布显著增加,小鼠经免疫刺激后产生的特异性抗体滴度能长期维持较高水平。本研究构建了一种新型类毒素疫苗,构建仿生纳米载体吸附并中和细菌成孔毒素毒性,进一步通过IgM功能化策略增加抗原递呈、增强免疫应答,为耐药细菌感染防治研究提供新的思路和实验依据。第一部分,叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体类毒素疫苗的构建与表征。微生物发酵法,大肠杆菌表达系统制备了创伤弧菌溶血素A(Vibrio vulnificus hemolysin A,VvhA)蛋白,SDS-PAGE和Western Blot法对VvhA进行了分析与鉴定,VvhA的蛋白浓度为2 mg/m L,分子量为51 k Da,纯度为90%。以薄膜挥发法制备叶酸修饰的脂质体(FA-Lips),与红细胞膜挤出融合后,制备叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体(RCM-FA-Lips),吸附VvhA制备叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体类毒素疫苗(RCM-FA-Lips(VvhA))。荧光共定位实验、荧光共振能量转移(FRET)和蛋白质质谱分析验证了红细胞膜和脂质体的膜融合。对RCM-FA-Lips(VvhA)进行表征,RCMFA-Lips(VvhA)呈类球型膜状结构,马尔文粒径仪测得平均粒径为122.9±2.3 nm,Zeta电位为-24.5±1.3 m V。第二部分,叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体毒素中和能力以及安全性考察。抗溶血实验结果表明了RCM-FA-Lips能够以一定质量比完全中和VvhA毒素,体外抗溶血率达到98.78±0.08%,RCM-FA-Lips与VvhA质量比为8:1。CCK-8法考察RCM-FA-Lips的细胞毒性。结果显示,小鼠肝细胞(AML12)、肠上皮细胞(NCM460)、脐静脉内皮细胞(HUVECs)中,RCM-FA-Lips(VvhA)组细胞存活率分别为97.59±0.92%,94.51±4.14%和97.76±1.22%,RCM-Lips(VvhA)组细胞存活率分别为97.78±1.29%,94.90±1.33%和97.62±0.91%,均与对照组具有显著差异(P<0.0001)。通过皮肤解毒实验和VvhA感染小鼠的生存率来评价RCM-FA-Lips的体内解毒能力。小鼠皮肤毒素沾染模型中,RCM-Lips组、RCM-FA-Lips组与阴性对照组(Saline)均无明显皮肤损伤。H&E染色结果表明:RCM-Lips组和RCM-FA-Lips组表皮层结构完整,上皮细胞形态结构正常、排列紧密,真皮层胶原纤维含量丰富,未见明显的炎性改变。在VvhA感染小鼠的生存率实验中,RCM-Lips组和RCM-FA-Lips组小鼠生存率为60%,对VvhA感染的小鼠具有显著治疗效果,而RCMVs和FA-Lips对照组小鼠生存率均为0。采用CD68免疫组化法考察RCM-FA-Lips(VvhA)的组织毒性,BALB/c小鼠尾静脉连续给药7天(78 mg/kg)后24 h观察小鼠心、肝、脾、肺、肾的巨噬细胞阳性数量。结果显示,实验组各组织中无明显阳性细胞出现,与生理盐水组无显著性差异,具有良好的组织安全性。第三部分,叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体类毒素疫苗的免疫激活作用和免疫保护效果研究。将RCM-FA-Lips(VvhA)与小鼠血清共孵育后,通过SDS-PAGE、ELISA检测法进行分析,RCM-FA-Lips(VvWnt-C59小鼠hA)相对于RCM-Lips(VvhA)组具有更强的吸附血清中IgM的能力。采用激光共聚焦显微镜观察树突细胞对RCM-FA-Lips(VvhA)的摄取,结果表明,BMDCs对RCM-FA-Lips(VvhA)的摄取显著高于RCM-Lips(VvhA)组。研究RCM-FA-Lips(VvhA)在小鼠体内的免疫激活和保护作用。小鼠分为皮下免疫组和静脉免疫组,每七天给药一次,共免疫三次:皮下免疫分为四组,分别皮下注射Saline、甲醛脱毒VvhA、RCM-Lips(VvhA)和RCM-FA-Lips(VvhA);尾静脉组分为两组,分别尾静脉注射RCM-Lips(VvhA)和RCM-FA-Lips(VvhA),其中VvhA剂量均为100μg(2 mg/m L)。ELISA结果表明,RCM-FA-Lips(VvhA)组的小鼠血清中均具有更高滴度的VvhA特异性抗体。RCM-FA-Lips(VvhA)皮下免疫组小鼠的血清抗体滴度是甲醛脱毒VvhA组的16倍(P<0.0001),是RCM-Lips(VvhA)组的2倍(P<0.0001)。RCM-FALips(VvhA)尾静脉免疫组小鼠的血清抗体滴度是RCM-Lips(VvhA)组的1.6倍(P<0.001)。说明无论是皮下还是静脉注射给药方式,RCM-FA-Lips(VvhA)均能刺激机体产生更高的血清抗体滴度。激光共聚焦观察淋巴结生发中心的形成,并通过流式细胞术定量分析,RCM-FALips(VvhA)均显著增加小鼠体内淋巴结生发中心B细胞的百分比。皮下免疫的RCMMirdametinib分子式FA-Lips(VvhA)组GC B细胞的比例为RCM-Lips(VvhA)组的1.2倍(P<0.01),是甲醛脱毒VvhA组的3.06倍(P<0.0001);尾静脉免疫的RCM-FA-Lips(VvhA)组GC B细胞的比例约为RCM-Lips(VvhA)组的1.35倍(P<0.01),是甲醛脱毒VvhA免疫组的2.13倍(P<0.0001)。免疫小鼠腹腔注射致死剂量的VvhA后,观察小鼠72h内死亡情况,皮下免疫RCM-FA-Lips(VvhA)组和尾静脉免疫RCM-FA-Lips(VvhA)组小鼠生存率为100%,皮下RCM-Lips(VvhA)组小鼠生存率为90%,尾静脉RCMLips(VvhA)免疫组小鼠生存率为80%,甲醛脱毒VvhA免疫组小鼠生存率为60%。说明叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体类毒素疫苗具有更好的免疫保护作用。综上所述,本研究制备了叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体,通过成孔毒素载红细胞膜上的聚集打孔机制,高效负载以创伤弧菌溶血素A作为抗原蛋白,中和毒素毒性的同时,最大限度的保留其抗原portuguese biodiversity活性,构建了一种新型的纳米载体类毒素疫苗。同时,叶酸分子作为结合IgM的靶分子修饰于红细胞膜-杂合脂质体表面,在体内吸附IgM,利用其天然佐剂的作用增强类毒素疫苗的体内免疫应答。研究结果表明,所构建的纳米载体类毒素疫苗具有较好的抗原递呈和免疫激活作用,对模型小鼠产生了较好的免疫保护效果。该系统也可以用于多种细菌类毒素疫苗的制备,为耐药细菌感染防治研究提供新的思路和实验依据。

[目的]系统评价柴胡疏肝散加减联合核苷（酸）uro-genital infections类似物治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎的临床疗效。[方法]检索中、英文数据库中柴胡疏肝散加减联合核苷（酸）类似BI 10773物治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎的临床随机对照研究，检索时限为建库至2022年6月。使用Cochrane偏倚风险评价工具进行文献质量评价，应用RevMan5.3软件进行统计学分析。[结果]共纳入10篇文献，涉及875例肝郁脾虚型慢性乙型肝炎患者。Meta分析结果提示试验组总有效率高于对照组（RR=1.22,95%CI为1.14～1.32,Z=5.51,P<0.000 01）；试验组在降低谷PLX4032半抑制浓度丙转氨酶（MD=-22.81,95%CI为-27.61～-18.02,Z=9.33,P<0.000 01）、谷草转氨酶（MD=-20.50,95%CI为-24.54～-16.45,Z=9.93,P<0.000 01）方面优于对照组；试验组在乙型肝炎E抗原转阴率（RR=1.59,95%CI为1.27～2.00,Z=3.97,P<0.000 1）、乙型肝炎病毒DNA转阴率（RR=1.53,95%CI为1.17～1.99,Z=3.14,P=0.002）方面优于对照组。[结论]柴胡疏肝散加减联合核苷（酸）类似物治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎的疗效优于单纯使用核苷（酸）类似物治疗，但结论还需进一步验证。

目的:使用网状Meta分析方法比较7种药物10种干预措施治疗精神分裂症的疗效、安全性和依从性。评价的干预措施中包括长效注射型抗精神病药物(Long-Acting Injectable Antipsycho tics,LAI)(以下统称为长效针剂)和部分口服抗精神病药物(Oral Antipsychotics,OAP)。具体包括阿立哌唑月桂酰两月一次(Aripiprazole Lauroxil 2 Month Formulation,AL2M)、阿立哌唑一月一次(Aripiprazole Once-Monthly,AOM)、氟哌啶醇(Haloperidol,HAL)、口服阿立哌唑(Oral Aripiprazole)、奥氮平(Olanzapine Long-Acting Injection,OLAI)、利培酮(Risperidone Long-Acting Injections,RLAI)、口服利培酮(Oral Risperidone)、帕利哌酮一月一次(Paliperidone Palmitate Once Monthly,PP1M)、帕利哌酮三月一次(Paliperidone Palmitate 3 Month Formulation,PP3M)、帕利哌酮六月一次(Paliperidone Palmitate 6 Moselleck NMRnth Formulation,PP6M)与安慰剂。方法:检索 PubMed、Cochrane Library、Embase、Web of Science 与 ClinicalTrials.gov数据库,时间范围限制为1980年1月1日至2022年12月31日;筛选符合纳入标准随机对照试验(Random Controlled Trials,RCT),使用Cochrane偏倚风险评估工具对文献进行风险偏倚评估。利用R(4.2.1)软件进行统计分析,在频率学框架下进行网状Meta分析,比较7种抗精神病药物10种干预措施与安慰剂疗效、安全性与依从性,并根据累积排序曲线下面积(Surface Under the Cumulative Ranking,SUCRA)概率排序对各种干预措施的疗效、安全性和依从性进行排序。结果:1.本研究共纳入30项RCT。研究对象共14817人,男性占比61.33%,女性占比38.66%,平均年龄为39.83±11.18岁。2.PANSS评分变化的网状Meta分析结果:在包括10种干预措施与安慰剂比较疗效的网状Meta分析中,各干预措施疗效由大到小的概率排序为:口服利培酮(MD=-10.86,95%CI:-18.88～-2.83,p=0.008)、AOM(MD=-10.37,9点击此处5%CI:-18.62～-2.12,p=0.014)、RLAI(MD=-9.96,95%CI:-17.98～-1.93,p=0.015)、口服阿立哌唑(MD=-10.16,95%CI:-19.33～-0.99,p=0.030)、AL2M(MD=-8.74,95%CI:-11.78～-5.70,p<0.0001)、PP1M(MD=-7.84,95%CI:-10.88～-4.80,p<0.0001)、PP6M(MD=-7.25,95%CI:-10.34～-4.17,p<0.0001)、HAL(MD=-7.37,95%CI:-10.41～-4.33,p<0.0001)、PP3M(MD=-7.05,95%CI:-10.03～-4.08,p<0.0001)和OLAI(MD=0.48,95%CI:-4.22～5.18,p=0.8415)。3.AEs发生率的网状Meta分析结果:在包括9种干预措施与安慰剂比较安全性的网状Meta分析中,各干预措施能够降低AEs发生风险能力由大到小的概率排序为:HAL(OR=0.80,95%CI:0.21～3.10,p=0.7493),PP3M(OR=1epigenetic stability.09,95%CI:0.46～2.59,p=0.8452),AL2M(OR=1.06,95%CI:0.26～4.31,p=0.9353),PP1M(OR=1.14,95%CI:0.54～2.42,p=0.7240),口服阿立哌唑(OR=1.25,95%CI=0.28-5.53,p=0.7730),PP6M(OR=1.27,95%CI:0.32～5.04,p=0.7339),口服利培酮(OR=1.31,95%CI:0.34～5.10,p=0.6951),AOM(OR=1.28,95%CI:0.45～3.62,p=0.6450)和RLAI(OR=1.44,95%CI:0.62-3.32,p=0.3920)。4.停药率的网状Meta分析结果:在包括10种干预措施与安慰剂比较停药率的网状Meta分析中,各抗精神病药物降低停药风险能力由高到低的概率排序为:AOM(OR=0.10,95%CI:0.05-0.19,p<0.0001),口服阿立哌唑(OR=0.12,95%CI:0.06-0.26,p<0.0001),口服利培酮(OR=0.18,95%CI:0.01-5.35,p=0.3212),PP3M(OR=0.49,95%CI:0.23～1.04,p=0.0641),RLAI(OR=0.56,95%CI:0.29～1.07,p=0.0810),HAL(OR=0.52,95%CI:0.17～1.53,p=0.2341),口服奥氮平(OR=0.54,95%CI:0.16-1.80,p=0.3154),OLAI(OR=0.60,95%CI:0.25-1.45,p=0.2551),PP1M(OR=0.65,95%CI:0.37～1.16,p=0.1428)和 PP6M(OR=0.67,95%CI:0.21～2.18,p=0.5104)。结论:(1)在疗效方面,长效针剂中以AOM、RLAI、AL2M和PP1M效果相对较好,PP3M疗效最劣;(2)在安全性方面,各种抗精神病药物与安慰剂相比AEs发生率无差异,各种LAI和OAP之间无差异;(3)在依从性方面,长效针剂中以AOM、PP3M、RLAI和HAL降低停药风险的效果较好,PP6M依从性最差。

硫化氢(H_2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后发现的第三种气体信号分子,广泛存在于哺乳动物中,具有重要的细胞保护作用。研究表明,H_2S参与许多生理和病理过程,如调节炎症、放松血管、调节血压等。但是,指数异常的H_2S会表现出急NVP-TNKS656体内性和高毒性,从而导致人类的各种疾病。例如,低浓度的H_2S对视觉系统、呼吸系统和中枢神经系统产生有害影响。高浓度的H_2S会导致多种疾病,如高血压、阿尔茨海默病、帕金森病等。H_2S也是生食中含硫细菌的代谢物,被认为是生食变质过程中突出的挥发物之一。食物变质可能导致H_2S残留物浓度过高,从而对人体健康产生不利影响。此外,H_2S广泛存在于工业废水中,H_2S会通过生态流动和食物链传递到环境和人体中,造成负面影响。H_2S的存在与自3-MA体内然环境、人类健康、人类生活息息相关。因此,建立一种高选择性和高灵敏度的H_2S检测方法具有重要意义。小分子荧光探针具有成本低、结构简单、化学性质稳定、易于修饰、选择性好、无创分析、高空间分辨率和实时成像等优点,一直以来被广泛应用于分子识别。鉴于此,本文基于H_2S识别基团2,4-二硝基苯磺酰基设计并合成三种新型的H_2S小分子荧光探针,并且系统性地研究了其在相应的溶剂中的吸收光谱、发射光谱、选择性识别、时间依赖性和pH响应等光学性能,以及探究了其在试纸、环境、食品和活细胞内的应用前景。论文主要内容如下:第一章,综述小分子荧光探针的研究背景、定义、构成、识别机理、不同反应类型和不同荧光基团的H_2S荧光探针研究进展以及小分子荧光探针在各方面的应用,并在这个基础上提出了本课题的主要研究内容。第二章,以苯并噻唑作为荧光基团,以2,4-二硝基苯磺酰基作为H_2S识别基团,合成探针BDS-DNBS。通过探究BDS-DNBS对H_2S的光学响应,证明该探针能够定性、定量的检测H_2S,并且能够通过紫外可见吸收和荧光发射的变化识别H_2S,并在25-70μM范围内,H_2S浓度与荧光强度显示出composite biomaterials良好的线性关系。探针BDS-DNBS在环境、食品以及活细胞中具有潜在的应用价值。第三章,把噻吩-苯并噻二唑-噻吩(D-A-D)共轭结构作为荧光发射团,以2,4-二硝基苯磺酰基作为H_2S识别基团,合成探针DAD-DNBS。并且探究了DAD-DNBS检测H_2S的光学性能,包括选择性和抗干扰性能等相关光学性能测试。研究结果表明DAD-DNBS特异性识别H_2S时,发射波长达到近红外区域652 nm,荧光信号强度显著增强,与H_2S反应前后荧光量子产率提高两倍。此外,该探针DAD-DNBS具有广泛的应用,包括环境水样中H_2S的检测、食品中H_2S的追踪、试纸检测以及在活细胞中进行内源性和外源性H_2S成像,具有可观的应用前景。第四章,通过三苯胺与苯乙烯吡啶基框架相连接并进行成盐反应,以2,4-二硝基苯磺酰基作为H_2S识别基团,合成了探针TPB-DNBS。通过一系列光学性能的探究后,研究发现TPB-DNBS检测H_2S时,能够快速识别响应,并且表现出优异的选择性和极好的灵敏性。检测H_2S时在发射波长为623 nm处有一个明显的荧光信号特征峰,溶液颜色从无发射到橙色荧光的变化,能够在3 min内响应完全。此外,通过应用探究,证实探针TPB-DNBS在靶向细胞器、环境检测、食品质量追踪、活细胞成像中具有广阔的应用前景。

褐藻胶是褐藻中含量最丰富的多糖,可达到藻类生物质干重的40%,由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种单体通过1,4糖苷键连接组成。褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶(polysaccharide lyase,PL),主要参与褐藻胶的降解,在海洋碳循环中发挥重要作用。褐藻胶裂解酶主要来源于海洋细菌,弧菌是一种常见的水生细菌,也是常见的褐藻胶降解类群,已从中发现多种新型褐藻胶裂解酶。褐藻寡糖(alginate oligosaccharide,AOS)是褐藻胶的降解产物,具有降血糖、降血脂、免疫调节等多种生理活性,在农业、食品、医药等领域有广阔的应用前景。因此,从弧菌中挖掘新型或有应用潜力的褐藻胶裂解酶,对它们进行研究,实现AOS的大量制备,不仅有利于增加对弧菌褐藻胶降解过程的理解,也为褐藻胶裂解酶的应用开发奠定基础。本论文首先从实验室已进行全基因测序的弧菌中发现了 PL7家族双催化结构域褐藻胶裂解酶基因alyC6′,通过蛋白异源表达、纯化及检测重组酶的酶学性质,揭示了双催化结构域之间的协同作用,并对具有多个催化结构域的褐藻胶裂解酶的广泛性进行了分析。然后,对另一株实验室已测序的弧菌中11个Dibutyryl-cAMP使用方法褐藻胶裂解酶进行了异源表达和纯化,分析了重组酶的酶学性质,从中筛选出比活力较高、产物主要为三糖的双功能褐藻胶裂解酶AlyC7。构建了重组大肠杆菌实现了 AlyC7的分泌表达,并对培养基添加物和培养条件进行了优化。最后,利用胞外分泌Regorafenib IC50的重组褐藻胶裂解酶制备了 AOS,分析了AOS的组成及纯度,并研究了 AOS对植物根生长的促进作用。1.Vibrio sp.NC2新型褐藻胶裂解酶双催化结构域的协同作用研究从Vibrio sp.NC2中挖掘到具有双催化结构域的PL7家族褐藻胶裂解酶AlyC6′,对其原酶和两个催化结构域分别进行异源表达和纯化。结果表明,AlyC6’的两个催化结构域都能够单独降解褐藻胶,且与AlyC6’的最适酶活条件一致,最适温度均为30℃,最适pH为8.0,在0.5 M NaCl条件下酶活最高。AlyC6′-CD1对PM底物活性最高,对PG几乎无活性;AlyC6′-CD2对PG活性最高,对PM几乎无dual infections活性,而AlyC6’对PM活性最高同时对PG有一定的活性。AlyC6’和AlyC6′-CD1的最小底物为三糖,而AlyC6′-CD2的最小底物为四糖。从动力学参数来看,AlyC6′-CD1对底物的降解效率更高,AlyC6′-CD2的底物亲和力更高。AlyC6′-CD1能迅速降解AlyC6′-CD2产生的寡糖产物,且摩尔浓度相同时AlyC6’的比活力要高于AlyC6′-CD1与AlyC6′-CD2混合酶的比活力。以上结果表明AlyC6’两个结构域有显著的协同作用。生物信息学分析表明多催化结构域褐藻胶裂解酶在黄杆菌目和交替单胞菌目广泛存在。2.Vibrio sp.C42褐藻胶裂解酶的异源表达与性质研究从Vibrio sp.C42基因组中挖掘到1 1个褐藻胶裂解酶基因,对其分别进行表达纯化与酶学性质分析。除AlyC4外,共10个重组酶对褐藻胶有活性,其中AlyC1、AlyC3、AlyC6、AlyC7、AlyC9、AlyC10和AlyC11都具有对四种褐藻胶底物的降解活性,属于双功能酶。AlyC7的产物中三糖峰面积占产物峰面积的80%以上,具有大量制备三糖的潜力,且比活力是双功能酶中最高的。AlyC7的最适温度为30℃,最适pH为9.0,在0.5 M NaCl条件下酶活最高。3.褐藻胶裂解酶AlyC7在大肠杆菌中的分泌表达及表达条件优化为实现褐藻胶裂解酶AlyC7在大肠杆菌中的分泌表达,我们选择了 OmpT、OmpA、PhoA、PelB和MalE 5种信号肽以及alyC7基因自身信号肽分别构建了重组表达载体,并进行活性验证。其中携带OmpA、PelB或MalE的重组菌株可以胞外分泌褐藻胶裂解酶。向培养基中加入0.3%(w/v)蔗糖、0.3%(w/v)山梨醇、0.03%(v/v)SDS、1%(w/v)甘氨酸或1%Triton X-100后测定重组菌株胞外酶活的变化情况,发现PelB-AlyC7在添加甘氨酸后的胞外酶活最高。对PelB-AlyC7的培养基添加物和培养条件分别进行单因子优化,然后进行正交优化,最终确定的产酶发酵条件为:培养温度20℃,甘氨酸浓度500 mM,培养时间24h。在该条件下,胞外褐藻胶裂解酶酶活达到1122.8 U/mL。4.利用重组酶AlyC7制备褐藻寡糖及其促植物种子根生长的应用潜力分析以重组菌PelB-AlyC7的发酵上清液为AlyC7酶液,酶解褐藻胶制备AOS,我们对酶解条件进行了优化,分析了产物AOS的组成及纯度,并探究了 AOS对植物生长的促进作用。最适的酶解条件为:酶料比(E/S)25 U/mg,缓冲液为40mM PBS(pH 8.0),30℃反应45 min。褐藻酸钠底物的降解率为87.5%。酶解得到的AOS产物中三糖纯度为84.89%,含有少量的二糖和四糖。20 μg/mL的AOS对双子叶植物番茄和生菜种子根的生长有明显的促进作用,而对单子叶植物小麦和玉米的促进效果不明显。本论文对重要的褐藻胶降解类群——弧菌的褐藻胶裂解酶进行了挖掘、表征和应用潜力分析。首次揭示了一弧菌来源的新型双催化结构域褐藻胶裂解酶AlyC6’结构域间的协同作用。挖掘了来自Vibrio sp.C42的具有生产褐藻三糖潜力的褐藻胶裂解酶AlyC7,构建了其大肠杆菌高效分泌表达体系,并初步评价了其在促植物种子根生长方面的应用潜力。研究结果丰富了我们对褐藻胶裂解酶以及弧菌对褐藻胶降解的认识,并为褐藻胶裂解酶的开发应用奠定了基础。

睾丸是哺乳动物中具有双向分化潜能的组织之一,具有生精和内分泌作用,其功能障碍易造成性功能减退KD025 IC50或雄性不育,这极大程度的制约了动物的繁殖功能。睾丸的发育是一个渐进的生理过程,其发育进程与精子发生过程密切相关。关中奶山羊是陕西关中地区的优良奶山羊品种,一般在1月龄断奶,5月龄达到性成熟,24月龄达到体成熟,60月龄开始衰老。目前,从代谢组学的角度探讨关中奶山羊睾丸发育与衰老代谢机制的研究尚无报道。本研究拟采用超高液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS)对关中奶山羊睾丸组织发育与衰老进行了代谢组学比较分析。结果如下:1.在1月龄与5月龄关中奶山羊睾丸发育代谢谱的比较分析中,共筛选出373种差异代谢物,其中极显著差异代谢物有68种,32种上调,36种下调,分属于脂质与类脂质分子、有机酸及其衍生物、有氧化合物、核苷、核苷酸和类似物、有机杂环化合物、有机氮化合物、苯环型化合物、聚酮类化合物8大类,涉及到的关键代谢通路有15条,分别为嘌呤代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷氨酸能突触、GABA能突触、酒精中毒、蛋白质消化吸收、细胞缝隙连接、胆碱在肿瘤中的代谢、肿瘤中的中心碳代谢、β-丙氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、血管平滑肌收缩、脂肪细胞中脂解的调节、鞘脂信号通路和谷胱甘肽代谢通路。通过相关代谢通路上富集代谢物发现L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、腺苷和脯氨酸为潜在的生物标志物。2.在5月龄与24月龄关中奶山羊睾丸发育代谢谱的比较分析中,共筛选出189种差异代谢物,其中极显著差异代谢物有44种,15种上调,29种下调,分属于脂质与类脂质分子、有机酸及其衍生物、核苷、核苷酸和类似物、有机氧化合物、有机杂环化合物、有机氮化合物、苯环型化合物、聚酮类化合物8大类,涉及到的关键代谢通路有13条,分别为胆碱在肿瘤中的代谢、精氨酸生物合成、嘌呤代谢、细胞缝隙连接、谷胱甘肽代谢、肌萎缩侧索硬化症、精氨酸和脯氨酸代谢、初级胆汁Gefitinib溶解度酸生物合成、抗坏血酸和醛糖代谢、胰岛素抵抗、甘油磷脂代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢和咖啡因代谢通路。通过相关代谢通路上富集代谢物发现L-谷氨酸和L-精氨酸为潜在的生物标志物。3.在24月龄与60月龄关中奶山羊睾丸衰老代谢谱的比较分析中,共筛选出129种差异代谢物,其中极显著差异代谢物有35种,21种上调,14种下调,分属于有机酸及其衍生物、脂质和类脂质分子、核苷、核苷酸和类似物、有机氧化合物、苯丙烷和聚酮化合物、有机氮化合物、有机杂环化合物7大类,涉及到的关键代谢通路有9条,分别为铁死亡、ABC转运蛋白、谷胱甘肽代谢、精氨酸生物合成、氨基酰-t RNA生物合成、酒精中毒、氨基酸糖和核苷酸糖代谢、胆碱在肿瘤中的代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、肌萎缩侧索硬化症、嘌呤代谢、逆行内大麻Bioleaching mechanism素信号和牛磺酸和亚牛磺酸代谢通路。通过相关代谢通路上富集代谢物发现L-谷氨酸和L-精氨酸为潜在的生物标志物。综上所述,本研究表明,L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、腺苷和脯氨酸是睾丸发育过程中的潜在生物标志物,L-谷氨酸和L-精氨酸是睾丸衰老过程中的潜在生物标志物。本试验从代谢组学角度揭示了关中奶山羊睾丸发育与衰老过程中的差异代谢物及代谢机制,为进一步研究哺乳动物睾丸的发育与衰老机制奠定了科学基础。

宿主双功能细胞凋亡调控因子 (Bifunctional apoptosis regulatory factor，Bfar) 是一种双功能凋亡调控蛋白，能够通过外源性和内源性两种凋亡途径调节细胞凋亡水平。为探究Bfar在布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞过程中对布鲁氏菌胞内寄生的影响，首先用猪种布鲁氏菌S2（Brucella suis S2）侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7，通过反转录-实时荧光定量PCR (RT-qPCR)和蛋白免疫印迹技术(WB)检测在感染过程中Bfar转录水平和蛋白表达水平的变化。再分别构建Bfar过表达质粒或干扰质粒，提高或敲降宿主Bfar的胞内表达水平，通过菌落计数分析其差异表达对布鲁氏菌胞内寄生的影响。结果显示，布鲁氏菌感染巨噬细胞RAW264.7使胞内Bfcardiac pathologyar表达水平先上升再下降；布鲁氏selleck化学菌感染RAW264.7的24 h内，过表达Bfar可提高布鲁氏菌胞内存活数量，而干扰Bfar表达使布鲁氏菌胞内存活数量下降。因此，宿主Bfar有助于布鲁氏菌的胞内寄生，其机制还有待于进一步研究。本实验通过分析宿主Bfar与猪种布鲁氏菌S2胞内寄生关系，研究响应布鲁氏菌感染的相关宿主反E-616452研究购买应因子，为进一步研究布鲁氏菌致病分子机制提供新思路。

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。世界范围内,膀胱癌发病率位居恶性肿瘤的第9位,男性恶性肿瘤的第7位(9.5/10万),女性为第10位(2.410/10万);死亡率居恶性肿瘤的第13位,其中男性死亡率为3.2/10万,女性为0.9/10万。目前手术、放疗和化疗是治疗膀胱癌的常规手段,但由于手术之后的高复发率,以及放疗和化疗的毒副作用这使得癌症治愈率维持在一个极低的水平。光热治疗(Photothermal therapy,PTT)作为一种新兴的无创肿瘤治疗技术,凭借其局部、高效、副作用小等优势成为了肿瘤治疗领域的热点。在PTT中,光热剂在近红外激光照射下将光能转化为热能来诱导癌细胞凋亡。其中,光热剂是PTAirborne microbiomeT的核心,通过对光热纳米材料的修饰,光热纳米材料的功能性也越来越强。其中无机纳米光热材料因其易制备、易于修饰、高效的光热转化率以及价格低廉等优势备受研究者们的关注。尽管如此,光热剂的光热转换效率、生物相容性和安全性以及生物降解性等仍是目前急需解决的重要因素。基于此本论文设计构建基于贵金属的新型纳米粒子,同时结合放射疗法(RT)、化学动力疗法(CDT)获得了高效协同治疗膀胱癌的效果,同时也探讨了贵金属纳米颗粒在生物医用的潜在价值。本文主要包括四部分:(1)第一部分选择通过一锅原位还原法合成了纳米棒Pd Te(Pd Te NR),通过理化性质和结构的研究,Pd Te不仅光热转换效率高、光稳定性好等特点,而且Pd Te具有类CAT性质可以分解H_2O_2转化为O_2,以克服缺氧,提高热放疗的效果。由于Pd和Te都是典型的高Z元素可以增强X射线的剂量沉积,因此Pd Te纳米酶在肿瘤细胞中表现出显著的放射增敏能力,随后以MBT-2肿瘤细胞为模型,研究表明Pd Te纳米粒子增强热放疗的治疗效果并且具备良好的生物安全性。(2)第二部分通过以MBT-2荷瘤小鼠为模型,构建了Pd Te NR纳米制剂协同热放疗的纳米治疗平台。研究结果表明Pd Te NR介导的热放射疗法成功诱导了肿瘤的消融。与此同时,经过光热治疗后,小鼠肿瘤部位缺氧情况得到明显的改善,放疗的治疗效果大大提高。动物的血液生化指标表明Pd Te NSC 127716NR在体内具有良好生物安全性,因此Pd Te NR是一种有潜力的多功能纳米粒子,在增强放射治疗方面具有巨大的潜力。(3)第三部分制备了高催化活性的超小铜钯纳米粒子(CP NPs),并用于协同CDT和PTT的肿瘤治疗。CP NPs在肿瘤区域积累并进入肿瘤细胞后,铜离子(Cu~(2+))与细胞内GSH发生反应,使其水平降低。接下来,形成的亚铜离子(Cu~+)与肿瘤部位过表达的H_2O_2反应生成大量有毒的羟基自由基(·OH),从而诱导细胞死亡。此外,在近红外光808 nm激光照射下,CP NPs表现出显著的光热转换率,对肿瘤Compound C molecular weight组织进行了特异性消融,这也进一步增强了CDT的治疗效果。在细胞实验中,CP NPs在协同CDT和PTT联合治疗中显著的抑制了膀胱癌细胞(MB-49)的生长,这充分证实了CP NPs高效的化学动力—光热协同治疗效果。(4)第四部分中以MB-49小鼠动物为模型,继续深入探究CP NPs体内抗肿瘤治疗效果。研究结果表明,CP NPs介导的CDT/PTT成功诱导了肿瘤的死亡。与此同时,动物的血液生化指标表明在体内具有良好的稳定性和生物安全性,这为肿瘤精准治疗的提供了新思路。综上所述,本论文立足于医学、无机化学与生物学的多学科交叉研究,为贵金属纳米颗粒在膀胱癌的光热治疗方面进行了较为深入的研究,为纳米药物治疗膀胱癌提供新的科研思路及理论依据。