目的:传统医用敷料通常采用无菌纱布处理皮肤伤口,虽然能促进创伤愈合,但存在生物相容性差、难以降解、材料通透性差、难以维持创口湿润环境和自身抑菌效果差等缺点,容易导致继发感染,不利于伤口愈合。研究表明,壳聚糖(Chitosan,CS)是一种天然高分子材料,具有止血、抗菌和加速创面愈合的作用。聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)是一种安全性极高的有机物,具有良好的生物相容性。植物纳米纤维素(CNC)是一种天然高分子聚合物,具有透气性和吸水性好等特点,可作为水凝胶应用于创面修复。本研究将CS和PVA复合到CNC中,得到了 CS/PVA/CNC三元复合修复敷料,具有三者优点。通过探讨其作为抗菌功能敷料应用于创面修复的有效性和安全性,为大面积、难愈合的皮肤创面修复治疗提供了新的治疗方案。方法:本研究首先使用维素酶,在柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液对人造竹浆纤维进行酶解来制备植物纳米纤维素(CNC);然后,采用分步聚合的方法,使用聚乙烯醇对壳聚糖进行接枝处理,再使用旋转低压法,与醛基化的纳米纤维素聚合,制备CS/PVA/CNC三元复合抗菌凝胶膜。通过扫描电子显微镜和傅里叶红外光谱对该复合抗菌凝胶膜进行理化性质评价;采用紫外可见分光光度计OD600检测方法抗菌凝胶MRTX849膜的抗菌能力;采用MTT测定复合抗菌凝胶膜的细胞毒性;使用紫外分光光度法测定溶血性能分析;同时,考察复合抗菌凝胶膜对大鼠创面模型的治愈效果;使用H&E染色和Masson染色法评价复合抗菌凝胶膜治疗后创口愈合情况。使用SPSS 26.0统计学软件对所有数据进行统计分析,所得的结果图片均釆用Photoshop 2019进行编辑处理,结果以平均值±标准差表示。微生物检测结果通过方差分析(post-hoc,Tukey’s test)进行统计学评价,统计学意义设定在P<0.05水平。结果:本研究制备的CS/PVA/CNC三元复合抗菌凝胶膜表面规整平滑且呈现完整的球状,分布均匀、微观孔道丰富,结构较为疏松。该医用材料稳定高、安全性好,且具备理想的微观结构和良好的吸水性和透气性,能有效抑制金葡球菌和大肠杆菌的增殖。同时,CS/PVA/CNC三元复合抗菌凝胶膜具备明显的抗凝血效果;同时,动物实验结果显示其能够减轻皮肤炎症反应、促进伤口愈合、减轻瘢痕形成。结论:CS/PVA/CNC三元复合抗菌凝胶膜是一种Immunocompromised condition易成膜的医用敷料,RP56976浓度由壳聚糖CS、聚乙烯醇PVA和植物纳米纤维素CNC合成而成。该复合敷料具有高透气性、高吸水性、快速止血、抗感染、保湿和封闭保护创面的功能,同时还能促进表皮再生和伤口愈合。其透明外观方便直接观察创面愈合情况,减少敷料更换次数,为大面积、难愈合的皮肤创面修复治疗提供了一种新的治疗方法。
南方红豆杉转录组SSR位点分析及其分子标记开发
目的 基于赤霉素（gibberellin A_3,GA_3）处理下的南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei转录组数据鉴定和分析SSR位点，开发可用于南方红豆杉种质资源鉴定和遗传多样性分析的SSR标记。方法 使用MISA软件对南方红豆杉转录组MRTX1133体内数据进行SSR分析，搜索SSR位点。可搜索单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最小重复数分别设置为10、6、5、5、5、5次。采用Primer 3(2.3.5版，默认参数)进行SSR引物设计。通过毛细管荧光电泳检测，最终选定多态性好，扩增成功率高的SSR引物用于后续数据分析；通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。结果 转录组测序共获得202 361条Unigene，采用MISA软件搜索出12 008个SSR位点，分布在10 894条Unigenes上，发生频率为5.38%，平均距离为1/7.64 kb。单核苷酸重复类型最丰富，占总SSR位点的51.74%，其次为三核苷酸（20.92%）和二核苷酸重复类型（20.88%）。A/T、AG/CT是优势重复基序，分别占总SSR重复类selleck AG-221型的49.60%和10.93%。随机抽选96对SSR引物，以4个地区12份南方红豆杉种质进行引物有效性和多态性验证，筛选出13对具多态性的SSR引物，多态性引物比率为13.54%。13对引物在东北红豆杉Taxus cuspidata扩增效率高达100%，但在曼地亚红豆杉Taxus×media扩增效率仅为23.08%。聚类分析表明太行山地区南方红豆杉聚为一类，浙江、福建和湖南等南方来源的南方红豆杉聚为一类，后三者彼此之间遗传距离更近。结论 南方红豆杉转录组测序产生的Unigene信息可以用来开发SSR分子标记，开发的13个标记将有助于南方红viral immunoevasion豆杉物种遗传多样性、分子育种、资源保护等方面的研究。
南方红豆杉转录组SSR位点分析及其分子标记开发
目的 基于赤霉素（gibberellin A_3,GA_3）处理下的南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei转录组数据鉴定和分析SSR位点，开发可用于南方红豆杉种质资源鉴定和遗传多样性分析的SSR标记。方法 使用MISA软件对南方红豆杉转录组MRTX1133体内数据进行SSR分析，搜索SSR位点。可搜索单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最小重复数分别设置为10、6、5、5、5、5次。采用Primer 3(2.3.5版，默认参数)进行SSR引物设计。通过毛细管荧光电泳检测，最终选定多态性好，扩增成功率高的SSR引物用于后续数据分析；通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。结果 转录组测序共获得202 361条Unigene，采用MISA软件搜索出12 008个SSR位点，分布在10 894条Unigenes上，发生频率为5.38%，平均距离为1/7.64 kb。单核苷酸重复类型最丰富，占总SSR位点的51.74%，其次为三核苷酸（20.92%）和二核苷酸重复类型（20.88%）。A/T、AG/CT是优势重复基序，分别占总SSR重复类selleck AG-221型的49.60%和10.93%。随机抽选96对SSR引物，以4个地区12份南方红豆杉种质进行引物有效性和多态性验证，筛选出13对具多态性的SSR引物，多态性引物比率为13.54%。13对引物在东北红豆杉Taxus cuspidata扩增效率高达100%，但在曼地亚红豆杉Taxus×media扩增效率仅为23.08%。聚类分析表明太行山地区南方红豆杉聚为一类，浙江、福建和湖南等南方来源的南方红豆杉聚为一类，后三者彼此之间遗传距离更近。结论 南方红豆杉转录组测序产生的Unigene信息可以用来开发SSR分子标记，开发的13个标记将有助于南方红viral immunoevasion豆杉物种遗传多样性、分子育种、资源保护等方面的研究。
重症肌无力伴自身免疫性疾病的临床特点研究
目的:归纳总结重症肌无力患者及重症肌无力伴自身免疫性疾病患者的发病特征及临床特点,强化临床医师对重症肌无力及其共病的认识,在此基础上对重症肌无力患者进行针对性的筛查和个体化的诊治,为重症肌无力的早期识别和早期干预提供临床借鉴。方法:收集2015年1月至2022年12月在兰州大学第二医院住院的373例重症肌无力(MG)患者的临床资料,包括发病季节、性别、发病年龄、病程、临床分型、发病诱因、首发症状、定量重症肌无力评分(QMGS)、胸腺情况(正常、胸腺瘤、胸腺增生)、甲状腺情况(正常、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺瘤、甲状腺结节)、自身免疫性疾病、肌无力危象等。归纳总结患者的临床发病特征,剖析性别与发病年龄及QMGS的差异,剖析临床分型与发病年龄、病程及QMGS的差异等。进一步在373例MG患者的基础上,排除MG抗体缺失和重复神经电刺激(DS-3201小鼠RNS)检查缺失者246例后,纳入患者127例。收集性别、发病年龄、MG抗体(Mu SKAb、AChRAb、LRP4Ab、Titin Ab、Ry RAb)、甲状腺功能(TGAb、TPOAb、TRAb、TSH、FT4、FT3)、胸腺情况(正常、胸腺瘤、胸腺增生)、自身免疫性疾病(AD)、RNS(阳性、阴性)等临床资料。分析不同类型MG抗体在性别、发病年龄、胸腺瘤发生率、合并AD及RNS阳性率的差异。同时,根据合并AD的病种不同分为伴一种AD的MG组(简称AD-MG组)、伴自身免疫性甲状腺疾病(ATD)的MG组(简称ATD-MG组)、伴ATD和一种AD的MG组(简称ATD-AD-MG组)和单纯MG组,分析四组MG患者在性别、发病年龄、发病率、MG抗体阳性率、AChRAb阳性率及胸腺瘤发生率上的差异。结果:1.MG患者的发病高峰季节为秋季;发病高峰年龄为45-54岁。MG患者首发症状中,眼肌型重症肌无力(OMG):全身型重症肌无力(GMG)=2.08:1,且OMG以男性多见,GMG以女性多见(P<0.05);临床分型中,OMG:GMG=0.72:1,且OMG以男性多见,GMG以女性多见(P<0.05);2.MG患者的美国重症肌无力基金会(MGFA)分型级别越高,QMGS评分越高,临床症状越重(P<0.05);女性患者的QMGS评分高于男性,临床症状重于男性(P<0.05);3.Mu SKAb阳性与AChRAb阳性MG患者在性别、胸腺瘤发生率、发病年龄、伴AD及RNS阳性率方面均无统计学差异(P>0.05);4.单纯MG患者的发病年龄高峰在45-54岁,MG伴ATD患者的发病年龄高峰在55-64岁;单纯MG患者的发病率与性别之间无统计学差异(P>0.05);ATD-MG患者在伴自身免疫性疾病中的比例最高,ATD-AD-MG患者最低(P<0.01);5.与单纯MG组比较,AD-MG组患者发病年龄更小,女性发病率、MG抗体阳性率及RNS阳性率均更高,均具有统计学差异(P<0.05);两组在胸腺瘤发生率、AChRAb阳性率上无统计学差异(P>0.05);6.与单纯MG组比较,ATD-MG组患者以女性多见,且MG抗体阳性率、AChRAb阳性率及RNmicroRNA biogenesisS阳性率均较高,均具有统计学差异(P<0.05);两组在发病年龄、胸腺瘤发生率上均无统计学差异(P>0.05);7.与单纯MG组比较,ATD-AD-MG组患者中女性比例高,MG抗体阳性率、AChRAb阳性率、胸腺瘤发生率及RNS阳性率均较低,两组比较均无统计学差异(P>0.05);8.ATD-MG组、AD-MG组、ATD-AD-MG组患者相比较,MG抗体、AChRAb及RNS阳性率均有统计学差selleck HPLC异(P<0.05);与ATD-AD-MG组比较,AD-MG组和ATD-MG组患者MG抗体阳性率、AChRAb阳性率及RNS阳性率均高,均具有统计学差异(P<0.05);与ATD-MG患者相比,AD-MG患者MG抗体阳性率、AChRAb阳性率、RNS阳性率方面无统计学差异(P>0.05)。三组MG患者在性别、发病年龄及胸腺瘤发生率上均无统计学差异(P>0.05)。结论:1.首发症状以OMG患者居多且多见于男性;临床分型以GMG患者多见且女性显著多于男性,OMG中男性显著多于女性;2.Ⅰ型MG患者QMGS评分最低,病情最轻;Ⅴ型MG患者的QMGS评分最高,病情最重;女性MG患者QMGS评分高于男性,症状重于男性;3.MG伴自身免疫性疾病中以ATD最常见,伴ATD-AD最少见;AChRAb阳性与Mu SKAb阳性MG患者相比较,在发病年龄、性别、胸腺瘤发生率、RNS阳性率及是否合并自身免疫性疾病方面差异不显著;4.伴AD的MG患者和伴ATD的MG患者均以女性发病多见,且MG抗体阳性率、AChRAb阳性率及RNS阳性率均显著升高,其中发病年龄早的MG患者合并AD的可能性更大;伴ATD-AD的患者MG抗体阳性率、AChRAb阳性率及RNS阳性率最低。
团体正念认知治疗对轻中度抑郁症患者TC及Hcy的影响
目的 探究团体正念认selleckchem Baricitinib知治疗对轻中度抑郁症患总胆固醇（TC）、同型半胱氨酸（Hcy的影响。方法 选择2018年1月至2022年5月淮南市第四人民医院收治的160例轻中度抑郁症患者为研究对象，使用简单随机法分为对照组及观察组各80例，对照组予以常规药物治疗，观察组在对照组治疗方案基础上予以团体正念认知治疗。比较两组患者治疗前、治疗1个月后、治疗2个月后抑郁状况[汉密尔顿抑郁量表（HAMD-17）]、心理弹性[心理弹性简化量表（CD-RISC10）]，比较两组患者治疗前及治疗2个月后应对方式[特质应对方式问卷评定量表（TCSQ）]、认知状况[简易智力状态检查量表（MMSE）、蒙特利尔认知评估量表（MoCA）]、血清指标（TC、Hcy）差异。结果 治疗1个月、2个月后，两组患者HAMD-17评分均较治immune architecture疗前下降，且观察组低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），两组CD-RISC10评分均上升，且观察组高于对照组，C59临床试验差异有统计学意义（P<0.05）。治疗2个月后，两组患者积极应对、MMSE、MoCA评分均较治疗前上升，且观察组高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组患者消极应对评分、TC、Hcy均较治疗前下降，且观察组低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论药物联合团体正念认知治疗对轻中度抑郁症患者的效果优于单纯药物治疗，联合治疗对缓解抑郁状况、增强心理弹性、改善认知状况、改变患者应对方式、改善血清指标的效果更显著。
破伤风毒素功能结构域生物学功能与免疫效力研究
背景:破伤风毒素(Tetanus toxin,TeNT)是由破伤风杆菌产生的一种神经蛋白毒素,这种蛋白质会使感染者的抑制性突触不能释放神经递质,从而引起反射亢进和横纹肌痉挛。TeNT毒性强,估计人体致死剂量低于2.5 ng/kg,未经治疗病死率高达40%。破伤风是一种以肌肉痉挛为特征的危及生命的疾病,这种疾病是由破伤风杆菌产生的神经毒素引起的。TeNT首先是作为一个单一的150 kDa蛋白产生的,它被一个内源性蛋白酶缺刻成一个具有重链(HC,100 k Da)和轻链(LC,50 k Da)的毒素活性形式分子。重链和轻链由链间二硫键连接。重链的C端结构域负责与神经细胞结合,随后内吞形成囊泡,而重链的N端结构域主要帮助轻链穿过囊泡膜进入神经细胞中,轻链分子是一种锌依赖的蛋白酶,它通过链间的二硫键与重链连接,直到轻链到达细胞质,然后二硫键被还原并被释放到神经元的细胞质中,从而发挥毒性作用。目的:为了研究更有效的破伤风重组亚单位疫苗并探究其保护效力,本研究以TeNT为对象,通过对其各功能结构域抗原表位的免疫保护效力进行系统性研究,从而确定具有研发前景的破伤风重组亚单位疫苗的最佳功能结构域抗原分子。此外,由于TeNT的三个主要功能结构域上均含有中和表位,特别是TL-HN分子具有更强的免疫保护效力。因此,为了进一步研究更有效的候选疫苗,本研究拟制备一种具有TeNT所有中和表位的重组基因工程破伤风类毒素(m TeNT),目的是增强它的保护免疫力。方法:本研究通过基因工程技术制备了TeNT各功能结构域片段并连接到pTIG-Trx原核表达载体上,将构建的质粒转入大肠杆菌表达系统中,选择合适的条件进行诱导表达,通过AKTA纯化系统使用亲和层析法进行重组蛋白洗脱,从而获得较高纯度的重组目的蛋白。经SDS-PAGE鉴定各重组蛋白的纯度以及大小。通过Western blot鉴定各重组蛋白与抗TeNT抗体结合特异性。为了评价各重组蛋白的生物学活性,通过SDS-PAGE检测各重组蛋白对底物蛋白VAMP的切割能力;通过ELISA检测m TeNT与神经细胞相关受体GT1b、SV2B、SV2C的结合能力。检测各重组蛋白有无动物毒性,从而确保能够安全地作为亚单位疫苗分子使用。将制备的各功能结构域重组蛋白作为抗原与铝佐剂混合配制成亚单位疫苗,对小鼠进行单独抗原免疫、联合抗原免疫以及剂量依赖性免疫试验,检测免疫后的小鼠体液免疫水平、中和抗体水平和免疫保护效力。结果:功能结构域TL-HN片段在TeNT的所有功能域中具有最高的免疫保护效果。TL-HN在2次免疫后1μg组和10μg组的中和效价分别达到了10 IU/mL和80 IU/mL,它作为保护性抗原产生了最高水平的中和抗体,为所有重组抗原中所测中和效价最高,且具有明显的剂量差异。1次免疫后的小鼠攻毒10~3LD_(50)TeNT后,TL-HN,THc和TL+THN组的ED_(50)分别为42.249 ng,664.433 ng和1MLN8237细胞培养116.589 ng,2次免疫后的小鼠攻毒10~3LD_(50)TeNT后,TL-HN,THc和TL+THN组的ED_(50)分别为10.852 ng,31.210 ng和124.858 ng。从结果中可以看出,剂量依赖性实验再次表明功能结构域抗原TL-HN在几种重组抗原中的保护作用是最强的。在本研究中制备了TeNT的三种L-HN片段分子(TL-HN、TL-GS-HN和TL-2A-HN),均由L和HN结构域组成,不包含Hc结构域。在动物模型中探讨这些TeNT不同功能域片段的免疫学意义。TL-HN的两种变体(TL-GS-HN和TL-2A-HN)并没有提高其免疫保护作用,说明天然未修饰的重组抗原TL-HN可能具有更多的中和性抗体表位。此外,TL+THN组合抗原的保护作用弱于TL-HN抗原,说明两种功能结构域的联合没有明显的协同作用。这个结果也表明TL-HN分子的L和HN连接处或空间结构上可能保留了一些负责诱导血清中和抗体的关键表位。大量实验表明,与THc或TL和THN联合组相比,TL-HN具有更优越的保护作用。本研究通过将TeNT的轻链酶活性区的3个氨基酸(H233A,E234A和H237A)以及受体结合区的3个氨基酸(R1226L,W1289L和Y1290F)进行突变,将编码mTeNT的DNA基因序列连接到pTIG-Trx原核表达载体上。诱导表达后,经AKTA纯化系统通过亲和层析法成功获得了目的蛋白。Western blot实验表明m TeNT与破伤风毒素的两个主要功能结构域(酶活性区和受体结合区)免疫血清抗体均具有良Medical geology好的结合特异性。与破伤风毒素相比,重组蛋白m TeNT既不能够切割底物VAMP2,也不与神经节甘脂GT1b结合,这些结果表明该重组破伤风类毒素(m TeNT)设计符合预期,无酶活性区和受体结合能力。以20μg剂量的m TeNT经腹腔注射KM小鼠后,连续观察一周,小鼠仍全部存活,毒力检测实验表明重组蛋白m TeNT毒力至少降低40万倍,表明本研究制备的m TeNT无毒性,后续能够开展动物免疫保护效力评价selleck抑制剂研究。保护性实验及剂量依赖性实验表明,重组抗原m TeNT具有良好的免疫保护效力,重组抗原m TeNT ED_(50)效力值远低于甲醛灭活的TT疫苗组,表明这种无化学试剂修饰的全长毒素分子蛋白具有更好的构象和中和表位,其免疫保护效力更高;重组抗原m TeNT也比联合组抗原TL-HN+THc的ED_(50)效力略优,进一步体现了全长毒素分子的免疫效力,同时也说明THN和THc的连接处可能无重要的抗原中和表位。总之,重组抗原m TeNT包含了TeNT所有的抗原中和表位。结论:本研究结果首次揭示了TeNT中L-HN功能片段的强保护作用。TL-HN功能结构域分子的结构构象正确、具有酶活性,因此可作为一种筛选抗TeNT抗体分子的抗原免疫分子,也为研究TeNT的活性和构象提供了新的功能分子。因此,TL-HN片段应该在破伤风毒素的免疫保护中发挥着重要作用,为破伤风毒素疫苗或抗体的开发提供了新的研究方向,并可能取代THc或TT作为破伤风毒素候选亚单位疫苗。本研究结果进一步表明,通过基因工程技术灭活的mTeNT疫苗相较于甲醛灭活的TT具有生产方便、批间差异小、免疫保护效力好的优点。因此,基因工程技术灭活的mTeNT疫苗可作为预防破伤风中毒的候选疫苗品种。
杨树独脚金内酯信号转导关键基因PagMAX2的鉴定及功能研究
独脚金内酯作为一种新型植物激素能够调控侧枝的发育,是侧枝发育过程中的关键信号。侧枝发育是多年生木本植物树冠形成的基础,良好的冠形有利于林木在密植管理、城市绿化以及农林复合经营中的应用。同时在本课题组前期的转录组学研究中也发现,与独脚金内酯信号转导相关的D14等基因在窄冠多分枝的窄冠黑白杨(Populus×zhaiguanheibaiyang)与宽冠型杨树中林2025(Populus deltoides zhonglin 2025)的早春萌动期腋芽中的差异表达,D14在窄冠黑白杨中显著下调。前人的研究表明,独脚金内酯的信号转导涉及三种蛋白分子间的相互作用,即F-box蛋白D3/MAX2(DWARF 3/MORE AXILLARY GROWTH 2)、α/β水解酶D14(DWARF 14)以及D53/SMXLs(DWARF 53/SUPPRESSOR of MAX21-LIKE)。其中,MAX2作为F-box蛋白能够在与D14互作后介导D53/SMXLs的泛素化降解进而影响下游基因的表达,因此在独脚金内酯信号通路中具有重要作用。本研究以84K杨(Populus alba×Populus glandulosa)为实验材料,鉴定了杨树中的MAX2同源基因,对其序列及表达模式进行了分析并利用荧光素酶互补实验验证了其与独脚金内酯受体D14的互作。最后,通过创制Pag MAX2a过表达及抑制表达的转基因杨树,证明其能够抑制腋芽的萌发来促进Cell Cycle抑制剂分枝发育。获得的结论如下:(1)84biological feedback controlK杨中Pag MAX2的鉴定及序列分析:从84k杨的基因组中共鉴定到了两个Pag MAX2同源基因,分别命名为Pag MAX2a和Pag MAX2b,并对其进行了基本的理化性质预测。通过将Pag MAX2基因与其他16个物种的MAX2同源基因构建系统发育树,发现Pag MAX2a与Pag MAX2b处在不同分枝,并通过计算序列相似度及一致度证明二者具有较远的遗传距离,这一点与其他物种不同。随后,对Pag MAX2氨基酸序列的保守motif以及启动子顺式作用元件等进行了预测和分析,以进一步阐述杨树中Pag MAX2基因的特点及保守性。(2)Pag MAX2a/b的表达模式分析:研究了在不同组织器官中、腋芽的萌发过程中以及对独脚金内酯类似物GR24处理后Pag MAX2基因表达量的变化模式。发现Pag MAX2在杨树叶片中表达量最高、茎中次之、根系中最低。随着腋芽的萌发Pag MAX2的表达量呈现先升高再降低的趋势。Pag MAX2b相比Pag MAX2a的表达量对外源施加GR24的响应幅度更大。(3)Pag MAX2a/b的亚细胞定位及其与Pag D14a/b的相互作用模式:结果表明,Pag MAX2a与Pag MAX2b均定位在细胞核中,并且仅Pag MAX2a在烟草叶片下表皮细胞中能够与独脚金内酯受体Pag D14a和Pag D14b的互作,而在酵母双杂中没有互作。(4)Pag MAX2a-OE及Pag MAX2aTalazoparib抑制剂-ANTI转基因苗的创制及表型分析:克隆并构建了Pag MAX2a的过表达及反义抑制载体,并通过农杆菌介导的叶盘转化法创制了Pag MAX2a过表达及抑制表达的转基因杨树。通过对其的表型分析发现,Pag MAX2a能通过抑制腋芽的萌发进而调控杨树的分枝发育。
弓形虫顶质体丙酮酸转运蛋白的生物学功能研究
弓形虫是属于顶复门原虫的专性胞内寄生虫,其宿主包括了几乎所有的温血动物。根据流行病学数据估计,全世界超过30%的人口感染了弓形虫。当机体免疫系统受损时或在先天性感染的个体中,弓形虫病可能危及生命。在畜牧业,弓形虫病也被发现是引起母畜流产和死胎的重要原因。除隐孢子虫外,大多数顶复门原虫都拥有一个独特的细offspring’s immune systems胞器-顶质体。顶质体具有寄生虫不可或缺的代谢途径,如需要丙酮酸作为底物的异戊二烯前体生物合成途径。丙酮酸是顶质体中的关键代谢分子,但是,顶质体中的丙酮酸来源仍不清晰。本实验室的研究证明,弓形虫顶质体中的丙酮酸激酶2(Pyruvate kinase2,PYK2)将磷酸烯醇式丙酮酸催化生成IACS-10759半抑制浓度丙酮酸不是顶质体内丙酮酸的主要来源,提示顶质体可能存在输入丙酮酸的途径。本研究使用弓形虫作为模型,利用生物信息学分析筛选到两个潜在的转运蛋白:APC1和APC2(Apicoplast Pyruvate Carrier),经基因编辑、靶向代谢组学、异源表达系统和超分辨显微镜等多种技术方法证明了APC为顶质体丙酮酸转运蛋白,并对其转运功能和生物学功能进行了研究。具体研究内容包括:(1)弓形虫顶质体潜在丙酮酸转运蛋白的筛选与鉴定在分析已发现的转运蛋白如MPC、BASS2和MCT等的特征后,本研究使用Toxo DB中的策略分析功能,通过设置CRISPR表型值评分(Phenotype Score≤-3)、物种特异性(不与隐孢子虫同源)和跨膜特征(TM≥3)等条件,成功筛选到7个潜在的顶质体转运蛋白。最后结合序列分析和构建原位标签定位虫株,确定了两个潜在的顶质体丙酮酸转运载体蛋白并命名为APC1和APC2。本研究聚焦APC2,对其功能进行了深入研究。为验证APC2蛋白在弓形虫生长中的作用,使用条件性蛋白降解系统构建了APC2-m AID虫株。实验结果显示,APC2条件性降解导致弓形虫的生长受到严重影响,其胞内生长受到抑制,空斑也无法形成。~(13)C葡萄糖标记的靶向糖代谢流分析显示,APC2的降解造成糖酵解和三羧酸循环发生了紊乱,~(13)C标记流入糖酵解中间代谢产物(如6-磷酸葡萄糖、果糖-6-磷酸等)和三羧酸循环中间代谢产物(如柠檬酸、顺-乌头酸、琥珀酸等)的量显著减少。这些研究表明APC2是维持虫体的正常生长所必需的,即APC2是弓形虫顶质体的关键蛋白。(2)APC2对维持顶质体的功能和完整性至关重要丙酮酸作为顶质体重要代谢途径MEP和FASⅡ的主要底物,它的产生或来源的稳定对维持顶质体的功能至关重要。对APC2-m AID虫株进行~(13)C葡萄糖标记的靶向脂代谢流和靶向MEP质谱等多种检测,结果显示,在APC2条件性降解后,FASⅡ途径的主要产物肉豆蔻酸(C14:0)和棕榈酸(C16:0)的~(13)C标记含量均大幅下降;MEP途径的主要产物IPP/DMAPP和MEP的含量也显著减少,仅为正常水平的5%-17%,这表明APC2对维持顶质体的正常代谢十分重要。随后,采用顶质体计数和q PCR对顶质体的完整性进行了检测,结果显示,在APC2条件性降解后,顶质体在蛋白和基因水平均发生了明显的缺陷。以上结果说明,APC2对维持顶质体的功能和完整性至关重要。(3)APC复合物具有转运丙酮酸的能力利用同源重组基因缺失技术,构建了缺失丙酮酸转运蛋白的大肠杆菌突变体。而后将APC1、APCVX-765 NMR2表达在大肠杆菌突变体中,并使用斑点试验和放射性同位素[2-~(14)C]丙酮酸吸收实验分别对单独表达APC1、APC2和同时表达APC1与APC2的菌株的丙酮酸转运能力进行评估。结果说明,APC1或APC2的单独表达均没有转运丙酮酸的功能;仅在APC1和APC2同时表达时具有稳定的丙酮酸转运功能;离子依赖性实验说明其转运能力受H~+和Na~+的影响。为探究上述APC1与APC2仅在共表达时具有转运丙酮酸功能的内在原因,本研究通过STED(Stimulated emission depletion)、Split-GFP和Bi FC(Bimolecularfluorescence complementation)技术对APC的跨膜拓扑结构和互作关系进行了研究。结果显示,APC1定位于顶质体膜,且其N端定位于最外侧膜,其C端处于最外侧膜和次外侧膜之间;APC2同样定位于顶质体膜,且其N和C端均定位于最外侧膜;经Bi FC技术检测,APC1和APC2在顶质体膜上有互作关系。以上结果说明,APC在顶质体膜中以复合物的形式行使转运丙酮酸的功能。综上所述,本研究发现了潜在的顶质体转运蛋白,鉴定了它们以复合物的形式构成顶质体丙酮酸转运载体,将细胞质中丙酮酸导入顶质体。APC2的生物学功能研究证明其在虫体生长和顶质体功能等方面的重要作用。本研究为理解顶质体代谢提供了重要依据,APC的独特属性也为抗寄生虫药物的设计提供了新的靶标。
焙烤对宁夏滩羊肉脂肪酸、氨基酸及核苷酸含量的影响
以宁夏盐池滩羊为研究对象，探究不同烤制时间对羊肉脂肪酸、氨基酸以及核苷酸含量的变化的影响。研究结果表明：烤制过程中，总蛋白质含量由19.92%上升到40.51%，总脂肪含量由3.51%上升到12.75%。总脂肪酸含量在烤制0～8min增加，8～12 min降低，12～20 min再增加，差异不显著（P>0.05）。在测出的25种脂肪酸中，油酸、硬脂酸和棕榈酸含量普遍较高，在100 mg/100 g以上。总水解氨基酸含量显著增加（P<0.05），由鲜羊肉PF-03084014使用方法中的18.5 g/100 g上升至49.42 g/100 g，其中以赖氨酸、亮氨酸和半胱氨酸增加最为明显。游离氨基酸中精氨酸、丙氨酸以及半胱氨酸含量上升，而组氨酸含量下降，其它游离氨基酸含量变化不显著（P>0.05）。滋味活度值（TAV）法确定了烤制滩羊肉中关键的鲜味氨基酸为谷氨酸，关键甜味氨基酸为丙氨酸，关键苦味氨基酸为蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸。烤制滩羊肉中的主要滋味物质5′-腺苷酸和5′-鸟苷酸的含量随着烤制时间的延长呈现上升趋势（P>0.05）。PCcorneal biomechanicsA分析表明滩羊肉中脂肪酸、水解氨基酸、游离氨基酸和核苷酸的含量在烤制过程中Canagliflozin差异明显。
靛红类化合物的设计、合成及生物活性研究
靛红衍生物易透过血脑屏障,具有包括抗菌、抗结核和抗肿瘤在内的多种生物活性。构-效关系研究结果表明,靛红N-1位、C-3位和C-5位取代基对其生物活性及药代动力学性质等影响显著,故对N-1位、C-3位和C-5位进行结构修饰是近年来该领域最主要的研究方向。本课题组近年来对靛红进行了多种结构修饰,并筛选出若干具有深入研究价值的候选物。作为对这一设计思想的进一步延伸,Hepatic organoids我们在设计合成新型靛红类杂合体时,也以修饰N-1位、C-3位和C-5位为主。苯并呋喃和青蒿素衍生物也具有多种生物活性且安全性良好,将靛红与苯并呋喃和青蒿素母核杂合是研发起效快、疗程短、抗耐药、无药物相互作用且毒副作用低的先导化合物的有效策略。因此,本论文研究工作分以下两方面展开:鉴于苯并呋喃衍生物不仅具有广谱的体外抗菌活性和抗结核活性,而且显示出良好的体内理化、毒理和药理特性,本研究设计并合成了一系列不同长度的烷基连接子的靛红-苯并呋喃杂合体,初步评价了它们的体外抗菌和抗分枝杆菌活性以及对VERO细胞的毒性。初步研究发现,靛红-苯并呋喃杂合体对所有测试的包括耐药性MRSA和MRSE在内的革兰阳性菌和革兰阴性菌表现出相当强的抗菌作用。构-效关系研究结果表明,靛红C-3位的羰基和长烷烃连接子对抗菌活性有利。其中,代表物I-17和I-35具有出良好的抗菌活性,二者对绝大多数所测试的革兰阴性和阳性菌的MIC值≤1μg/m L,且对革兰阳性菌的体外活性与万古霉素(MIC:0.5～4μg/m L)相当,对革兰阴性菌的活性则仅略低于环丙沙星(MIC:≤0.03～0.5μg/m L)。此外,大多数靛红-苯并呋喃杂合体也表现出相当强的体外抗结核活性(对药敏型和耐药型MTB的MIC分别为<0.016～0.218μg/m L和0.062～14.15μg/m selleck产品L),且具有较高的选择性。其中,活性最高的杂合体I-35(MIC分别为<0.016、0.062和0.16μg/m L)是一线抗结核药物利福平和异烟肼的4.8倍和≥48倍,但其药代性质不如TAM16和环丙沙星。尽管如此,杂合体I-35仍可作为先导物进一步优化。二氢青蒿素具有良好的抗肿瘤作用,且构-效关系显示,对靛红-二氢青蒿素而言,靛红和二氢青蒿素之间的连接子对活性具有显著影响。基于此,本文设计了一系列不同烷烃羧酸酯连接的靛红-二氢青蒿素杂合体,并评估了它们对药敏性(MCF-7和MDA-MB-231)和多药耐药乳腺癌(MCF-7/ADR和MDA-MB-231/ADR)细胞系的抗增殖活性。结果显示,这类杂合体对药敏型和耐药型乳腺癌细胞系具有显著的抑制作用。构-效关系研究结果表明,烷基羧酸酯的碳链长度与活性息息相关,且短链连接子对活性有利。代表物II-7、II-14和II-17对MDA-MB-231的活性与阿霉素相当,且对耐多药乳腺癌细胞系也表现出优异的抑制活性(IC_(50)<10μM),提示这类杂合体具有克服耐药性的潜力。此外,这三个杂合体(IC_(50)>100μM)对正常乳腺细胞MCF-10A无毒性作用。因此,这三个杂合体具有此网站进一步研究的潜力。总之,通过以上研究工作共合成了93个化合物,新化合物的结构均经~1H NMR和MS确证,部分目标物还经~(13)CNMR进一步确证。本论文的研究工作进一步丰富了该类化合物的构-效关系,为下一步的合理设计提供实践基础。