热射病分为劳力型和经典型，主要表现为有明确的高温高热环境暴露史或高温环境中的活动史，核心温度超过40℃，伴有中枢神经系统改变(包括意识改变、癫痫、精神症状等)和多器官损伤，包括呼吸衰竭、肝肾功能受损、横纹肌溶解、凝血障碍、腹胀腹泻等。其病理学可表现为器官内皮细胞损伤、炎症反应、广泛的血栓形成和出血倾向等。主要治疗措施为降温治疗，合并其他器官损伤时应及时早期行器官支持或替代治疗，包括输血改善凝血功能，血液净化治疗等，缺血缺氧性脑病可联合高压氧治疗，改善患者预后。本文报道一例消防员在森林救火过程中突发意识障碍、高热，至当地医院行头颅计算机断层扫描（CT）检查可见脑沟脑回显示不清，提示严重的脑水肿，最后诊Enzymatic biosensor断为热射病的病例。转入柳州市工人医院后，病情继续恶化，出现多器官功能衰竭表现。通过早期降温、镇静抗癫痫、气管插管呼吸机辅助呼吸、抗感染、液体复苏、输注新鲜冰冻血浆及血小板改善凝血功能、免疫调节治疗、肾脏替代治疗Gefitinib抑制剂、及时人工肝治疗等一系列措施后，成功阻止ABT-199化学结构了病情的进一步发展，逆转了脑水肿。康复阶段辅助以高压氧治疗，患者出院时恢复良好，未遗留明显神经系统后遗症。其预后情况明显优于入院时的预估。
3.0T MR弥散加权成像参数联合在鉴别前列腺癌及Gleason分级中的应用
目的：分析3.0T MR弥散加权成像（DWI）参数联合在鉴别前列腺癌及Gleason分级中的应用价值。方法：纳入2020年1月—2022年12月萍乡市人民医院收治的90例前列腺疾病患者进行回顾性分析，其中42例前列腺癌患者纳入癌症组，48例良性前列腺增生患者纳入增生组，所有患者均实施磁共振成像（MRI）检查。评估癌症组患者Gleason分级，并根据Gleason分级将其分为高分化组、中低分化组。比较癌症组与增生组DWI参数[信号强度（SI）、表观弥散系数（ADC）、指数表观弥散系数（eADC）]，以受试者操作特征（ROC）曲线评估DWI参数联合诊断前列腺癌的价值；比较高分化组与中低分化组患者的DWI参数（SI、ADC、eADC），以ROC曲线评估DWI参数联合诊断高分化前列腺癌的价值。结果：癌症组患者SI、eADC均显著高于增生组，ADC显著低于增生组（P<0.05）;ROC曲线中，SI、ADC、eADC联合诊断前列腺癌的曲线下面积（AUCFulvestrant）为0.852，敏感度为78.57%，特异度为79MLN4924抑制剂.17%。高分化组SI、eADC均显著低于中低分化组，ADC高于中低分化组（P>0.05）;ROC曲线中，SI、ADC、eADC联合诊断高分化前列腺癌的AUC为0.970，敏感度为94.74%，特异度为91.30%。结论：DWI参数联合诊断前列腺癌具有较高价值，可作为临床诊断前列腺癌和判断其分化evidence informed practice程度的依据。
阿司匹林联合肝素钙在四肢骨折患者围术期的应用及对下肢深静脉血栓的预防价值研究
目的：探讨阿司匹林联合肝素钙在四肢骨折患者围术期的应用及对下肢深静脉血栓的预防价值。方法：将2000例四肢骨折患者随机分为两组。对照组于围术期应用低分子肝素钙治疗，观察组采用阿司匹林联合低分子肝素钙治疗。比较两组围术期指标；比较两组治疗前后血小板、血红蛋白与D-Ferrostatin-1作用二聚体水平；比较两组随访1个月内DVT发生情况。结果：观察组术中出血量与术后引流量与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。治疗后，观察组血小板、血红蛋白与D-二聚体水平均低于对照组(P<0.05)。治疗后14d,观察组DVT发生率为1.30%,低于对照组的7.90%;治疗后1个月，观察组DVT发生率为2.10%,低于对照组的12.40%(P<0.05)。结论：阿司匹endodontic infections林联合肝素钙在四肢骨折患者围术期的应用效果较好3-MA体内实验剂量，可通过改善患者血小板、血红蛋白与D-二聚体水平，进而避免下肢深静脉血栓形成。
归芍运脾汤对肝郁脾虚型乳腺增生大鼠的性激素水平及血管生成因子的影响
目的：探讨归芍运汤对肝郁脾虚型乳腺增生大鼠的性激素水平及血管生成因子的影响。方法：选取12周龄SPF级SD大鼠60只，随机分为归芍运脾颗粒低、中、高倍组、空白组、模型组、他莫昔芬组，除空白组不予干预外，其余各组均采用饥饱失常法+夹尾刺激法+苯甲酸雌二醇+黄体酮等综合方法慢性刺激30天，构建肝郁脾虚型乳腺增生模型，确认造模成功后，归芍运脾汤低、中、高剂量组分别给予相应剂量归芍运脾汤灌胃selleck，空白组和模型组予蒸馏水灌胃，阳性对照组予他莫昔芬灌胃，干预30天后观察大鼠一般状况及行为改变，观察大鼠旷场实验阳性反应，并用ELISA法检测各组大鼠血清中雌二醇（E2）、磷（P）、催乳素（PRL）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的含量。结果：与空白组比较，模型组大鼠暴躁易GDC-0068细胞培养激惹，扎堆蜷卧，旷场实验阳性（大鼠运动总路程、直立次数、穿越中央场次数均减少），乳头直径、高度增加（P<0.05）,E2、PRL升高（P<0.05）,P下降（P<0.05）；与模型组相比，各给药组大鼠一般生活状态及旷场实验反应改善，乳头直径、高度下降（P<0.05）,E2、PRL下降（P<0.05）,P增加（P<0.05），血清中b FGF、VEGF水平降低（P<0.Immuno-chromatographic test05）。结论：归芍运脾汤能够有效改善肝郁脾虚型乳腺增生大鼠一般生存状况，其具体机制可能与归芍运脾汤调节激素内分泌及血管生成因子有关。
利用杆状病毒表达系统表达并纯化冠状病毒刺突蛋白S2亚基
冠状病毒(Coronavirus)是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒,在自然界中广泛存在,也是已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒分为α、β、γ及δ四类,严重急性呼吸道冠状病毒2型(SARS-Co V-2)属于β型冠状病毒。SARSCo V-2有很强的传染性和致病性,同时SARS-Co V-2具备很强的变异能力,在大流行的三年时间内变异产生了包括Alpha,Beta,Gamma,Delta,Omicron等变异株。冠状病毒的病毒粒子外包裹着脂双层膜,膜表面有包括刺突蛋白(S)在内的多种糖蛋白。S蛋白介导病毒侵入靶细胞,其中S1亚基负责识别和结合宿主细胞血管紧张素转换酶2(ACE2)受体,S2亚基负责病毒与宿主细胞的膜融合。S1亚基中通过受体结合域(RBD)与ACE2结合后,S2亚基的融合肽(FP)插入细胞膜,HR2与HR1结合形成六聚体的结构,拉动HR1 N端的细胞膜和HR2 C端的病毒膜接触并发生融合。与S1亚基相比,不同冠状病毒的S2亚基具有更高的保守性,对于S2亚基的研究可以为冠状病毒预防、诊断和治疗提供新的思路。而高纯度和高活性的S2亚基的获取,对研究S2亚基的结构与功能、筛选靶向SSCH727965化学结构2亚基的单克隆抗体、设计以S2亚基为靶点的表位疫苗,具有重要的意义。本研究利用杆状病毒表达系统,对不同来源的冠状病毒S2亚基进行了表达、分泌及纯化研究,主要内容及结果如下:(1)选取了8种与SARS-Co V-2相关的冠状病毒(Ra TG13、WIV1、GX-P5L、GD18、Civet SZ3、Civet 007、SARS-Co V、SARS-Co V-2),对其S蛋白基因进行了生物信息学预测分析,确定了S2亚基的主要抗原区。将这些S2亚基的基因编码序列克隆到带有不同信号肽序列和检测纯化标签的表达载体上。(2)利用带有GP64sp与His Tag的pQB3载体对对其中4种冠状病毒S2蛋白进行表达和分泌检测,发现4种S2蛋白都有较好的表达分泌效果。与Sf9细胞相比,High Five细胞的分泌效果更好。利用Ni-Agarose Resin纯化系统对带有His Tag的S2蛋白进行纯化,发现蛋白的挂柱率很低。(3)利用带有Fib Hsp、m Fc Tag的p Tri Ex载体对上述4种冠状病毒S2蛋白进行表达,S2蛋白的表达量有所提高,但WIV1毒株的S2-Fc融合蛋白无分泌。利用Protein A Agarose纯化系统对S2-Fc融合蛋白进行纯化,在纯化的蛋白中出现了蛋白断裂的现象,推测这种断裂可能与细胞Nirogacestat的培养条件及洗脱液p H值过低都有关。(4)在pQB4载体的基础上插入Strep Tag构建了pQB4-SH重组载体。利用该载体表达8种冠状病毒S2蛋白,S2蛋白获得了良好的表达及分泌。利用Strep-Tactin XT4Flow纯化系统对带有Strep Tag的S2蛋白进行纯化,纯化效率显著提高。(5)在蝙蝠源的冠状病毒WIV1毒株的S2蛋白研究中,获得了第297位Arg突变为Gln、410位Val突变为Ile的突变体。蛋白表达结果发现,两个氨基酸突变并不影响其蛋白的表达量。但在蛋白的纯化方面,与野生型相比,突变型的蛋白纯化效率有明显提高。结构预测分析表明,突变导致蛋白N端尾部的Strep Tag暴露在蛋白的折叠区外,可以与纯化柱更好地结合。(6)BCA蛋白定量结果显示,Ra TG13毒株与WIV1毒株S2蛋白的纯蛋白产量最高,接近4mg/L;Civet 007毒株S2蛋白的纯蛋白产量最低,但也超过了2mg/L。(7)利用临床获得的人血清样品进行抗原活性检测。结果显示,接种SARS-Co V-2疫苗加强针前和接种加强针后的血清,多数可以与本研究获得的8种冠状病毒S2抗原产生阳性结果,且与接种加强针后的血清反应更强。该结果表明,本论文获得的冠状病毒S2亚biologic drugs基具有良好的抗原活性,而且8种S2蛋白具有一些共同的抗原表位,与SARS-Co V-2的抗血清具有交叉反应性。综上所述,本论文成功构建了可大量表达、分泌并纯化多种冠状病毒S2亚基的表达纯化体系。该表达体系的建立可以为后续冠状病毒S2蛋白的结构与功能研究、靶向S2亚基的单克隆抗体筛选、以S2亚基为靶点的表位疫苗设计等研究奠定基础。
ICU中伴凝血功能障碍老年脓毒性休克患者新鲜冰冻血浆治疗中内皮多糖包被的保护因素
目的 探讨重症监护室(ICU)中伴凝血功能障碍的老年脓毒性休克患者新鲜冰冻血浆治疗内皮多糖包被(GCX)的保护因素。方法 回顾性纳入ICU收治的200例伴有凝血功能障碍的老年脓毒性休克患者，分为内皮GCX保护组(n=100)和无内皮GCX保护组(n=100)。经单因素和LogistIACS-10759试剂ic多因素回归分析ICU伴凝血功能障碍的老年脓毒性休克患者新鲜冰冻血浆治疗GCX的保护因素。结果 内皮GCX保护组血乳酸(Lac)、多配体蛋白聚糖(Syndecan)-1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、细胞间黏附分子(ICAM)-1、硫酸乙酰肝素水平均显著低于无内皮GCX保护组，差异有统计学意义(P<0.05),Logistic多因素回归分析显示，Lac、Syndecan-1、MMP-2、ICAM-1、硫酸乙酰肝素水平均是ICU伴凝血功能障碍的老年脓毒性休克患者新鲜冰冻血浆Immuno-related genes治疗GCX的保护因素(P<0.05)。结论 ICU伴凝血功能障碍的老年脓毒性休克患者新鲜冰冻血浆治疗GCX的保护selleckchem MLN8237因素多种多样，包括Lac、Syndecan-1、MMP-2、ICAM-1、硫酸乙酰肝素水平，临床上应重视新鲜冰冻血浆治疗GCX的保护因素，以帮助患者达到更好的疗效。
小檗碱诱导骨肉瘤细胞铁死亡的作用及机制
目的 探讨小檗碱对MG63骨肉瘤细胞铁死亡的影响及机制。方法 以不加药的细胞为对照，用不同浓度（2.5、5.0、10.0μmol/L）小檗碱作用于细胞24 h，检测细胞存活率、铁死亡相关指标[细胞核增殖相关抗原Ki-67(Ki67)、线粒体超微结构、Fe2+、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）]变化、信号转导及转录活化因子3(STAT3)与DNA结合活性以及磷酸化STAT3(pSTAT3)、肿瘤蛋白53(p53)和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白表达水平。为观察p53在小檗碱诱导细胞铁死亡中的作用，转染p53 siRNA，将细胞分为对照组、p53 siRNA组、小檗碱组和p53 siRNA+小檗碱组，以10.0μmol/L小檗碱作用24 h后，检测细胞内p53和SLC7A11蛋白表达水平、线粒体膜电位、GSH水平以及MDA含量。为探究STAT3在小檗碱调控p53/SLC7A11信号通路中的作用，转染STAT3过表达质粒，将细胞分为对照组、小檗碱组、STAT3组和STAT3+小檗碱组，以10.0μmol/L小檗碱作用24h后，检测细胞内p-STAT3、STAT3、p53和SLC7A11蛋白表达水平。结果 与对照细胞比较，2.5、5.0、10.0μmol/L小檗碱均能降低细胞存活率和细胞内Ki67蛋白表达，引起线粒体形态改变，升高细胞内Fe2+、ROS和MDA水平以及p53蛋白表达水平，降低GSH水平、STAT3与DNA的结合活性以及p-STAT3和SLC7A11蛋白表达水平，差异均有统计学NSC 127716意义（P<0.05或P<0.01）。与小檗碱组比较，p53 siRNA+小檗碱组细胞内p53蛋白表达水平和MDA水平降低，SLC7A11蛋白表达水平、线粒体膜电位以及GSH水平升高，Liraglutide说明书差异均有统计学意义（P<0.01）。与小檗碱组比较，STAT3+小檗碱组细Laboratory Automation Software胞内p-STAT3、STAT3、SLC7A11蛋白表达水平升高，p53蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 小檗碱可通过STAT3/p53/SLC7A11信号通路诱导MG63细胞铁死亡。
PEAR1、GSTP1基因型与脑梗死预后的相关性分析
目的 探讨PEAR1、GSTP1基因型与脑梗死预后的相关性，为脑梗死个体化精准治疗及二级预防提供理论参考.方法 选取首发症状型脑梗死患者，入院后遵循抑制血小板聚集、营养神经、改善循环及对症治疗原则，患者24 h内口服阿司匹林100 mg, 1次/d,并长期维持治疗.收集患者的一般资料、既往史、血小板相关指标、PEAR1及GSTP1基因型、相关待测量表评selleck产品分及脑梗死复发周期，出院随访13个月.根据脑梗死复发及复发周期进行分组，比较PEAR1、GSTP1基因多态性及其他临床资料与脑梗死预后是否具有关联.结果 入组患者PEAR1基因突变型(AA+AG)占60.1%,未突变型(GG)占39.9%;GSTP1基因突变型(AG+GG)占31.8%,未突变型(AA)占68.2%.对比分析两组患者冠心病病史、出院时NIHSS评分、血小板计数及GSTP1基因型与脑梗死复发有关联.多因素Logistic回归分析显示冠心病病史、出院时低NIHSS评分、低血小板计数及GSTP1基因突变型Triterpenoids biosynthesis(AG+GG)为脑梗死复发的独立危险RSL3试剂因素(P<0.05).结论 首发症状型脑梗死患者年龄越大、出院时低NIHSS评分、低血小板计数或GSTP1为基因突变型(AG+GG)脑梗死预后较差.
AKT1介导FTH1自噬降解在顺铂耐药卵巢癌中调控铁死亡敏感性的机制研究
卵巢癌是一种对铂类药物敏感的肿瘤,一线常规治疗通常有较高的疗效。然而,75%的晚期患者在接受顺铂(Cis[Pt Cl_2(NH_3)_2],DDP)治疗一段时间后仍会发生转移和/或复发,顺铂耐药性最终会影响癌症患者的长期生存率。卵巢癌对顺铂耐药的机制很复杂,研究表明,它可能与药物外排增加、表观遗传改变、DNA修复增强和自噬激活有关。尽管自噬在肿瘤形成过程中的促生长和促死亡作用仍有争议,大量研究支持在化疗药物引起的微环境压力下,肿瘤细胞将刺激自噬作为对抗化疗药物细胞毒性的保护机制,最终导致化疗耐药性的出现。铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡方式。在二价铁离子或酯氧合酶的作用下,催化细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质体过氧化,从而诱导细胞死亡。某些耐药肿瘤细胞,特别是间充质状态的、易转移的肿瘤细胞,极易发生铁死亡,但具体机制不明。因此,明确耐药卵巢癌细胞对铁死亡激活剂的易感性可能为卵巢癌临床治疗提供新的视角。抗氧化体系失活和铁代谢紊乱是影响细胞铁死亡敏感性的重要因素。一种被称为x CT(SLC7A11)的胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白有助于从头合成抗氧化剂谷胱甘肽(Glutathione,GSH)。GSH在催化磷脂氢过氧化物解毒中的作用对细胞生存至关重要。GSH也是谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)的底物。因此,半胱氨酸剥夺和GPX4抑制可以有效地诱导铁死亡。GPX4抑制剂RSL3以及SLC7A11的直接抑制剂Erastin被广泛用于诱导铁死亡。增加铁的吸收,减少铁的储存和限制铁的外流都会导致铁积累增加,促进铁死亡。转铁蛋白通过介导铁摄取影响细胞铁积累,而铁蛋白的合成和降解均能影响铁水平。细胞质中过量的铁离子储存在由铁蛋白重链FTH1和铁蛋白轻链FTL1组成的铁蛋白复合体中。与对铁死亡敏感的细胞相比,FTH1和FTL1在对铁死亡不敏感的细胞中的表达量显著增加。最近的研究指出,铁死亡可能是自噬依赖性的。这是因为对铁死亡激活剂的反应导致自噬体的积累,而自噬机制的成分有助于铁死亡的发生。此外,铁蛋白的自噬降解可以增加细胞内的不稳定铁离子水平,使细胞对铁死亡更加敏感。本研究通过使用两个卵巢癌亲本和顺铂耐药细胞系,我们发现顺铂耐药的卵巢癌细胞对铁死亡诱导剂Erastin更敏感。进一步研究发现,顺铂耐药细胞的高自噬水平导致了游离铁离子水平的增加。动物实验表明Erastin和DDP联合应用对耐药卵巢癌细胞具有良好的治疗效果。重要的是,自噬抑制分子AKT1在顺铂治疗不敏感卵巢癌患者中表达显著降低。因此,我们假设顺铂耐药卵巢癌细胞通过维持高自噬水平应对化疗压力,这种自噬状态启动了铁蛋白FTH1/FTL1的降解并导致铁离子的释放,进而导致顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡诱导剂更加敏感。本研究旨在阐明铁死亡与卵巢癌顺铂耐药之间的联系,为明确AKT1/FTH1途径在顺铂耐药卵巢癌铁死亡中的作用提供科学依据,对靶向铁死亡途径逆转顺铂耐药提供新的策略。方法:1.顺铂耐药卵巢癌细胞铁死亡敏感性增加(1)顺铂耐药卵巢癌细胞株的验证SKOV3和A2780顺铂耐药卵巢癌细胞株(记为Res)及亲本细胞株(记为Par)由课题组前期构建,实验前分别经0、2.5、5、10及20μM顺铂处理,CCK8法检测亲本细胞和耐药细胞活力。(2)顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感性增加使用20μM Erastin对卵巢癌亲本及耐药细胞株处理24h,CCK8法评估细胞活力。ELISA法检测MDA、GSH、SOD水平,铁离子比色法检测游离铁水平。荧光探针染色检测ROS水平。Ferrostatin-1预处理细胞后再经Erastin杀伤,CCK8法评估细胞活力以明确顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感性增加。2.靶向铁死亡途径逆转卵巢癌顺铂耐药(1)Erastin增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤针对SKOV3-Res及A2780-Res细胞分别进行顺铂单药或顺铂联合Erastin处理。使用CCK8法测定细胞活力,使用钙黄绿素/PI分别对活/死细胞进行染色以判断凋亡率。(2)Erastin增强顺铂对小鼠卵巢癌耐药模型的治疗效果将2×10~6个SKOV3-Res细胞悬液对C57BL/6雌性小鼠进行腹腔注射,制备卵巢癌腹腔转移模型。一周后,小鼠接受三种不同治疗:对照(DMSO,0.05%)、DDP(4mg/kg)或DDP(4mg/kg)+Erastin(1mg/kg)。小鼠每3天腹腔注射一次药物,持续4周。统计小鼠生存时间,腹水量,腹壁转移瘤数目,HE染色检测转移瘤对腹壁侵犯情况。3.顺铂耐药卵巢癌细胞通过FTH1自噬降解对铁死亡易感(1)顺铂耐药卵巢癌的Erastin敏感性不依赖于铁死亡防御系统分别在有/无Erastin处理条件下对亲本及DDP耐药的SKOV3及A2780细胞中GPX4、NRF2和SLC7A11蛋白水平进行Western Blot检测。RT-PCR对NRF2靶基因HO1和NQO1进行检测。(2)铁蛋白FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中下调分别在有/无Erastin处理条件下对亲本及DDP耐药的SKOV3及A2780细胞中铁蛋白FTL1及FTH1进行Western Blot检测。RT-PCR法检测铁蛋白FTL1及FTH1的m RNA表达。(3)FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中降解增加以10μ/m L放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理细胞阻断新蛋白的合成,以观察FTH1在亲本细胞和耐药细胞中的蛋白稳定性。FTH1质粒转导SKOV3-Res和A2780-Res细胞后,以活/死染色和CCK8法检测细胞对Erastin诱导的铁死亡的反应。(4)顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平增加透射电镜观察了顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞的自噬小体,免疫荧光染色检测顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞中自噬标志物LC3b的表达。使用自噬抑制剂3-MA处理后,Western Blot检测FTH1蛋白的表达情况,CCK8法评价顺铂耐药卵巢癌细胞对Erastin杀伤的敏感性。4.顺铂耐药卵巢癌细胞中AKT1缺失介导FTH1自噬降解(1)基于GEO数据库筛查卵巢癌顺铂耐药差异基因通过对GEO数据库GSE23603中17例顺铂治疗完全应答(Complete response,CR)患者和10例不完全应答(Incomplete response,IR)患者的测序结果进行比对,分析顺铂耐药的差异基因,KEGG分析差异基因所富集的分子通路,免疫组化染色检测CR与IR患者卵巢癌组织AKT1的表达。(2)AKT1缺失与卵巢癌预后的关联分析通过TCGA数据库分析AKT1表达水平与卵巢癌预后的关系。AKT1由中位表达水平分为高表达组及低表达组,Nomogram模型用于评估卵巢癌患者AKT1丢失的风险。(3)AKT1缺失上调顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平在SKOV3-Res和A2780-Res细胞中转导外源性AKT1,Western Blot检测AKT1、LC3b、p-ULK1及FTH1的表达。CCK8法检测在顺铂耐药的卵巢癌细胞中恢复AKT1表达后,Erastin诱导的细胞铁死亡情况。结果:1.顺铂耐药卵巢癌细胞铁死亡敏感性增加(1)顺铂耐药卵巢癌细胞株的验证与亲本细胞相比,SKOV3-Res细胞对顺铂具有更强的耐药性(IC50/SKOV3-Par=10.717,IC50/SKOV3-Res=23.830)。与亲本细胞相比,A2780-Res细胞对顺铂具有更强的耐药性(IC50/A2780-Par=9.528,IC50/A2780-Res=25.591)。以上结果说明,SKOV3和A2780顺铂耐药selleck产品卵巢癌细胞株构建成功。(2)顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感性增加(1)使用20μM Erastin对卵巢癌亲本及耐药细胞株处理24h,CCK8法评估细胞活力,与亲本细胞相比,SKOV3-Res细胞和A2780-Res细胞活力均显著降低。Erastin处理后,与亲本细胞相比,SKOV3-Res和A2780细胞中SOD和GSH水平均显著降低,MDA水平增加。细胞铁积累是铁死亡的典型标志之一,Erastin处理后,顺铂耐药的SKOV3和A2780细胞中亚铁离子水平均显著高于亲本细胞。脂质ROS的增加是细胞发生铁死亡的重要特征,Erastin处理后SKOV3-Res及A2780-Res细胞中的ROS水平显著高于对应的亲本细胞。(2)预先使用10μM Fer-1处理细胞2h后评估Erastin的杀伤效果,发现抑制铁死亡途径挽救了Erastin对亲本和顺铂耐药卵巢癌细胞的杀伤。这些结果说明,与亲本细胞相比,顺铂耐药卵巢癌细胞具有高铁死亡敏感性。2.靶向铁死亡途径逆转卵巢癌顺铂耐药(1)Erastin增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤相比于单独顺铂治疗,顺铂联合Erastin处理导致耐药卵巢癌细胞细胞活力显著降低,凋亡率显著增加。提示,在体外实验中Erastin增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤。(2)Erastin增强HDAC抑制剂顺铂对小鼠卵巢癌耐药模型的治疗效果与单独DDP治疗组小鼠相比,DDP+Erastin联合治疗组小鼠的腹壁转移性肿瘤更少,DDP+Erastin联合治疗组小鼠的转移瘤对腹壁的侵袭更低,腹水体积更小,中位生存时间更长。以上结果说明,Erastin与顺铂联合治疗在体外及体内实验中均表现出对顺铂耐药卵巢癌更强烈的杀伤效果。3.顺铂耐药卵巢癌细胞通过FTH1自噬降解对铁死亡易感(1)顺铂耐药卵巢癌的Erastin敏感性不依赖于铁死亡防御系统(1)在未经Erastin杀伤的情况下,铁死亡防御系统的关键分子在SKOV3-Res细胞中的表达显著高于SKOV3-Par细胞。Erastin显著诱导了NRF2和SLC7A11的上调,且不改变SKOV3-Res细胞及SKOV3-Par细胞的表达差异。然而,Erastin对SKOV3-Res细胞中的GPX4表达呈现强烈的抑制作用。经Erastin治疗后,GPX4在SKOV3-Res细胞中的表达显著低于其亲本细胞。(2)在未经Erastin杀伤的情况下,GPX4、NRF2和SLC7A11在A2780-Res细胞中的表达显著高于A2780-Par细胞。Erastin处理导致了GPX4在A2780-Res细胞中显著下调。RT-PCR结果显示顺铂耐药卵巢癌细胞中NRF2靶基因HO1和NQO1的增加,证明了抗ROS系统活性的增强。以上结果表明,顺铂耐药卵巢癌细胞对Erastin的高敏感性似乎并不依赖于铁死亡防御系统的失活。(2)铁蛋白FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中下调经Western Blot检测转铁蛋白FTL1及FTH1发现,与亲本细胞相比,SKOV3-Res和A2780-Res细胞中FTH1蛋白水平增加,但FTL1蛋白水平没有增加。Erastin处理后FTH1和FTL1的蛋白表达受到抑制,但顺铂耐药卵巢癌细胞中FTH1的表达水平仍低于其亲本细胞。RT-PCR结果显示,与亲本细胞相比,顺铂耐药细胞中FTH1的m RNA水平没有显著差异。这些数据表明了FTH1受到转录后调节的可能性。(3)FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中降解增加(1)以10μ/m L CHX处理细胞阻断新蛋白的合成,以未经CHX处理的细胞中FTH1蛋白的表达为起始标准值,发现顺铂耐药卵巢癌细胞中FTH1蛋白的降解率与亲本细胞相比显著增加。(2)在顺铂耐药卵巢癌细胞中恢复FTH1蛋白表达后,顺铂耐药卵巢癌细胞对Erastin诱导的铁死亡敏感性降低。表明顺铂耐药卵巢癌细胞可能通过促进FTH1的降解而增加LIP中游离铁离子的水平,可能是铁死亡敏感性增加的原因。(4)顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平增加(1)通过透射电镜观察了顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞的自噬小体情况,发现SKOV3-Res及A2780-Res细胞的自噬小体较对应亲本细胞增加。通过免疫荧光染色检测了顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞中自噬标志物LC3b的表达情况,发现SKOV3-Res及A2780-Res细胞的LC3b表达高于对应亲本细胞。说明顺铂耐药卵巢癌细胞维持较高的自噬水平。(2)使用自噬抑制剂3-MA处理后,Western Blot检测FTH1蛋白的表达情况,发现阻断自噬恢复了FTH1的蛋白表达。提示顺铂耐药卵巢癌细胞的高自噬水平导致了FTH1的蛋白降解。(3)3MA处理导致SKOV3-Res和A2780-Res细胞对Erastin杀伤的敏感性降低。上述结果提示,高自噬水平导致的FTH1降解介导了顺铂耐药卵巢癌细胞的铁死亡敏感性。4.顺铂耐药卵巢癌细胞中AKT1缺失介导FTH1自噬降解(1)基于GEO数据库筛查卵巢癌顺铂耐药差异基因通过对GEO数据库GSE23603中17例CR患者和10例IR患者的测序结果进行比对,发现IR患者的测序结果中自噬抑制分子AKT1显著降低。KEGG富集分析表明,CR及IR患者差异基因在MAPK及PI3K-AKT途径中富集。IR患者卵巢癌组织中AKT1表达显著下调。(2)AKT1缺失与卵巢癌预后的关联分析TCGA数据库分析AKT1表达水平与卵巢癌预后的关系,发现AKT1低表达可能预示着较短的生存时间和不良预后。生存分析发现,卵巢癌患者中AKT1的表达缺失与低总生存率、低疾病特different medicinal parts异性生存率及更短的无进展间隔有关。这些结果说明,AKT1的丢失是卵巢癌的不良预后因素。(3)AKT1缺失上调顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平在SKOV3-Res和A2780-Res细胞中转导外源性AKT1时,p ULK1降低,LC3b表达增加,表明顺铂耐药细胞通过下调AKT1维持自噬。恢复AKT1表达后耐药卵巢癌细胞中FTH1的表达被挽救。在顺铂耐药的卵巢癌细胞中恢复AKT1表达后,Erastin诱导的细胞铁死亡减少。表明AKT1的丢失可能是顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡诱导剂高度敏感的原因,这是由p-ULK介导的FTH1自噬降解引起的。结论:1.AKT1的缺失导致顺铂耐药卵巢癌细胞维持高自噬水平;2.AKT1缺失介导的FTH1自噬降解导致顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感;3.靶向铁死亡可能是逆转卵巢癌顺铂耐药的潜在途径。
为提升IPTR患者血小板输注后CCI值建立分级规避HLA抗体对应抗原方法及HLAMatchmaker的应用研究
目的:建立分级规避HLA抗体MFI阈值对应抗原方法，联合应用HLAMatchmaker表位计算法，选择供患者表位最小错配评分值，评估两种方C59法为免疫性血小板输注无效(Immune platelet transfusion rMDV3100化学结构efractoriness, IPTR)患者选择HLA相容性血小板供者，在提升血小板输注后校正增加值(CCI)的应用价值。方法:采用SPRCA法完成51例IPTR患者的7 807次血小板交叉配型实验，判断其免疫反应阴/阳性结果。采用Luminex单抗原流式微珠法检测患者的HLA-I类抗体，获得不同特异性抗体对应HLA-I类抗原MFI值，并将其分组及分级，强阳性组(MFI>4 000,1级)、中阳性组(1 000