Achr receptor

目的:为了充分利用三文鱼皮资源,制备性能优良、生物相容性良好的可降解胶原膜材料,为后期开发医疗器械产品做准备,探究三文鱼胶原膜(Salmon Collagen Membrane,SCM)在骨组织修复的效果。方法:首先,以三文鱼皮为原料,通过不同浓度的Na OH和H_2O_2溶液在不同时间处理三文鱼皮,选择最佳预处理条件,达到脱色、脱杂蛋白的目的;并通过对体外降解率、机械性能、变性温度、交联度以及微观结构的检测,比较戊二醛、京尼平以及碳化二亚胺(EDC)三种交联剂对SCM的影响,最终确立SCM的最佳工艺条件。其次对最终制备得到的SCM的理化性能进行研究,验证其是否满足医疗器械的基本要求,主要包括缝合线撕裂力、酸碱度、水分、总蛋白、羟脯氨酸、脂肪、灰分、重金属以及外源性DNA残留。最后根据《GB/T 1Cobimetinib半抑制浓度6886生物学评价试验》系列标准,通过细胞毒性试验、细胞增殖试验、细胞粘附试验、热原试验、溶血试验、小鼠全身急性毒性试验、局部植入试验、皮肤致敏实验、亚慢性全身毒性试验以及皮内反应试验验证SCM的生物安全性。并建立SD大鼠颅骨缺损的模型,通过显微X射线断层扫描观察大鼠的骨修复情况,计算大鼠颅骨愈合率,对SCM的有效性进行初步的研究。结果:通过对三文鱼皮的genetic privacy脱色脱杂工艺研究,确定最佳脱色脱杂方式是在0.1mol/L Na OH、4%H_2O_2条件下处理鱼皮6 h。不同组别的SCM检测结果表明10mmol/L EDC交联得到的SCM具有良好的体外降解率,机械性能、变性温度、交联度以及微观结构,基本符合要求。具体理化性质如下:缝合线撕裂力为3.33±0.4 N,酸碱度为7.39±0.03,水分含量为10.22±0.04%,总蛋白含量为90.69±0.02%,羟脯氨酸含量为8.90±0.98%,脂肪含量为0.96±0.PF-02341066临床试验60%,灰分为0.95±0.33%,重金属含量低,DNA残留量为38.96 ng/mg,结果表明SCM符合在医学中的行业标准。SCM的生物相容性的研究结果如下:细胞毒性试验表明SCM不存在细胞毒性;细胞增殖和细胞粘附试验表明MC-3T3E1小鼠前成骨细胞可在SCM上粘附与增殖。热原试验和溶血试验结果表明SCM不具有致热性和溶血性;急性全身毒性试验和亚慢性全身毒性试验表明SCM不具有急性全身毒性和亚慢性全身毒性。局部植入试验、皮内反应试验以及致敏试验同样表明SCM具有良好的了生物相容性和安全性,基本满足修复材料的需求。大鼠颅骨修复试验研究结果初步发现试验组与阴性对照组、阳性对照组相比有较好的骨修复现象,说明以三文鱼皮为原料所制备的可降解胶原膜具有优益的骨修复作用。

目的:晶体在肾小管上皮细胞的黏附聚集是肾结石形成的重要步骤,细胞损伤和晶体聚集可能是影响晶体在细胞表面黏附沉积的关键。SIRT3在清除组织活性氧和减弱氧化应激损伤中起重要作用,调节细胞坏死性凋亡可能是SIRT3发挥作用的重要途径,而聚乙二醇具有分散剂的特性以及修复细胞的作用,对晶体聚集可能有抑制作用。因此本课题拟探究SIRT3调节坏死性凋亡在草酸钙肾结石形成中的作用及探索聚乙二醇对晶体黏附聚集的干预研究。方法:第一部分采用SIRT3过表达、SIRT3敲除及野生型C57BL/6雄性小鼠,通过乙醛酸bioartificial organs腹腔注射构建小鼠草酸钙肾结晶模型,肾脏标本HE染色,SIRT3免疫组化,Von Kossa染色以及蛋白免疫电泳检测SIRT3、p-MLKL表达水平。第二部分以小鼠肾小管上皮细胞TCMK-1为研究对象,构建一水草酸钙刺激细胞为模型组,预使用RIPK3抑制剂GSK872后加入一水草酸钙刺激作为抑制剂组,以及加入等量PBS的对照组。观察表面晶体黏附情况,检测细胞活力、细胞毒性、氧化应激水平,以及蛋白质免疫印迹检测RIPK1,RIPK3,p-MLKL表达水平。第三部分以活性氧刺激剂、PEG4000及一水草酸钙多种组合CB-839临床试验刺激TCMK-1,检测细胞活力、细胞毒性及活性氧水平,观测细胞状态及晶体黏附情况。结果:(1)小鼠肾草酸钙晶体沉积诱发肾小管上皮细胞坏死性凋亡明显增加,SIRT3过表达可以调节坏死性凋亡,减轻晶体性肾损伤,并减少肾脏晶体沉积。(2)体外研究表明,当一水草酸钙晶体浓度在低水平(6cm培养皿400ug/ml以下)时,抑制细胞坏死性凋亡可以一定程度地减轻细胞损伤并减少细胞表面晶体黏附沉积。当一水草酸钙晶体浓度超过800ug/ml时,细胞表面晶体聚集形成不定型沉淀,减轻细胞坏死性凋亡细胞损伤不能减少晶体黏附沉积总量。(3)预使用聚合物PEG4000能够使悬液体系中晶体颗粒保持悬浮稳定状态,并能够减轻细胞氧化应激损伤,显著减少细胞表面晶体黏附沉积。结论:肾脏草酸钙晶体沉积涉及RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡,SIRT3通过调节坏死性凋亡能够减轻晶体性肾损伤。体外研究表明减轻肾小管上皮细胞坏死性凋亡可以一定程度减少晶体黏附,但较高的晶体负荷可在细胞表面黏附聚集形成不定型沉淀,LY-188011半抑制浓度预使用聚合物PEG4000能够保持晶体颗粒悬浮稳定,减轻细胞氧化应激损伤,减少细胞晶体黏附。

L-抗坏血酸(L-Ascorbic Acid,L-AA)又被称作维生素C(Vitamin C,VC),是一种人体自身无法合成的营养元素,具有高抗氧化性,在人体的生长发育以及各种生理活动中都有着及其重要的作用。由于VC本身的结构极不稳定KD025配制,在一些光、热以及金属离子环境中极易分解,这极大地限制了VC的应用范围。为了增强VC的稳定性,合成了一些VC的衍生物,在这些衍生物中,2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)由于具有较高的稳定性,并且可被人体内α-葡萄糖苷酶重新分解成L-抗坏血酸与葡萄糖,进而发挥出L-抗坏血酸的生理作用,故被认为是L-抗坏血酸的极佳替代品,在食品、医疗、饲料以及化妆品等行业都有着广泛的应用。目前AA-2G主要通过生物法合成,常用的催化酶为环糊精葡萄糖基转移酶简称(CGTase,EC 2.4.1.19),CGTase不仅具有较强的产物特异性而且也具有较高的AA-2G产量,故在目前能催化合成AA-2G的酶中属于应用最广并且研究最多的一种酶。研究发现以环糊精为底物时,CGTase制备AA-2G的产量较高,但是环糊精的成本较高不利于工业化生产,以价格低廉并且易溶于水的麦芽糊精制备AA-2G可以大大降低成本。由于CGTase对麦芽糊精的亲和力较低,故制备AA-2G的产量也较低,可通过对CGTase进行分子改造以提高其对麦芽糊精的亲和力,从而降低成本与更高效地制备AA-2G。本论文以实验室先前构建的编码环糊精葡萄糖基转移酶my20的基因工程菌为研究对象,通过饱和突变对其进行定向改造,提高了其以麦芽糊精和L-AA为底物制备AA-2G的转化率,主要研究内容如下:以实验室先前保藏的重组质粒p ET24a/my20为模板,通过三维结构模拟与序列比对分析确定了突变位点Y260与A236,随后对其进行饱和突变,将表达后的突变体发酵制取粗酶液,并通过镍柱亲和层析的方法进行纯化。以麦芽糊精与L-抗坏血酸为底物制备AA-2G,最终筛选出了两株AA-2G产量提高的菌株:Y260F与A236P,随后又构建了双突变体Y260F/A236P。对MY20以及Y260F/A236P的酶学性质进行测定,MY20的最适反应温度为80℃,Y260F/A236P则在60℃有最大活性,两者的最适反应pH均为7。野生型以及突变体均有良好的热稳定性与pH稳定性,在20℃-80℃的条件下放置2 h后,MY20与Y260F/A236P均能保持90%以上的活性,pH 4-10范围内4℃保温12 h,MY20与Y260F/A236P的环化活力仍能保持在80%以上。Ca~(2+)可以增强MY20与Y260F/A236P的环化活性,而Cu~(2+)则会抑制两者的活性。对野生型以及突变体制备AA-2G的反应温度、pH、酶浓度、底物配比以及反应时间进行优化,MY20、Y260F以及Y260F/A236P的最适反应温度为30℃,A236P的最适温度为40℃,与野生型相比,A236selleck化学P具有更高的反应温度,这可能有助于底物的溶解。MY20以及突变的最适反应pH都为4,最适加酶量都为120 U/g麦芽糊精,最适底物配比为麦芽糊精/L-抗坏血酸=1/3,都在反应24 h获得最大产量。双突变体Y260F/A236P在最优条件下合成AA-2G的产量为30.19 g/L,比野生型CGTase提高了11.85%。对野生型以及突变体进行动力学研究,发现突变体Y260F、A236P、Y260F/A236P的L-抗坏血酸K_m值分别比野生型降低了15.02%、9.36%、28.56%,K_(cat)/K_m分别比野生型提高了43.66%、30.51%、85.91%。结果表明,这些突变体对L-AA的亲和性和催化效率都有所提高。最后,通过同源建模以及分子对接对实验结果进行机理分析。以可溶性淀粉为底物探究MY20与Y260F/A236P的底物特异性,并对底物浓度、加酶量以及反应时间进行优化,最终在加酶量5 U/g淀粉、5%底物浓度下反应24 h后,MY20与Y260F/A236P制备medical-legal issues in pain management环糊精的转化率均达到最高,分别为49.78%与47.46%。结果表明,突变体Y260F/A236P相对于MY20不仅合成AA-2G的产量有所提高,也具有较好的温度稳定性与pH稳定性,在工业化生产中具有较大优势。

革兰氏阴性细菌外膜上除Medicine traditional了磷脂质(Phospholipid)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)外,还有蛋白质整合或镶嵌其中,该蛋白称为外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)。近年来,病原菌OMPs-动物宿主细胞互作的研究越来越多,表明OMPs在介导病原菌入侵宿主的过程中发挥重要作用。但是根瘤菌OMPs在共生固氮中的功能与作用机制的研究目前罕有报道。本实验室前期首次报道了华癸中慢生根瘤菌7653R(Mesorhizobium huakuii 7653R)中一个新的外膜蛋白基因Mhopa22,并通过酵母双杂交系统筛选到与MhOpa22互作的豆科植物受体蛋白As GLP1。基于此,本研究开展了外膜蛋白MhOpa22及关键Loop结构在共生固氮中的功能和作用途径研究,研究结果如下:其一,通过构建MhOpa22不同Loop结构域的截短片段,利用酵母双杂交和Bi FC技术鉴定到MhOpa22与As GLP1互作的关键Loop结构域是Loop-2-3。其二,通过在ΔMhopa22中表达不同Loops缺失的Mhopa22及共生盆栽实验,发现Loop2结构域缺失会显著影响根瘤菌与紫云英的共生及结瘤,根瘤内含菌细胞明显减少,类菌体形JNJ-42756493核磁态异常,该结果与酵母双杂交及Bi FC结果相符,进一步证实了MhOpa22中的关键Loop结构域是Loop2。通过施加无机氮源的植物盆栽实验,证实了Loop2结构域缺失导致的共生缺陷表型由缺氮引起。水培条件下利用合成的多肽体外处理显示Loop2多肽可在一定程度上外源回补Loop2结构域缺失对共生的影响。其三,转录组分析表明,Loop2结构域缺失导致宿主植物中与早期共生结瘤相关的基因下调表达,防御抗病相关的基因部分上调表达、部分下调表达,并且鉴定到影响早期共生的三个关键基因:结瘤因子水解酶基因、查尔酮合成酶基因、查尔酮异构酶基因均显著下调表达,说明MhOpa22的Loop2结构域缺失影响了宿主植物早期共生及防御基因的表达。其四,提CL 318952分子式取的M.huakuii 7653R膜蛋白与MhOpa22抗体做Western Blot杂交,结果表明MhOpa22是根瘤菌膜蛋白。通过M.huakuii 7653R外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)蛋白组测定,鉴定到MhOpa22存在于OMVs中,表明MhOpa22可能通过OMVs分泌与紫云英受体蛋白As GLP1互作,影响根瘤菌的早期侵染和结瘤。本研究揭示了外膜蛋白MhOpa22在共生固氮中的重要功能和作用途径,并鉴定到Loop2是关键结构域。为后续深入研究根瘤菌OMPs在菌植互作中的具体功能机制提供了新思路和新见解。

本实验室前期获得了zmstk1突变体材料,研究发现突变体的花粉活力下降并且淀粉积累减少且花粉中的类受体蛋白激酶ZmSTK1和烯醇化酶ZmENO1互作。ZmSTK1与ZmENO1的相互作用是否影响烯醇化酶的活力,并且调控烯醇化酶的机制尚不明确,需要进一步研究。本实验通过双分子荧光互补,不同时期野生型和突变体烯醇化酶含量活力的测定,生物信息学分析以及能量代谢组分析来研究ZmSTK1对烯醇化酶的调节posttransplant infection机制。研究结果如下:(1)通过同源重组的方式构建了ZmSTK1和ZmENO1的BiFC载体,在水稻原生质体中进行双分子荧光互补实验,结果表明,在活细胞体内的条件下玉米特异性类受体蛋白激酶ZmSTK1和烯醇化酶ZmENO1可以互作。(2)测定了不同时期野生型和突变体的烯醇化酶的含量、活力和磷酸烯醇式丙酮酸的含量。结果表明,野生型和突变体花粉的烯醇化酶在含量上没有差别,从S11时期开始,突变体的烯醇化酶的正向反Colforsin MW应的酶活力和磷酸烯醇式丙酮酸含量开始明显高于野生型。(3)利用生物信息学对ZmSTK1和ZmENO1进行了结构分析和催化关键位点预测,结果表明ZmSTK1对ZmENO1磷酸化的关键位点是S156,推测在此位点进行磷酸化修饰影响了ZmENO1与2-磷酸甘油酸的结合,从而影响了其催化正向反应的活力。同时,构建了ZmSTK1的原核表达载体,进行大肠杆菌BL21原核表达菌株的构建,为体外磷酸化验证奠定了基础。(4)对野生型和突变体花粉进行了能量代谢组分析。结果表明,野生型和突变体的能量代谢物有明显差异,共分析出8种差异代谢物,其中突变体相比于野生型上调5种,下调3种,并且差异代谢物主要集中在与中间代谢物丙酮酸有关的氨基酸代谢通路中。综上所述,类受体蛋白激酶ZmSTK1和烯醇化酶ZmENO1在植物细胞内互作,烯醇化酶活力受到类受体蛋白激酶ZmSTK1的调节,ZmSTK1在ZmENO1的S156位点添加磷酸基团,占据酶的活性中心,烯醇化酶催化正向反应的活力减低。在突selleck NMR变体zmstk1中,ZmSTK1的缺失导致ZmENO1的正向反应活力升高,大量葡萄糖通过糖酵解途径消耗,最终使得突变体花粉中的淀粉积累减少,花粉育性降低。

氮在农业生产中发挥着重要作用,适时、适量的施氮可促进作物生长发育、提高产量、改善品质。为探究日光温室番茄不同生育期的适宜施氮量,本试验分别在番茄开花坐果期、果实膨大期、果实成熟期设置五个施氮量。开花坐果期设置施氮量处理为0kg/667 m~2(AT1)、0.9 kg/667 m~2(AT2)、1.8 kg/667 m~2(AT3)、2.7 kg/667 m~2(AT4)、3.6 kg/667 m~2(AT5);果实膨大期设置施氮量处理为0 kg/667 m~2(BT1)、4 kg/667 m~2(BT2)、8 kg/667 m~2(BT3)、12 anti-hepatitis Bkg/667 m~2(BT4)、16 kg/667 m~2(BT5);果实成熟期设置施氮量处理为0 kg/667 m~2(CT1)、4 kg/667 m~2(CT2)、8 kg/667 m~2(CT3)、12 kg/667 m~2(CT4)、16 kg/667 m~2(CT5)。通过研究氮肥不同用量对番茄不同生育期产量、品质、光合特性、根系活性、养分吸收及土壤酶活性等方面的影响,以期为设施番茄科学施肥提供理论依据。主要研究结果如下:1.设施番茄不同生育期生长发育所需适宜施氮量不同。在开花坐果期,施氮GNE-140量2.7kg/667 m~2(AT4)处理下,植株的茎粗高于其他处理并且存在显著差异,叶片光合色素含量、净光合速率以及叶片硝酸还原酶活性在施氮量2.7 kg/667 m~2(AT4)处理下达到最高水平,根系生长量、根系活力、植株的总干鲜重、植株不同器官养分含量也均在施氮量2.7 kg/667 m~2(AT4)处理下最高。在果实膨大期和果实成熟期,施氮量均为12 kg/667m~2(BT4、CT4)处理下,番茄叶片光合色素含量、净光合速率、叶片硝酸还原酶活性最高,根系生长量最大,根系活力最旺盛,植株的总干鲜重最重,植株不同器官养分含量最高。2.设施番茄不同生育期内不同施氮量处理对最终产量和品质影响不同。在开花坐果期,施氮量2.7 kg/667 m~2(AT4)处理下,全生育期最终产量最高,果实可溶性固形物、可溶性糖、维生素C、番茄红素、可溶性蛋白含量最高,有机酸最低。在果实膨大期和果实成熟期,施氮量均为12 kg/667 m~2(BT4、CT4)处理下,全生育期最终产量最高,果实可溶性固形物、可溶性糖、维生素C、番茄红素、可溶性蛋白含量最高,有机酸最低。3.不同施氮量处理对设施番LY294002茄不同生育期土壤理化性质有显著影响,适宜施氮量能够提高土壤养分、土壤酶活性。在开花坐果期,施氮量2.7 kg/667 m~2(AT4)土壤养分、土壤酶活性最高。在果实膨大期和果实成熟期,施氮量均为12 kg/667 m~2(BT4、CT4)处理下,土壤养分、土壤酶活性最高。

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分,由3条链缠绕构成三螺旋.在28种天然胶原中占比最大的是Ⅰ型胶原蛋白,它是由两条a1链与一条a2链构成的异三聚体, a1或a2链中甘氨酸单点突变会导致成骨不全症.基于更接近天然胶原的异三聚体模型(abc), 3条链中分别引入Gly→Ala,构建7种突变体.差示扫描Forensic genetics量热结果表明,单点突变体RAD001核磁的熔融温度(T_m)值降低15℃,双点及三点突变体未形成三螺旋结构.利用梯阶模型分析分子动力学模拟轨迹,突变点附近梯阶参数值发生变化,表明三螺旋结构局部解折叠.引入弹性函数量Nirmatrelvir采购化胶原结构变化程度,发现氢键能量与结构形变分数具有高关联性(R~2=0.76),表明突变不仅破坏了氢键作用力,也导致了分子的弯曲与运动状态的变化.结合计算与实验,解析了甘氨酸突变对胶原整体结构与运动模式的影响,为进一步揭示甘氨酸突变的致病机理提供了理论基础.

染色质是基因组的组织形式,在基因表达和调控中发挥着重要作用。通过对染色质结构单元的研究,深入了解基因组的组成和作用机制,进而为研究基因的表达和GDC-0973核磁调控机制奠定基础。染色质结构异常与多种疾病发生密切相关,例如染色体易位、缺失和扩增等。通过染色质结构单元研究可以揭示疾病的发生机制和进展过程,为疾病的预防和治疗提供新的方法和思路。利用生物信息学知识的计算方法可以通过处理海量的染色质序列数据,同时对多个数据进行分析和检测,通过不断优化算法和模型,提高检测的准确度和精度,快速高效地检测拓扑结构域的边界,同时还可以通过解析模型的检测结果和特征,为深入理解生命活动和基因调控提供新的视角和方法。鉴于此,针对现有染色质拓扑结构检测研究中编码方案相对单一、模型精度不高的问题,本文以果蝇DNA序列数据为研究对象,全面研究了不同的序列特征编码方案,构建集成学习模型以检测染色质拓扑结构域,以促进相关领域的发展。主要研究内容如下:(1)为构建优质高效集成模型,本研究首先甄选数据特征编码方案,全面对比了K-mer、不匹配k-元组、核苷酸对谱编码等七种特征编码方案性能的优劣。通过对数据进行标准化预处理,选取实验中需要使用的不同特征编码方案,对DNA序列数据进行特征提取,利用不同编码方案的组合对特征重要性进行对比分析,最终通过结果可视化分析,确定最优化的编码方案。结果表明基于K-mer特征编码在果蝇拓扑结构域边界检测中表现出良好的性能。(2)为基于染色质三维结构特性和集成学习方法研究拓扑结构域边界检测算法,本研究设计并建立了一个集成学习方案—Stack TADB。该框架整合了四种基础分类器,包括随机森林、逻辑回归、K近邻和支持向量机,通过堆叠集成方法,结合K-mer特征编码,基于自助采样的方式生成多个训练集,每个训练集用于训练一个基分类器,最终将多个基分类器的结果进行聚合以得到集成模型的检测结果。通过对先前研究创建的one-hot编码DNA序列数据集进行测试和分析,结果表明Stack TADB在AUC、准确率、马修斯相关系数、精确度、召回率和F1值等六个指标上具有最优性能,比表现最佳的传统特征模型分别提高了1.4%、6.5%、13.9%、6.4%、6.5%和6.5%,比表现最佳的深度学习模型分别提高了3.6%、10.MRTX1133体外3%、23.0%、10.2%、10.3%和10.3%。为增强模型理解,提高可信度,本研究利用SHAP(SHapley Additive ex Planations)框架解释了Stack TADB的检测结果,并确定了与BEAF-32基序匹配的子序列在检测拓扑结构域边界中起着至关重要的作用,为促进染色质拓扑结构域的下游分析提供了有效的检测工具。(3)为促进拓扑结构域在相关生物医学研究领域中的应用,本研究采用Django后端框架和Lay UI前端框架研发了拓扑结构域检测分析系统,该系统主要功能为基于DNA序列数据和Stack TADB模型的染色质拓扑结构域检测,为用户提供简单、高效thylakoid biogenesis、灵活的交互界面。以上研究模型为生物学家提供了高效鲁棒的染色质拓扑结构域检测工具,为生物信息学家提供了染色质结构单元和调控元件检测的模型和方法,有利于促进染色质拓扑结构域的下游分析,推动三维基因组结构研究的进一步发展。

免疫系统的功能依赖能量供给,能量缺乏会严重影响免疫细胞的生命活动。鱼类时常通过减少甚至停止摄食的行为响应病原侵染,这种能量限制条件下免疫系统的响应机制尚不明确。最近的进展强调了短暂禁食在优化人类和小鼠免疫力方面的关键作用。然而,这种策略是哺乳动物在进化过程中独立获得的,还是代表了脊椎动物共同的逐渐进化的功能,仍然是未知数。T细胞是脊椎动物免疫防御的重要武器,在抗感染、细胞记忆、协助B细胞产生抗体等过程中发挥关键作用。T细胞免疫受到诸多因素的精密调控,其中代谢程序对T细胞的生物学过程、命运决定和免疫功能至关重要。本研究以尼罗罗非鱼为对象,探究了禁食对鱼类T细胞的调控机制,对于了解鱼类T细胞代谢免疫,探讨T细胞免疫的演化具有重要意义。通过分析喂食、禁食3天和7天的罗非鱼脾脏白细胞的转录组,我们发现T细胞可能是免疫系统对禁食反应的主要执行者。进一步的研究表明7天的长期禁食显著诱导了脾脏白细胞或T细胞中促炎性细胞因子IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6和细胞毒性基因Perforin A、Granzyme B的转录表达,及T细胞的凋亡,导致T细胞比例的显著降低和绝对数量的严重缺失,从而损害了罗非鱼的T细胞稳态;而为期3天的短期禁食对罗非鱼脾脏T细胞的炎症反应、凋亡和稳Tofacitinib研究购买态无显著影响。值得注意的是,禁食7天同样导致了脾脏和头肾中Ig M~+B细胞和CD3~-Ig M~-淋巴细胞绝对数量的减少,但减少的幅度均低于T细胞,且头肾CD3~+T细胞的比例受到的影响较脾脏低,说明脾脏T细胞更容易受到营养匮乏的影响。短期禁食导致T细胞体积增加和CD3蛋白表达量的上调,CD3ε、CD8、CD4-1的m RNA水平也被显著诱导,说明短期禁食增强了T细胞的活化程度。此外,使用T细胞丝裂原PHA刺激脾脏白细胞,相较于喂食组,短期禁食的罗非鱼表达更高的IL-2及其受体CD122;白细胞或T细胞中AKT、NF-κB或ERK1/2磷酸化水平均明显增强,证实了短期禁食能够增强罗非鱼T细胞的激活能力。短期禁食罗非鱼的脾脏白细胞或T细胞中自噬相关基因的m RNA表达上调,ULK1磷酸化增强,Beclin-1、LC3B蛋白表达和P62蛋白降解增加;同时在白细胞或CD3~+T细胞中观察到LC3蛋白表达和自噬溶酶体着色更强,表明短期禁食诱导罗非鱼T细胞自噬。阻断短期禁食罗非鱼的自噬,明显增加了T细胞凋亡;损害了PHA刺激引发的NF-κB、AKT、S6的磷酸化,和T细胞激活标志基因CD122、IFN-γm RNA的上调表达,表明短期饮食限制通过启动适度的自噬作用促进罗非鱼的T细胞免疫力。在嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染过程中抑制自噬,脾脏淋巴细胞中T细胞比例和绝对数量的显著降低,Brd U掺入减少,表明阻断自噬严重损害了病原体诱导的T细胞增殖。同时,自噬的抑制损害了病原诱导的促炎性细胞因子和细胞毒性基因的转录表达,导致罗非鱼个体死亡率显著增加,说明自噬对于罗非鱼T细胞发挥正常的免疫功能至关重要。此外,我们发现禁食或二甲双胍处理,显著降低了罗非鱼血糖水平,导致LKB1/AMPK通路的磷酸化激活。与抑制自噬结果相似,体外或感染过程中体内阻断AMPK,严重损害了罗非鱼T细胞的激活和病原菌诱导的T细胞增殖,下调了促炎性细胞因子和细胞毒性基因的表达,并加剧了T细胞的凋亡,表明罗非鱼需要AMPK活性维持T细胞的激活、增殖、存活和功能。能量限制下,AMPK信号的阻断抑制了T细胞自噬溶酶体活性的增加,损害了ULK1的磷酸化,并上调了P62蛋白水平,表明AMPK调控罗非鱼T细胞自噬。因此,这些结果表明,AMPK是连接罗非鱼禁食和自噬控制的核心枢纽,短期的能量限制可通过AMPK依赖性自噬促进罗非鱼T细胞免疫。病原菌感染后,白细胞中自噬标志蛋白的表达及溶酶体活性显示自噬水平增加,结合上述结果表明,禁食和病原菌感染都可以触发自噬。相较于喂食组,感染后的72小时内,短期禁食罗非鱼的白细胞或T细胞中自噬标志蛋白的表达和自噬溶酶体活性显示了强大的自噬反应已经启动;感染120小时后恢复正常水平,表明短期禁食能够提早触发AMPK依赖的T细胞自噬,并将自噬控制在可控范围内。这种在感染早期通过短期禁食而触发的自噬调控模式,能够拯救T细胞、降低机体炎症反应和组织损伤,对提高罗非鱼的抗感染免疫具有积极作用。我们的研究还发现短期禁食在促进AMPselleck合成K激活的同时上调了脂联素受体AdipoR1的表达。抗体封闭白细胞的AdipoR1,显著降低了禁食诱导的AMPKα的磷酸化激活,表明Fluimucil Antibiotic IT禁食可通过AdipoR1促进罗非鱼白细胞中AMPK的活化。使用激动剂体外激活白细胞的AdipoR1后,胞内Ca~(2+)浓度明显升高、Ca M和Ca MKKβ的蛋白及AMPKα的磷酸化明显增加,表明AdipoR1能够通过Ca~(2+)-Ca MKKβ信号促进罗非鱼AMPK的活化。进一步的研究发现,罗非鱼白细胞或T细胞中AdipoR1介导的Ca~(2+)-Ca MKKβ-AMPK信号通路参与病原菌感染引发的免疫反应;病原菌感染过程中,使用AdipoR1抗体或Ca MKKβ抑制剂阻断AdipoR1介导的Ca~(2+)-Ca MKKβ-AMPK信号,严重损害了淋巴细胞和T细胞的增殖,降低了促炎性细胞因子和细胞毒性基因的转录表达,并加剧了T细胞的凋亡,表明AdipoR1介导的Ca~(2+)-Ca MKKβ-AMPK信号在罗非鱼T细胞免疫应答中具有不可或缺的作用。因此,以上结果表明,短期禁食可能通过AdipoR1介导的AMPK信号促进T细胞免疫。有趣的是,罗非鱼基因组中缺失脂联素(adiponectin,ADPN),我们尝试探讨了罗非鱼T细胞中AdipoR1的激活机制。罗非鱼CTRP9重组蛋白的存在可以触发Ca~(2+)-Ca MKKβ-AMPK信号的激活,促进T细胞对葡萄糖的摄取及糖酵解关键蛋白的表达,并降低T细胞的凋亡;而抗体封闭AdipoR1,阻滞了补体1q肿瘤坏死因子相关蛋白9(C1q/TNF-related protein 9,CTRP9)对罗非鱼T细胞摄取葡萄糖及糖酵解的促进作用,说明CTRP9能够通过AdipoR1介导的胞内信号调控罗非鱼T细胞的代谢活动。这些研究表明,同为脂肪细胞因子的CTRP9可能作为替代物弥补罗非鱼ADPN的缺失。综上所述,我们阐明了AMPK相关信号通路调控罗非鱼T细胞免疫的机制,研究结果表明,通过限制饮食来优化免疫力是脊椎动物进化中的一种古老策略,为理解T细胞反应的适应性进化提供了新的视角。

背景:黄曲霉及其代谢产物是严重威胁食品及饲料安全,危害人畜生命健康的污染物。生防菌和抑菌蛋白的筛选鉴定为安全有效的抑制黄曲霉污染提供了新方法。解淀粉芽孢杆菌是一种极具发展前景的真菌拮抗菌,其代谢产物被确定含有多种抗菌活性物质,能对黄曲霉正常生命活动产生显著影响。本试验室在之前的研究中得到一株解淀粉芽孢杆菌B10,且已证实其无菌发酵上清液对黄曲霉有明显抑制活性。目的意义:分离纯化并确定解淀粉芽孢杆菌B10中具体抗黄曲霉活性成分,明确其生化特性及抑菌作用方式。为采用生物防控技术防控饲料中黄曲霉污染提供了新的思路和理论依据,为进一步防治真菌毒素中毒病及临床生产应用奠定基础。方法:以解淀粉芽孢杆菌B10为研究对象,用硫酸铵梯度沉淀其无菌发酵上清液中的蛋白成分,并通过DNon-HIV-immunocompromised patientsEAE阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱对蛋白粗提液进行分离纯化。将最优抑菌组分进行蛋白质质谱鉴定,初步筛选分析出可能具有黄曲霉抑制效果的活性蛋白。之后设计引物从B10中扩增活性蛋白基因,构建pET-28a重组载体并通过Trans5α及BL21感受态细胞进行目的蛋白克隆表达。通过Prot Param工具、SDS-PAGE及灰度值分析等操作,对目的蛋白进行生物信息学分析、最适诱导表达条件探索及表达形式的鉴定。再对目的蛋白进行亲和层析纯化,并通过平板抑菌试验检验其抑菌活性。梯度稀释法得到活性蛋白最小抑菌浓度(MIC)后通过监测吸光度变化情况探究不同温度、p H、紫外照射时长、金属离子及有机溶剂对活性蛋白抑菌率的影响。最后收集经活性蛋白处理的黄曲霉,通过扫描及透射电镜观察、细胞膜通透性及线粒体膜电位变化、ROS水平及CAT、SOD活性检测探究二者黄曲霉抑制方式。结果:1.80%浓度硫酸铵制备的蛋白粗提液具有最佳抑菌效果,在纯化后的最优抑菌组分中初步鉴定出多种可能抑制黄曲霉的活性蛋白。2.扩增到6种目的蛋白基因并成功进行了克隆表达。B10-SP及B10-CWH的最佳诱导条件为37℃5h;B10-Xyl为30℃8h;B10-LCI为16℃16h;B10-CBP及B10-Glu为25℃12h。并且各目的蛋白的表观分子量与预测分子量均较为接近。其中仅B10-LCI及B10Fulvestrant供应商-Glu以可溶性蛋白形式表达,且具有对黄曲霉的抑制活性。抑菌圈半径分别为1.14 cm及1.17 cm,相较于未纯化组及B10粗提蛋白组具有更加清晰明显的抑菌效果。3.B10-Glu和B10-LCI MIC值分别为0.94μg/m L及0.96μg/m L。B10-Glu在37℃、p H=7.0、K~+及EDTA存在条件下抑菌效果最佳;B10-LCI在45℃、p H=9.0及EDTA处理下抑制效果最好。且二者在紫外照射30 min后仍具有较高的抑菌活性。此外B10-Glu及B10-LCI均能破坏黄曲霉菌丝形态,抑制菌丝生长及孢子形成,并使黄曲霉细胞壁膜结构发生明显改变,导致细胞质壁分离、细胞内容物流失,线粒体结构损伤、功能紊乱,促进ROS积累,降低抗氧化水平。结论:从解淀粉芽孢杆菌B10中纯化、鉴定并克隆表达出两种抗黄曲霉活性物质,1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(B10-Glu)及抗菌肽LCI(B10-LCI)。二者均能抑制黄曲霉菌丝生长及孢子形成,破坏黄曲霉细胞正常结构并影响其ROS及抗氧化水平。MIC分别为0.94μg/m L及0.96μg/m L。B10-Glu在37℃、p H=7.0、K~+及EDTA存在下表现出较高的抑菌活性,B10购买Puromycin-LCI则是在45℃、p H=9.0、EDTA存在时黄曲霉抑制活性最佳,且二者均对紫外线有较强耐受性。