Achr receptor

目的：探讨miR-217对急性髓系白血病细胞增殖及阿霉素敏感性的影响。方法：构建mimic NC和mi R-217 neurology (drugs and medicines)mimic载体转染至HL-60细胞中，q PCR检测转染效率。不同浓度的阿霉素处理细胞24和48 h,CCPD0325901使用方法K-8法检测阿霉素化学敏感性并筛选阿霉素的最佳处理浓度和时间。将细胞分为对照、mimic NC、mi R-217 mimic、阿霉素和mi R-217 mimic+阿霉素共5组，流式细胞术检测细胞凋亡，qPCR检测miR-217、PI3K和Akt3的表达，Western blot检测PI3K/Akt通路蛋白PI3K、Akt3和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达，双荧光素酶验证mi R-217和Akt3的关系。结果：mi R-217 mimic能够增强HL-60细胞对阿霉素的敏感性，阿霉素的最佳处理浓度和时间为160 ng/ml、48 h。与对照组相比，mi R-217 mimic组和阿霉素组细胞凋亡率、mi R-217和Bax蛋白水平显著升高（P<0.01），而Bcl-2蛋白和PI3K、Akt3 m RNA和蛋白水平显著降低（P<0.01）；与阿霉素组相比，mi R-217 mimic+阿霉素组细胞凋亡率、mi R-217和Bax蛋白水平显著升高（P<0.01）,Bcl-2蛋白和PI3K、Akt3 m RNBMN 673A和蛋白水平显著降低（P<0.01）。双荧光素酶实验表明mi R-217与Akt3之间存在靶向调控关系。结论：mi R-217靶向Akt3调控PI3K/Akt通路，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡并增强阿霉素对急性髓系白血病细胞的敏感性。

目的:评估多粘菌素B(POLB)联合N-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗α-鹅膏毒肽(α-AMA)所致肝损伤的疗效。方法:动物实验研究分别进行了短期研究(24h)和长期研究(14天)两项研究,短期研究:以昆明普通级雄性小鼠为研究对象,将40只小鼠随机化分为8组,n=5,分别为生理盐水(NS)组、POLB组、NAC组、POLB+NAC组、α-AMA组、α-AMA+POLB组、α-AMA+NAC组、α-AMA+POLB+NAC组,染毒及治疗的方式均为腹腔注射,利用α-AMA毒素以0.35mg/kg的剂量染毒小鼠,在染毒后4h、8h、12h后给予多粘菌素B(2.5mg/kg)和N-乙酰半胱氨酸(200mg/kg)selleck HPLC治疗,24小时后摘取小鼠眼球取血做生化检测(ALT、AST、BUN、Cr),解剖后取肝脏及肾脏计算其脏器系数及做肝脏组织病理学分析;长期研究:分组、染毒及治疗方案同短期研究,观察并记录14天各组小鼠的一般表现、存活情况、体重变化、食量变化。结果:短期实验研究:1、生化指标(ALT、AST、Cr、BUN)结果:α-AMA组小鼠ALT(99.4±10.46)U/L,NS组小鼠的ALT(99.6±22.01)U/L,两组小鼠ALT相近,统计学上无差异(P>0.05),α-AMA+POLB组小鼠的ALT(127.8±23.96)U/L,α-AMA+NAC组(292.2±171.15)U/L,α-AMA+POLB+NAC组(134.8±19.76)U/L,三组治疗组小鼠的ALT均高于染毒组,但无统计学差异(P>0.05),NS组的AST(191.8±39.97)U/L,α-AMA组小鼠AST(196.6±23.02)U/L,两组间的AST值无明显差异,不具有统计学意义,α-AMA+NAC组小鼠AST(373.6±89.39)U/L,α-AMA+POLB+NAC组小鼠AST(285.4±34.29)U/L,α-AMA+POLB组小鼠AST(298.4±80.39)U/L,三组治疗组小鼠AST均高于染毒组,但在统计学上无明显差异此网站。在BUN方面,NS组的BUN(9.94±0.67)U/L,α-AMA组小鼠的BUN(7.48±0.19)U/L,前者BUN高于后者,无统计学差异,α-AMA+NAC组小鼠BUN(8.26±0.89)U/L,α-AMA+POLB+NAC组小鼠BUN(8.26±0.62)U/L,α-AMA+POLB组小鼠BUN(9.44±1.79)U/L,三组治疗组小鼠的BUN均高于染毒组,但两两比较均无统计学意义。在Cr值方面,NS组的Cr(11.8±0.66)U/L,染毒组小鼠的Cr(10.6±0.51)U/L,前者Cr高于后者,无统计学差异,α-AMA+NAC组小鼠Cr(12±1.52)U/L,α-AMA+POLB+NAC组小鼠Cr(10.6±0.25)U/L,α-AMA+POLB组小鼠Cr(10.6±0.75)U/L,三组治疗组小鼠的Cr均高于染毒组,但两两比较均无统计学意义。2、小鼠肝脏、肾脏病理组织学结果:染毒24小时后NS组、POLB组、NAC组、POLB+NAC组、α-AMA组、α-AMA+NAC组、α-AMA+POLB+NAC组小鼠肝脏病理均无炎性浸润、出血、坏死表现,仅α-AMA+POLB组小鼠肝脏组织出现了炎症细胞灶性聚集,但无出血、坏死;各染毒组肾脏组织均无炎性浸润、出血、坏死表现。3、脏器系数:肝脏系数:NS组的肝脏系数(0.067±0.004)大于α-AMA组(0.065±0.004),但是无统计学差异,α-AMA组的肝脏系数(0.065±0.001)大于α-AMA+POLB组(0.054±0.004)、α-AMA+NAC组(0.059±0.006)、α-AMA+POLB+NAC组(0.058±0.005),α-AMA组的肝脏系数(0.065±0.004)与α-AMA+POLB(0.054±0.004)有统计学意义,α-AMA+NAC(0.059±0.006)和α-AMA+POLB+NAC(0.058±0Strongyloides hyperinfection.005)比较无统计学意义,α-AMA组小鼠与α-AMA+NAC和α-AMA+POLB+NAC组相比无明显差异;肾脏系数:NS组的肝脏系数(0.009±0.0003)小于α-AMA组(0.011±0.0002),比较有统计学意义,α-AMA+POLB组(0.012±0.004)、α-AMA+NAC组(0.012±0.001)大于α-AMA组(0.011±0.0002),比较无统计学意义,α-AMA+POLB+NAC组(0.011±0.001)小于α-AMA组(0.011±0.0002),无统计学意义;远期实验研究:1、小鼠的一般情况:非染毒组中的所有小鼠均未出现中毒表现及死亡情况,染毒组死亡的小鼠在染毒2天后出现食欲差、隔离、起毛、反应差、动作不协调、癫痫样抽搐、呻吟、昏迷等症状,染毒组存活的小鼠也出现不同程度的反应差、动作不协调、头部不自主转动的症状直至第14天。2、小鼠食量及体重变化:小鼠食量变化:染毒后1-4天,NS组小鼠平均食量呈现上升的趋势,染毒组及药物干预组整体呈下降趋势,4-14天染毒组及药物干预组小鼠平均食量变化趋势基本一致,且生理盐水组小鼠平均食量高于染毒组及药物治疗组,体重方面变化趋势基本与食量方面相似。3、动物的存活情况:α-AMA组死亡4只小鼠,α-AMA+POLB组死亡3只小鼠;α-AMA+NAC组死亡4只小鼠;α-AMA+POLB+NAC死亡4只小鼠,NS组、POLB组、NAC组、POLB+NAC组4组非染毒组死亡0只小鼠。结论:本实验不能证明多粘菌素B联合N-乙酰半胱氨酸治疗对α-鹅膏毒肽所致的肝损伤具有保护作用。

目的 通过动物实验了解Docetaxel NMR新型可吸收骨蜡的降解周期，并研究可吸收骨蜡与骨组织的生物相容性。方法 采用18只试验羊进行骨植入试验。每只羊的6节胸骨分别作为独立的植入位点，随机选择各2个位点分别使用实验品可吸收骨蜡（实验组）或对照品强生骨蜡（对照组）止血，剩余2个位点作为空白（空白组）。术后2、6、12周各随机处死6只试验羊，取胸骨进行HE切片，进行组织学评价和材料降解情况分析。采用20只小鼠分别通过尾静脉注射和腹腔注selleck产品射样品浸提液和对照观察小鼠的毒性症状。采用6只兔子通过皮内注射样品浸提液和对照观察各注射部位的红斑和水肿的组织反应。结果 实验组与空白组相比，实验品植入胸骨损伤表面2、6、12周，显示为无刺激；对照组与实验组相比，Epigenetic instability植入6、12周，显示为中度刺激。与对照品相比，实验品的组织学反应更加轻微。可吸收骨蜡降解过程中未见纤维组织包囊，新骨生长明显，至12周时，可吸收骨蜡基本降解完全，新骨连接两断端，骨损伤已得到修复。在急性毒性实验中，各组小鼠体重均稳步增长；在刺激试验中，可吸收骨蜡生理盐水的积分为0，玉米油的积分均为0.11。结论 新型可吸收骨蜡至植入12周时，已基本降解完全。该新型可吸收骨蜡是一种安全、无毒性、可用于骨创面止血的材料。

2020年从黑龙江Z-VAD-FMK体内实验剂量省某猪场的流产胎儿采集病料，经预处理此网站后，接种猪肾原代细胞，能产生明显的致细胞病变作用。经过血凝活性、病毒含量、荧光抗体检查、电镜观察、分子生物学等项测定，证明分离的病毒为猪细小病毒（PPV）。该病毒的HA效medieval London价≥1:256,TCID50≥107.0，呈PPV特异性荧光，电镜观察到呈六角形或圆形、无囊膜、直径20 nm左右的病毒粒子，可以被PPV特异性抗血清中和，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现一条445bp特异性电泳条带，并与7909株相符。对其进行了VP2基因克隆和测序，序列分析表明，VP2基因片段与其它PPV毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸同源性在98%以上。其与NADL-2株和China株的亲缘关系最近。毒株耐热，对胰蛋白酶有抵抗力，对乙醚、氯仿不敏感，p H3～9，病毒稳定，该毒株纯净，无外源病毒污染。本研究为该病疫苗的研发奠定了基础。

无机焦磷酸酶(PPase)是一种在镁离子存在下催化焦磷酸盐(PPi)水解成两个磷酸分子(Pi)的酶,该酶通过防止焦磷酸盐与镁沉淀提高体外转录(IVT)反应的速率,现已成为RNA制备的重要组成部分。m RNA疫苗制备及RNA的生化表征研究通常需要大规模生LGK-974临床试验产RNA,IVT反应需要消耗大量PPase。此外,PPase还广泛应用于PCR增强反应、工业糖生产和基因测序等实验与工业生产中。目前,对来源于大肠杆菌与酵母中PPase的应用研究较多,但对嗜热菌PPase催化结构域的研究报道较少。本文基于以上问题,采用定点突变手段改造嗜热菌PPase,以观察PPase催化结构域中多个氨基酸改变对酶学性质及其活性的影响,进一步表征和鉴定PPase催化结构域,同时完成了嗜热PPase的重组表达、中试发酵及纯化方案,主要研究内容如下:嗜热无机焦磷酸酶野生型的氨基酸序列来自NCBI蛋白数据库,同时我们设计了12个不同位点变化的突变体。经密码子优化后通过大肠杆菌表达系统进行重组表达,重组蛋白经过SDS-PAGE与Western Blot鉴定分子量约为21k Da。筛选得到重组酶最适表达条件为诱导温度25℃、IPTG浓度0.3m M、诱导时间8h。确立了5L发酵罐的中Adoptive T-cell immunotherapy试工艺,使用LB发酵培养基,全过程发酵12h即可得生物量积累63.93mg/m L。收获大批量菌体破碎,通过75℃加热30min去除表达宿主蛋白。对重组嗜热无机焦磷酸酶纯化本文提供两种纯化方案,一种以镍柱亲和层析、Capto Q阴离子交换层析、S100分子筛层析为主的柱层析方法,另一种为采用聚乙烯亚胺(PEI)沉淀后通过高盐溶液逐级洗脱得到蛋白。基于柱纯化和高分子聚合物PEI的纯化过程都取得较好的纯化效果,获得了纯度较高,核酸残留低的嗜热无机焦磷酸酶重组蛋白。嗜热无机焦磷酸酶的活性通过钼蓝比色法测定反应体系中游离Pi浓度间接测得。重组酶最适反应温度为75℃,最适p H为9,反应过程中的最适二价金属离子为Mg~(2+),Na F与MDP都会对酶活性产生抑制,且反应过程中高浓度的PPi与Mg~(2+)也会抑制酶的活性。重组嗜热无机焦磷酸酶具有极高热稳定性,在100℃孵育5h,仍能保持其最大催化活性的80%左右,且适宜浓度的Mg~(2+)与重组PPase共同热孵育,可进一步维持酶的热稳定性。测定重组酶水解PPi的动力学参数K_m值与V_(max)分别为1.008m M、1.793m M min~(-1)。将重组酶添加到PCR扩增体系中,可以明显解除过多PPi对PCR扩增造成的抑制作用,在IVT反应中添加重组嗜热无机焦磷酸酶可以提高产物量。无机焦磷酸酶的催化过程是由其活性中心的关键残基、二价金属离子、水分子协同作用的结果。对大肠杆菌PPase的研究发现,部分Asp残基通过金属配位连接四个Mg~(2+)离子,底物通过静电相互作用与Lys29、Lys142和Arg43结合,Asp67促进桥接水分子脱质子,由这些氨基酸组成了高度保守的金属催化笼。通过多序列对比、进化树分析、保守性分析及同源建模,确定了嗜热PPase的活性中心,与其他家族I型PPase相似,都由13-17个关键氨基酸组成,基于残基的电性与功能对K30、D43、R44、Y56、D66、D71、D103、Y140进行定点突变与组合突变,制备并表征了嗜热PPase的12个突变体,结合结构模拟发现,突变体Y56K、D71N、D103N由于空间距离的变化以及氢键的减少,降低了对底物或Mg~(2+)的亲和力,导致其催化活力完全丧失。K30R的变化使得催化产物的解离变得困难;D66作为M1与M2及PPi共同作用的残基,D66N降低了活性位点的总负电荷,降低了其与二价金属离子的结合能力;Y140K使得侧链与底物距离的增大而不易结合,最终K30R、D66N、Y140K分别保留野生酶活性的57%、11%、13%。D43N、D43E、R44K分别保留活性的96%、93%、97%,该位点残基的变化对酶活影响不大。对于多点突变的K30R D66N、Y56K D66N以及K30R Y56K D66N同样使得酶活完全丧失。测定各突变酶的米氏常数,多数突变酶的K_m值增大,突变导致酶对底物的亲和力减弱,转化数较野生型都有所降低,酶活力显著下降。本文通过对野生型PPase关键位点氨基酸改变而获得多个突变体理化性质及催化功能影响的研究,首次确定了Y56、D71、D103在酶催化结构域中的重要作用,为设计在不同条件下活性和稳定性增强的酶提供有力https://www.selleck.cn/products/Lapatinib-Ditosylate.html证据,本研究结果有助于理解PPase的酶学性质和结构与功能关系。

细菌耐药性的不断增加使得寻求新型抗生素替代品成为畜牧和生物医药领域急需解决的问题。抗菌肽能直接破坏细菌细胞膜或细胞壁,不易产生耐受性,因而备受关注,但是目前存在产量低的问题。枯草芽孢杆菌产生的subtilosinA对单增李斯特菌、牙龈卟啉单胞菌、志贺氏菌等致病菌有强烈抑制作用,并具有抗病毒和抗生物膜形成活性,在食品、医药、畜牧业等方面具有较大的应用潜力,然而其产量最高仅有42mg/L,极大地限制了其应用。本论文以枯草芽孢杆菌LF-11为研究对象,首先对其产生的抑菌物质进行鉴定并优化发酵条件提高产量,进一步研究了该抑菌物质的制备工艺,最后探究了该抑菌物质对产生菌自身的生理作用以及对肠上皮细胞的抗炎症作用,为该菌株及其抑菌物质的工业化生产及应用奠定了基础。取得的标志性结果如下:1、鉴定了B.subtilis LF-11产生的抑菌物质。通过蛋白酶K敏感性实验结合TRINCINE-SDS-PAGE分析,确定了该抑菌物质为多肽;利用酸沉法结合反相高效液相色谱分离制备了纯品,最后通过质谱分析结合基因组挖掘,将其鉴定为subtilosinA,并命名为 subtilosin A-1 1。2、优化了 subtilosin A-11的发酵生产条件。首先优化碳源并测定了B.subtilis LF-11产subtilosin A-11的发酵动力学曲线,确定了甘油能够通过提高生物量并延长指数生长期使得subtilosin A-11的产量显著提高;接着优化了酵母粉和蛋白胨的添加量,确定了最优培养基组成:20g/L甘油、10g/L酵母粉、5g/L蛋白胨和5g/L氯化钠;随后测定了初始pH和摇床转速的影响,确定了中性pH和较高的溶氧条件有利于subtilosin A-11的产生;最后在5L发酵罐进行了放大发酵实验,设置通气量为1 vvm,37℃培养36h时,subtilosin A-11的产量达到了 515.90±6.79 mg/L,是目前已报道的最高水平。3、建立了从发酵液MC3中高效制备subtilosin A-11的方法。通过测定不同pH下的沉淀收率以及subtilosin A-11在反相柱层析中的洗脱条件,确定了酸沉法结合反向柱层析梯度洗脱的分离策略,即调节发酵液的pH至3.0收集沉淀,确认细节此时subtilosin A-11的回收率能够达到94.11%,纯度为50.00%;然后进行反向柱层析,以30%的乙腈洗脱效果最佳;收集洗脱液冻干后,即得到subtilosin A-11纯品,收率可达到58.39%,纯度为95.55%。4、探究了 subtilosin A-11的细胞活性。鉴于B.subtilis LF-11遗传操作的限制,选育B.subtilis 168为研究对象,发现sbo-alb基因簇的敲除使芽孢生成显著下降;而补充subtilosinA-11后又可使得芽孢生成显著提高,揭示了 sbo-alb基因簇及产物subtilosin A-1 1对芽孢生成的促进作用,证明该细菌素的产生与芽孢形成密切相关。同时发现低浓度的subtilosin A-11能够显著下biostatic effect调沙门氏菌引起的炎症因子的转录水平,推测subtilosin A-11对肠细胞具有保护作用。

目的 分析黄斑中心凹旁渗出性血管异常复合体（PEVAC）的临床特点及多模影像学特点。设计回顾性病例系列。研究对象2011-2022年北京同仁医院PEVAC患者14例（14眼）。方法 回顾患者的病历资料。主要指标彩色眼底像、FFA及OCTA的影像学特点;OCTA中不同部位包括中心凹处、中心凹旁selleck合成、旁中心、2 mm直径范围的血流密度。结果 14例（14眼）中女性9例,平均年龄（63.21±6.69）岁。均为单眼发病。有糖尿病病史者2例,高血压病史者4例。彩色眼底照相可见7例红色点状病灶,9例黄白色硬性渗出,5例黄色点状病灶,1例伴有少许出血。FFA表现为拱环BI 10773周瘤样高荧光稍渗漏;高荧光病灶平均（1.47±0.74）个;其中18个病灶位于拱环颞侧,4个位于拱环鼻侧;瘤样高荧光距离拱环中心的平均距离为（690.68±168.68）μm。OCT上类圆形病灶分布在视网膜内层,未破坏外界膜进入视网膜外层。8例行OCTA检测者中1例浅层视网膜血管层内探及血流信号,7例深层视网膜血管层探及血流信号。浅层及深层视网膜黄斑区不同部位血管密度,患眼及健眼差异均无统计学意义（P均plant immune system>0.05）。结论 PEVAC发生于老年人,更常发生于旁中心凹区域拱环颞侧的视网膜内层,为单个或多个大动脉瘤样异常,常伴有渗出性改变,很少伴有出血,可在深层或浅层毛细血管层检测到异常血流信号。（眼科,2023,32:49-54）

目的：对比研究胶原蛋白、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和羟乙基纤维素(HEC)三者的Preclinical pathology理化性质及凝血效果，寻找适宜人体的止血材料。方法：采用冻干技术制备含有胶原蛋白、CMC-Na和HEC的3种不同海绵止血材料，测定海绵材料的pH值、电导率，对比不同材料在0.9%生理盐水中的溶解selleckchem 3-MA状态以及体外凝血时间。结果：在生理盐水温度为37℃下，3种海绵材料的pH值分别为SCH772984抑制剂(6.91±0.15)、(6.82±0.06)和(6.94±0.09)，均在中性范围内。胶原蛋白海绵和HEC海绵的电导率在37℃下，分别为(2.41±0.56)μS/cm和(3.74±0.14)μS/cm，显著低于CMC-Na海绵的(59.08±4.65)μS/cm，差异有统计学意义(t=18.655,t=15.328;P<0.05)。胶原蛋白海绵在0.9%生理盐水中浸泡40 min时，溶胀后仍能保持完整的结构，但CMC-Na海绵与HEC海绵在浸泡40 min时的结构均发生一定程度的溃散。胶原蛋白海绵凝血时间最快(149 s),HEC海绵与CMC-Na海绵凝血时间分别比其增加了62%和123%，其差异有统计学意义(t=5.376,t=9.180;P<0.05)。结论：胶原蛋白海绵作为止血材料在理化性质、凝血时间上更优于CMC-Na海绵和HEC海绵，可作为适宜人体的止血材料。

流域性氮、磷非点源污染是引起地表水污染和湖泊(水库)富营养化的重要原因,土壤内养分流失是造成水体富营养化的主要形式。不同土地利用类型与土壤土质类型会产生不同的氮磷流失特征。而土壤酶是催化土壤内氮、磷转化过程的重要参与者。目前对调控土壤酶活性干预土壤氮磷转化过程的探究较为贫瘠。本研究以柳林河流域为研究对象,明确流域水体主要氮、磷污染形式及土壤氮、磷含量和酶活性特征,判断流域土壤养分流失的主要形式,并进一步探究短期添加酶活抑制剂抑制土壤酶活性对降低柳林河不同土壤中无机氮、磷含量的效果。主要结论如下:1)通过为期一年的水质断面采集与氮、磷指标测定,判断柳林河水体内总氮浓度显著高于Ⅴ类水质限值,部分采样月内总磷、氨氮与硝态氮未达到Ⅰ类水质标准,其中硝态氮、总磷超标多集中在丰水期(2020年7、8月与2021年7、8、9月)。流域水体内主要为溶解态氮磷污染,水体内溶解态总氮、总磷占比分别为78.71～91.58%与74.43～94.47%。2)通过一年的土壤采样与测定,发现三种土地利用类型中,多数土质(除褐土性土外)下耕地土壤内转化为无机态氮反应活跃,总氮含量低于同土质下乔木、灌木林地。耕地土壤存在无机氮流失情况且已对水体产生影响。流域内所有土质下耕地土壤中有效磷含量显著高于同土质下乔木、灌木林地(P<0.05)。流域三种土地利用类型下,耕地土壤更易发生无机态氮磷流失。3)流域内所有土壤类型的相关性分析显示,有效磷含量与脲酶GSI-IX使用方法活性显著相关(P<0.05);硝态氮含量与硝酸还原酶(P<0.05)、亚硝酸还原酶(P<0.05)及中性磷酸酶活性(P<0.01)显著相关。通过抑制磷酸酶活性,理论上可以达到促进硝酸还原酶、亚硝酸还原酶活性,短期内减缓酶促催化硝化反应,降低硝态氮含量,同时抑制磷酸酶活性,减缓酶促催化磷矿化反应。降低硝态氮、有效磷流失入水体的概率,减缓流域内非点源氮磷污染,改善柳林河水质,为下一步干预酶活提供依据。4)通过短期土培实验,发现0.6kg·hm~(-2)草甘膦浓度添加在培养前7天对酸性粗骨土、褐土性土、褐土与淋溶褐土下土壤脲酶活性有显著抑制作用,可短期抑制脲酶催化转化铵态氮效果,降低土壤中铵态氮含量。草甘膦的施用对土壤亚硝酸还原酶干预效果不显著,亚硝酸还原酶并非影响土壤亚硝态氮含量的主要因素。0.6kg·hmmicromorphic media~(-2)、1.2kg·hm~(-2)草甘膦浓度下前21天对柳林河土壤内磷ATM/ATR抑制剂酸酶有明显的抑制作用,表明通过草甘膦对磷酸酶进行干预,缓解土壤磷素流失可行。

研究背景非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一个日益严重的健康问题,其患病率在发达国家和发展中国家不断上升,估计全球患病率为25%。NAFLD与肥胖等代谢综合征特征密切相关,其特征是在没有酒精过量摄入的情况下,肝细胞内的脂肪堆积。NAFLD开始于简单的脂肪变性,其中5%以上的肝细胞中存在甘油三酯(TG)的积聚,当NAFLD继续发展出现脂肪浸润并伴有炎症时,将导致更严重的NAFLD形式,即非酒精性脂肪性肝炎(NASH),可进一步发展为肝纤维化,最终发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。越来越多的证据表明,NAFLD不仅增加会肝脏相关并发症的发生,同时还会影响其他肝外疾病的发生,如心脑血管疾病,2型糖尿病,慢性肾病以及某些肝外恶性肿瘤(如结肠癌),因此NAFLD的防治已成为当今医学界所关注的热点问题。肥胖与代谢综合征及其合并症(如NAFLD)的发展有关,并增加了这些个Post-operative antibiotics体的死亡风险。有研究报道,肥胖已经成为一个独立的危险因素,使NAFLD的发病风险增加了 3.5倍。同时,全球NAFLD患者中肥胖的患病率为51.3%。肥胖可导致能量失衡,胰岛素敏感性下降和脂肪分解,并改变代谢功能,如胰岛素抵抗和血脂异常,这些都可能导致NAFLD的发生。因此肥胖会影响脂肪组织的代谢,而一旦过多的能量不能储存在脂肪组织内时,这一作用就会被其他器官所代替,肝脏就是其中之一。在这种情况下,来自肝脏的新生脂肪生成增加或皮下脂肪组织BYL719采购摄取减少的循环游离脂肪酸(FFA)可导致异位脂肪堆积和多器官胰岛素抵抗,这被认为是NAFLD发展的主要因素。肥胖导致肝细胞接触到的高水平脂类和碳水化合物可导致肝细胞损伤,进而导致氧化应激反应和线粒体功能障碍,进而引起NAFLD。因此NAFLD的实质是过多脂质沉积在肝脏进而导致肝脏一系列的病理生理变化。自噬是一种保守的细胞自我降解系统,自噬的目的不仅是降解不必要的物质,而且可以回收简单的成分,如氨基酸或单糖,然后可以重复利用,形成更复杂的大分子,从而在饥饿时期维持细胞内稳态和生存。雷帕霉素(mTOR)信号的营养感应机制在调节自噬活性以响应营养的变化方面发挥着关键作用。在NAFLD的背景下,自噬与脂质代谢、胰岛素抵抗、肝细胞损伤和炎症有关。自噬相关基因Atg 14的敲低会引起肝脏甘油三酯(TG)的积累。相反,腺病毒过表达Atg7或Atg14成功逆转了遗传性肥胖模型。总的来说,自噬水平在NAFLD中普遍减少。目前,尚无理想的针对NAFLD的防治药物,饮食习惯、生活方式的改善以及体重减轻仍是NAFLD的首选干预措施,但因患者依从性不佳等原因,效果仍有一定的局限性,难以有效的控制NAFLD及其并发症的发展。大量临床研究表明,减重手术是目前针对重度肥胖人群长期减重和缓解糖尿病最有效、最持久的干预措施。近年来,袖状胃切除术(Sleeve Gastrectomy,SG)因其能有效的降低肝脏脂毒性,延缓甚至逆转NAFLD的进展,逐渐成为全球范围内应用最为广泛的减重手术。虽然关于SG缓解NAFLD的临床研究及基础研究正在逐渐深入,但其潜在机制尚未完全阐明。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种主要由肠道L细胞所产生的激素,通过作用于GLP-1受体,具有促进胰岛素分泌、延缓胃排空的作用,同时GLP-1能够增强肝脏β氧化,减少脂肪形成及脂肪酸的摄取,从而达到减脂降糖的功效。前期研究表明,GLP-1水平在肥胖人群及肥胖动物模型中表达水平降低,接受SG手术后GLP-1水平上升。基于此,深入研究自噬在SG术后GLP-1升高缓解NAFLD过程中的作用,对于明确减重手术的潜在机制及NAFLD的诊断、治疗均有十分深远的意义。本研究通过构建NAFLD大鼠模型,分别行SG和假手术后观察术后脂代谢相关生化指标和肝脏脂质沉积情况。利用Western Blotting对SG术前和术后大鼠的自噬相关指标的表达情况进行了检测,阐明了 SG术后大鼠肝脏组织自噬强弱的改变。然后,我们在体外利用高脂培养基诱导HepG2细胞产生脂毒性,并利用GLP-1类似物进行干预,观察其对脂毒性肝损伤的作用及对自噬的影响;同时,我们在体外阻断了自噬通路,观察GLP-1类似物是否通过自噬作用影响肝细胞的脂毒性;最后,我们在体外阻断了 AMPK通路,观察GLP-1类似物对该通路的影响和自噬的变化,旨在探讨GLP-1类似物改善肝脏脂毒性的分子机制。本研究分以下两部分进行:第一部分:袖状胃切除术后大鼠自噬水平及肝脏脂质沉积的变化第二部分:AMPK/mTOR信号通路在GLP-1类似物增强自噬改善HepG2细胞脂毒性中的作用第一部分 袖状胃切除术后大鼠自噬水平及肝脏脂质沉积的变化研究目的高脂喂养构建肥胖大鼠NAFLD模型,对符合标准的肥胖大鼠行SG手术及假手术,探究SG手术对大鼠的体重、脂代谢的改善情况,以及SG术后大鼠肝脏自噬相关蛋白的表达情况。研究方法1.通过建立高脂饮食诱导肥胖大鼠NAFLD模型,模型使用HE染色评估,同时普通饲料喂养建立阴性对照组(NC组)。造模成功的大鼠随机分为3组,每组10只,分别行SG手术(SG组)及SHAM假手术(SHAM组),另外一组不进行手术(Obesity组)。手术定期测量大鼠的体重、摄食量的改变,以评估手术效果。2.术后8周,分别收集NC组、Obesity组、SHAM组以及SG手术组大鼠的肝脏,并留取血液标本。通过对大鼠肝组织进行HE染色和油红O染色以及对血液样本进行生化指标监测,来评估各组大鼠的肝脏功能和脂代谢的改变。同时,应用Elisa检测各组大鼠的GLP-1表达水平。3.应用Western Blotting检测各组大鼠自噬相关蛋白Beclin-1以及LC3BⅡ/LC3B Ⅰ的表达。4.另取一组成模大鼠,随机分为2组,一组行SG手术,另一组行SG手术的同时腹腔注射CQ阻断自噬。术后8周收集大鼠肝脏检测肝脏脂质沉积情况。研究结果1.体重与摄食量:手术后前两周,SHAM组和SG组的体重和摄食量均呈现下降趋势,后逐步缓慢增加,相对于SHAM组,SG组体重增加和食物摄入量增加量明显减少;而NC组和Obesity组体重呈稳定上升趋势,摄食量未见明显变化。2.肝功能和脂代谢:经过HE染色和油红O染色,SG组相较于Obesity组和SHAM组肝脏脂质沉积明显减少。Obesity组Q-VD-Oph价格和SHAM组的AST、ALT、LDL、TG、TC水平均高于NC组,HDL低于NC组;经SG手术后,上述AST、ALT、LDL、TG、TC水平下降,HDL水平上升,与Obesity组及SHAM组相比,均具有统计学差异。同时,SG组GLP-1水平明显高于Obesity组和SHAM组。3.伴随肝脏脂质沉积的减少,肝脏自噬功能增强:Obesity组和SHAM组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ的表达水平降低,接受SG手术后,相对于Obesity组和SHAM组,Beclin-1、LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ的表达水平升高,提示SG术后大鼠肝脏自噬活性增强。对大鼠行SG手术的同时腹腔注射CQ阻断自噬后,肝脏脂质沉积增多,提示自噬在SG手术减少肝脏脂质沉积中发挥重要作用。研究结论1.SG手术具有减轻体重,改善肝功能及脂代谢的作用;2.SG术后GLP-1水平升高;3.SG术后自噬水平增强,肝脏脂质沉积减少。第二部分:AMPK/mTOR信号通路在GLP-1类似物增强自噬改善HepG2细胞脂毒性中的作用研究目的本部分通过高脂培养基培养HepG2细胞建立高脂环境,然后验证GLP-1类似物对细胞脂代谢的作用,观察这种作用是与自噬相关,然后对GLP-1类似物可能参与的信号通路进行探讨。研究方法1.培养HepG2细胞,将细胞分为以下几组:(1)在正常培养基中培养的细胞,作为正常对照;(2)在游离脂肪酸(FFA)(油酸/棕榈酸=2:1)培养基中培养的HepG2细胞;(3)在补充有GLP-1类似物的FFA培养基中培养的HepG2细胞,GLP-1类似物浓度分别为25nM、50nM、100nM和200nM。2.为了研究GLP-1在自噬中的作用,我们使用靶向Beclin-1的shRNA质粒敲低了 Beclin-1的表达。将细胞分为以下组:(1)在正常培养基中培养的HepG2细胞;(2)在FFA培养基中培养的HepG2细胞;(3)空载体质粒转染HepG2细胞,然后在补充100nMGLP-1类似物的FFA培养基中培养;(4)shBeclin-1质粒转染HepG2细胞,然后在补充100nM GLP-1类似物的FFA培养基中培养。3.为了验证GLP-1调节自噬的信号通路,我们使用了 AMPK抑制剂(Compound C)。将细胞分为以下组:(1)在正常培养基中培养的HepG2细胞;(2)在FFA培养基中培养的HepG2细胞;(3)在补充100nM GLP-1类似物的FFA培养基中培养的HepG2细胞;(4)在补充100nM GLP-1类似物的FFA培养基中培养的HepG2细胞,同时使用Compound C。4.Western Blotting对细胞自噬水平、凋亡通路相关蛋白以及AMPK/mTOR信号通路相关蛋白进行检测;免疫荧光用于检测自噬流强度;油红O染色用于检测肝细胞内脂质沉积;流式细胞术用于细胞凋亡的检测;qRT-PCR用于内质网应激相关分子检测。5.Western Blotting对大鼠SG术后AMPK和mTOR的磷酸化水平进行检测。研究结果1.GLP-1类似物对FFA诱导的人肝HepG2细胞内自噬水平的影响:与单纯FFA处理相比,随着GLP-1类似物浓度的提高,Beclin-1的表达水平升高和LC3BⅠ向LC3B Ⅱ的转化增多,且两者均呈剂量依赖性的升高。2.通过Western Blotting、免疫荧光和油红O染色证实:相对于单纯高脂培养基处理,GLP-1类似物处理HepG2细胞内脂质沉积减少,内质网应激及细胞凋亡均减少,敲低Beclin-1的表达降低自噬水平后,部分逆转了 GLP-1类似物所致的治疗效果,即细胞内脂质沉积增多,内质网应激和细胞凋亡增多。3.应用AMPK抑制剂后,GLP-1类似物处理的HepG2细胞自噬水平降低,细胞内脂质沉积增多。4.各组大鼠肝组织的总mTOR水平无明细差异,接受SG术后,相较于SHAM组和Obesity组,mTOR的磷酸化水平降低,提示mTOR对自噬活性抑制的降低。同样,AMPK的总蛋白水平未见明显差异,而SG组AMPK的磷酸化水平相较于Obesity组和SHAM组明显升高,提示SG术后AMPK的激活。研究结论1.GLP-1类似物对肝细胞自噬信号通路具有促进作用,且这种作用具有一定的剂量依赖性;2.自噬是GLP-1类似物改善肝细胞脂质沉积的机制之一;3.GLP-1类似物通过促进自噬减轻FFA诱导的肝细胞凋亡;4.GLP-1类似物通过促进自噬减轻FFA诱导的内质网应激;5.AMPK/mTOR信号通路参与了 GLP-1类似物在肝细胞引起的自噬;6.SG术后AMPK磷酸化水平升高而mTOR磷酸化水平抑制。