Achr receptor

皮肤是调节身体平衡的重要生理器官,被公认为人体防御感染的首要防线。伤口可以定义为破坏组织正常解剖关系的锐器损伤。一旦皮肤的结构或功能出现缺陷,机体就容易受到微生物入侵和伤口感染,从而延缓伤口愈合,甚至危及生命。伤口愈合通过作用于生物分子及细胞基质,将受损组织恢复原状。做好伤口管理,包括对微生物感染的控制、清理伤口环境、远离异物,同时选用适当伤口敷料。这都对处理伤口愈合时可能出现的多种并发症具有十分重要的意义。所以,保持机体合适的伤口环境,促进皮肤伤口的愈合仍是临床治疗中的一个重要问题。二氢槲皮素(Dihydroquercetin,DHQ),又名紫杉叶素(Taxifolin,Tax)一种天然的二氢黄酮醇类化合物。它有较高的生物活性,例如保护肝脏和肾脏以及抗炎,抑菌和抗糖尿病、调节酶活性、改善微循环、抗肿瘤作用以及治关节炎等。作为一种新食品原料,已经被广泛应用于食品、医药及化妆品等行业。近年来,静电纺丝法制备的纳米纤维高分子材料因其高比表面积、高孔隙率、结构和功能可控等独特性能而备受关注。人们对于发展生物医学应用纳米纤维兴趣不断增加,这刺激了载药纳米纤维膜在组织修复及伤口敷料中的进一步开发。因此,本研究采用静电纺丝技术,开发一种有效且安全的壳聚糖/聚乙烯吡咯烷酮/二氢槲皮素复合纳米纤维膜(CPD),并评价CPD的创面愈合能力和治疗机制。具体研究内容及结果如下:1、二氢槲皮素复合纳米纤维膜的制备及其结构、性能表征本课题利用壳聚糖(CS)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)制备负载DHQ纳米纤维膜(CPD)应用于促进皮肤修复的研究。通过扫描电镜,红外光谱,X射线衍射,热稳定性、水接触角测试等手段表征了CPD复合纳米纤维膜的性能。以纳米纤维为载体的敷料更接近细胞外基质,能为创面提供一个潮湿的修复环境,加速创面愈合。CPD也显示了较好的网络结构,使药物递送在局部空间及时间上具有可控性,增加了药物生物利用度。此外,CPD复合板纳米纤维膜自由基清除活性得到提高。同时体外抗菌实验还表明CPD能较有效地抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。为DHQ作为伤口敷料的研究奠定了基础。2、二氢槲皮素复合纳米纤维膜保护UVA诱导Ha Ca T细胞光损伤作用研究紫外线UVA辐射可引起皮肤光损伤。在本文中,干预处理CPD能显著提高UVA致光损伤Ha Ca T细胞活力,减少细胞产生ROS、SOD、GSH-Px和HYP含量提高,MDA含量降低。CPD可降低TNF-α荧光强度,抑制NF-κB蛋白表达,降低IKBα、TNF-α、IL-1β、COX-2和i NOS等蛋白生成,表明CPD在Ha Ca T细胞内对UVA辐射有显著抗炎作用。此外,CPD可降低Caspase-3荧光强度,对Caspase-3、Caspase-9蛋白表达以及Bax生成也有抑制作用,促进Bcl-2的表达,然后对UMedication reconciliationVA所致Ha Ca T细胞凋亡有抑制作用。综上所述,CPD处理对Ha Cat细胞抵抗紫外线照射造成的光损伤有很好的保护作用。3、二氢槲皮素复合纳米纤维膜促进小鼠伤口皮肤修复作用研究构建小鼠急性皮肤损伤模型,采用CPD复合纳米纤维膜给予药物,测定对皮肤伤口保护效果及作selleckchem INCB018424用机理,用H&E和Masson切片检测愈合的部分观察小鼠皮肤形态的改变,采用免疫荧光的方法观察生长标志物的荧光强度,蛋白质印迹测定新生皮肤中自噬因子的表达水平。结果显示:CPD治疗使小鼠皮肤伤口愈合率增加。H&E和Masson染色显示,CPD可明显改善皮肤损伤所致病理学变化。同时,免疫荧光染色观察到血管内皮生长因子(VEGF)、血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、泛角蛋白(Pan-Keratin)的表达升高。在蛋白质印迹的结果上,载药膜可以同时调控自噬相关蛋白PI3K和AKT、m TOR及其磷酸化蛋白的表达,调节LC3II/I、Atg5、Atg7和P62的表达,提示CPD可通过调节自噬水平来促进小鼠创面皮肤的修复。4、二氢槲皮素复合纳米纤维膜调节小鼠创面菌群促进伤口修复作用研究本文以皮肤创面菌群检测为手段,探讨CPD在创面菌群方面的调节作用。实验发现CPD不但能显著增加皮肤菌群Alpha多样性Shannon指数、Simpson指数和Pielou’s evenness指数,而PF-03084014说明书且能通过Beta多样性增加皮肤菌群多样性,能显著增加创面菌群厚壁菌门(Firmicutes)比和变形菌门(Proteobacteria)比,另外二氢槲皮素能通过减少嗜盐盐单胞属(Halomonas)菌群丰度和乳杆菌属(Lactobacillus)菌群丰度来促进皮肤创面修复,由此初步评价认为CPD对药物愈合系统有很好的应用前景。

目的：探讨不同温度清洗溶液对糖尿病足溃疡患者伤口疼痛及愈合轨迹的影响。方法：将100例糖尿病足溃疡患者随机分为观察组与对照组，每组各50例。对照组用室温生理盐水清洗伤口，观察组用37℃的生理盐水清洗伤口。2组创面按照统一的方法选择敷料、包扎。观察并比较2组患者换药次数、时间、疗效、伤口疼痛评分及创面愈合情况。结果：观察AZD6738采购组selleck激酶抑制剂换药次数、换药时间及伤口愈合时间均少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者的治疗总有效率(84.00%)明显高于对照组(52.00%),差异有统计学意义(P<0.05);观察组干预后VAS评分第2周[(1.46±1.03)分比(3.85±1.15)分]、第4周[(0.58±0.64)分比(2.74±1.40)分]、第6周[(0.08±0.14)分比(1.90±0.21)分]和第8周[(0.04±0.02)分比(1.45±0.65)分]均优于对照组，2组差异均有统计学意义；观察组干预后创面愈合率第2周[(49.22±8.52)%比(26.32±5.29)%]、第4周[(86.28±10.21)%比(49.76±9.38)%]、第6周[(94.02±8.29)%比(63.72±11.26)%]和第8周[(97.42±3.79)%比(71.83±3.90)%]均优于对照组，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：37℃生理盐水清洗伤口可减少换药次genetic lung disease数，降低每次换药时间和伤口愈合时间，减轻疼痛，促进创面愈合。

[背 景]虫媒病毒是指一类在吸血节肢动物体内复制并通过吸血过程将病毒传播给宿主动物的病毒。人类、家禽、家畜以及野生动物被昆虫叮咬后被感染,出现发热、出血、脑炎等症状和疾病。虫媒病毒对全世界,尤其是发展中国家的人类和动物健康构成了极大的威胁,是一个主要的全球公共卫生问题。云南省位于中国的西南边界,与缅甸、老挝、越南毗邻,属热带和亚热带气候。由于其独特的地理位置和气候特征导致云南省不仅是境外输入虫媒病毒最多的省份,也是国内新发现虫媒病毒最多的省份之一。因此,在云南省西部边境开展系统的虫媒病毒调查,有助于为当地虫媒病毒的防控提供科学依据。[目 的]在云南省西部边境地区开展媒介昆虫(蚊虫和蠓虫)及其携带病毒调查,了解该地区传播媒介及携带病毒的种类和分布;对新分离病毒进行分子鉴定,明确新分离病毒的分类地位;在此基础上,对一株新分离西藏环状病毒进行全基因测序和序列分析,从全基因组水平上明确新分离代表毒株的分子特征和遗传进化关系。同时,在当地开展动物血清流行病学调查,了解新分离病毒在家养动物中的感染和流行情况,为该地区虫媒病毒传染病的防治提供科学依据。[方 法]1.2018年7月在云南省芒市、盈江、泸水、腾冲的采集蚊虫和蠓虫样本,采用形态学分类的方法对采集的媒介昆虫进行分类鉴定。2.将采集到媒介昆虫样本进行研磨,分别接种在BHK-21和C6/36细胞进行病毒分离。从阳性分离物上清中提取核酸,分别使用虫媒病毒特异性引物进行RT-PCR扩增,阳性产物送生工生物公司进行测序。使用Clustal X、DNAStar、Mega-X等生物软件进行序列分析。3.采用双链RNA病毒全长cDNA扩增技术(FLAC)对新分离TIBOV MS18C217-16株进行全基因组扩增,使用生物信息软件对其基因组结构与特征进行分析。同时观察不同血清型TIBOV MS 18C217-16株与DH13C120株在BHK-21、C6/36Biocomputational method、VERO、PK15、HELA、MDBK等细胞中的增殖情况,绘制增殖曲线,比较不同血清型两株TIBOV生物学特征差异。4.选取2018年以来在云南省4个地区采集的680份动物血清,采用微量中和实验的方法检测这些动物血清中新分离TIBOVMS18C217-16株中和抗体。同时采用微量中和试验比较动物血清中不同血清型TIBOV(MS18C217-16株和DH13C120株)中和抗体滴度。对新分离病毒MS18C217-16采用不同血清型TIBOV病毒株DH13C120、SZ18、JCC637-2制备的特异性免疫腹水进行免疫中和试验。[结 果]1.2018年在芒市、盈江、泸水、腾冲累计采集库蚊、按蚊、阿蚊、伊蚊4个属的8种蚊虫共计8581只。三带喙库蚊是芒市和盈江地区的优势蚊种,中华按蚊是泸水和腾冲地区的优势蚊种。采集蠓虫共计18296只,其中在芒市共采集到19种库蠓7396selleck化学只,条带库蠓为优势蠓,构成比为59.79%;在泸水共采集到15种库蠓4602只,荒川库蠓为优势蠓,构成比为48.11%。2.蚊虫分为170个批次,蠓虫分为203个批次进行病毒分离,获得112株阳性病毒分离物,49株分离自蚊虫,63株分离自蠓虫。蚊虫和蠓虫病毒分离的批阳性率分别为28.82%和31.03%。四个地区病毒分离的批阳性率依次为芒市(51.45%)、泸水(22.73%)、盈江(7.41%)、腾冲(5.61%)。3.经过分子生物学鉴定,112批阳性分离物分别隶属于8科9属的10种病毒,包括 33 株 YUOV、83 株 TIBOV,6 株 BAV,5 株 NDiV,1 株 AKAV,53 株 MAV,2 株 CxFV,4 株 CppDNV,1 株 CuTLV,1 株 ArIFV。4.TIBOV分离株MS18C217-16的PAGE显示该病毒是10节段的dsRNA病毒,片段迁移模式为3-3-3-1。病毒基因组有19247 nt核苷酸序列,编码6616个氨基酸,其T3和OC1蛋白和与7株TIBOV的氨基酸同源性分别在93.9%～97.7%,27.7%～58%,提示MS18C217-16株可能是一株新型TIBOV。病毒的生物学特征研究提示 MS18C217-16 和 DH13C120 都能在 BHK-21、VERO、PK15、HELA、MDBK和C6/36等6种细胞中增殖,其中能在BHK-21、VERO、PK15细胞中产生病毒噬斑。5.动物血清流行病学调查结果显示,在勐腊和芒市的牛血清、山羊血清和猪血清,景洪和江城的猪血清中都检测到了 MS18C217-16毒株的中和抗体。四个地区的抗体阳性率依次为勐腊(23.86%)、景洪(12.73%)、芒市(8.11%)、江城(7.41%)。三种动物血清的抗体阳性率依次为山羊血清(38.46%)、猪血清(12.86%)、牛血清(3.72%)。MS 18C217-16株与DH13C120株抗体滴度的比较提示,20份MS18C217-16株抗体阳性血清中有19份血确认细节清DH13C120株抗体也阳性,1份勐腊山羊血清(ML19)DH13C120株抗体阴性。相比MS18C217-16株,DH13C120株的抗体滴度在4份血清中表现出了 4倍升高,1份血清表现出2倍升高,4份血清表现出2倍降低,5份血清表现出4倍降低,有5份血清二者的抗体滴度相同。将 MS18C217-16 株制备的抗原片与 TIBOVDH13C120 株、SZ18 株、JCC637-2 株制备的特异性免疫腹水进行间接免疫荧光试验,三者都表现出阳性,抗体滴度分别为 1:80、1:40、1:40。[结论]本研究调查结果提示在云南西部边境地区存在多种蚊虫(8种)和蠓虫(29种)、蚊虫和蠓虫密度高。从这些媒介昆虫分离获得8个科9个属的10种病毒,病毒分离的批阳性率为30%,提示云南西部边境地区虫媒病毒种类多,媒介带毒率较高。对一株新分离TIBOV全基因组序列分析和血清交叉中和试验结果提示该株病毒可能为新血清型TIBOV。该病毒不仅能在猪、牛、猴、人、鼠等多种哺乳动物细胞中增殖,还能在云南省多个地区的牛羊猪等动物血清中检测到较高滴度中和抗体,提示该病毒能够感染人和多种哺乳动物,可能是多种动物潜在的病原体。

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种多因素神经退行性疾病,其特征是认知障碍,根据胆碱能假说,其与神经元胆碱能损失和胆碱能神经传递水平降低有关。目前,没有有效的治疗方法。自2001年石蒜科生物碱加兰他敏(galanthamine)作为AD治疗药物问世以来,生物碱一直是寻找抗AD新药最有吸引力的一类化合物。而β-咔啉作为一类具有丰富结构和广谱活性的生物碱,在近几年的报道中,发现其对在AD中起着重要作用的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)和丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase,BuChE)有较好的生物活性。因此,本研究基于课题组前期在β-咔啉的合成及其活性研究工作的基础上,在β-咔啉母核结构的C-1位引diABZI STING agonist研究购买入吲哚等芳香基团,在C-3位通过酰胺键链接一系列脂肪胺和芳香胺,然后通过对AChE和BuChE的体外抑制活性实验,筛选出活性高的β-咔啉类化合物,并根据活性总结其构效关系。之后通过计算机辅助模拟初步探究其作用机制。相关结果如下:1.通过Pictet-Spengler反应构建C-1位芳香取代的β-咔啉母核,之后经历氧化脱氢、酯水解、酰胺缩合步骤合成3-酰胺-β-咔啉类衍生物30个,其结构通过ABT-263浓度~1H NMR、~(13)C NMR确证,均为未见报道的新化合物。2.以他克林作为阳性对照,通过Ellman比色法测试了30个衍生物对AChE、BuChE的体外抑制活性。结果表明,在8μM浓度下,所有化合物均对受试酶有不同程度的抑制活性,其中化合物S1、S12对BuChE的抑制率在80%以上,其IC_(50)分别为1824.33±188.65 n M、232.86±12.68 n M。3.通过比较所Micro biological survey合成衍生物的结构特征与BuChE抑制活性的关系,表明β-咔啉类化合物的C-1位引入吲哚取代基能提高化合物的抑制活性;当C-1位是吲哚时,位脂肪酰胺链越短越好;当C-3位是芳香酰胺时,则无取代基优于供电子取代基,供电子取代基优于吸电子取代基。4.通过Auto Dock Vina对两个高活性分子S1、S12与BuChE进行分子对接,结果表明,S1、S12可能通过竞争性结合丁酰胆碱酯酶来发挥抑制丁酰胆碱水解的作用。其中,S1、S12与丁酰胆碱酯酶的结合能(-11.0、11.5 kcal/mol)远高于丁酰胆碱与丁酰胆碱酯酶的结合能(-4.8 kcal/mol),同时,S1、S12和丁酰胆碱在关键作用位点HIS438(催化三联体的残基)、TRP82(催化阴离子位点的残基)都有着强烈的相互作用。除此之外,S1、S12还具有比较理想的的理化参数。总之,本文通过化学方法合成了具有AChE、BuChE抑制活性的β-咔啉化合物30个,丰富了3-酰胺-β-咔啉的结构多样性,分子对接表明高活性β-咔啉化合物可能通过竞争性结合丁酰胆碱酯酶来发挥BuChE抑制活性。研究结果可为BuChE抑制剂的开发提供候选分子,同时可为β-咔啉在胆碱酯酶抑制活性方面的设计合成提供一定的参考依据。

天然氨基酸作为组成Infection génitale蛋白质的基本单元,通过灌胃,可以穿过消化屏障,直接参加人体的生命活动。天然氨基酸自身就带有极高的生物相容性,为了最大限度的利用氨基酸的此种Liraglutide特性,深入挖掘小分子氨基酸的潜在功能,本文从小分子氨基酸的基本物理化学性质出发,对小分子氨基酸聚集体的制备条件、实际应用进行了深入的研究:在惰性氛围中,将氨基酸进行“熔融-淬火”处理,将小分子氨基酸粉末加Colforsin体外热至玻璃化转变温度,通过对加热和冷却速率的精确控制,在达到氨基酸晶体的分解温度之前,熔化为过冷液体,可实现高温粘连和低温固化的特点,利用其粘性制成生物粘合剂。形成的氨基酸小分子玻璃态在空间排布上呈现短程有序、长程无序的特点,宏观上表现出高粘性的胶合状态。由于小分子氨基酸固有的生物相容性,可以尝试将其用作生物胶。克服了以往合成高分子胶粘剂需添加固化剂、以及需要施加固化压力,较长固化时间等缺点,可更多的应用不同场景。天然抗氧化剂的疏水性以及口服利用率低仍然是广泛利用面临的重大挑战。将小分子氨基酸、疏水性药物与水混合加热,利用氨基酸分子与水分子间的氢键作用以及氨基酸侧链与药物间的疏水作用,将氨基酸聚集体转变为药物载体,利用分子间作用力构筑氨基酸-药物-水共组装口服剂型。该药物载体可以大幅增溶疏水药物,并保留其安全、无生物毒副作用、生物相容性好等众多优点,提高疏水药物的生物利用率,为疏水药物口服给药的难题提供了一种可行的方案,初步开拓了小分子氨基酸聚集体的生物应用领域。

目的:马齿苋(Portulaca oleracea L.,POL),是国内分布广泛的一种药食同源性中草药,具有清热解毒、调节免疫等作用。近年来,本课题组从马齿苋中提取、分离和纯化得到马齿苋多糖(POL-Polysaccharide,POL-P)。前期研究表明,POL-P能提高机体免疫力,降低体内毒素,同时也发现,POL-P的免疫增强作用存在生物利用度低,且结合新型给药系统的研究相对薄弱等问题,致使POL-P的应用受到局限。脂质体是由磷脂双分子层包裹形成的水相核心微囊泡,作为一种优良的药物载体,具有提高生物利用度并降低毒副作用等特性。本研究综合考虑POL-P具有免疫增强的作用以及脂质体作为药物载体的良好特性,建立马齿苋多糖脂质体(POL-P Liposome,POL-PL)的最佳制备工艺并对其免疫增强活性进行初步评价,通过二者的共同作用,解决POL-P的应用局限且进一步提高其免疫增强活性。方法:首先,采用单因素实验-响应面优化的方法得到POL-PL的最佳制备工艺。利用逆相蒸发-微孔滤膜挤压法制备POL-PL,在六因素五水平的单因素实验基础上,选择影响包封率最大的三个单因素条件,即旋蒸温度、载药比、膜材比3个因素进行响应面优化,其他因素选用最优条件。利用响应面法进行工艺优化后得到最佳制备工艺条件,可行性调整后进行验证,最终得到最佳的POL-PL制备工艺。其次,对最优工艺制备的POL-PL进行形态学及理化性质分析。通过形态学、透射电镜观察,粒径分布、多分散系数(Polydispersity,PDI)及电势的测定,红外吸收光谱分析以及缓释性、储存稳定性实验等方法,明确POL-PL的形态及理化性质。再次,初步评价POL-PL对小鼠脾淋巴细胞的免疫增强活性。利用CCK-8法探究POL-P、空白脂质体、POL-PL对小鼠脾淋巴细胞的最大安全浓度,并选择最适浓度检测POL-PL对小鼠脾淋巴B、T细胞增殖、B淋巴细胞IgG分泌及T淋巴细胞亚群分化的影响,确定POL-PL对小鼠脾淋巴细胞免疫增强活性的初步评价。最后,初步评价POL-PL对小鼠巨噬细胞Raw264.7的免疫增强活性。利用CCK-8法确定POL-PL对小鼠巨噬细胞Raw264.7的最大安全浓度,并选择最适浓度检测POL-PL对Raw264.7细胞增殖、吞噬活性、细胞因子包括肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleuselleck抑制剂kin 6,IL-6)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、白细胞介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)水平影响,确定POL-PL对小鼠脾淋巴细胞免疫增强活性的初步评价。结果:1、POL-PL最佳制备工艺条件为:磷脂浓度为5 mg·m L~(-1);超声时间为5 min;卵磷脂与吐温80质量比为15:1;膜材比为5:1;旋蒸温度40℃;脂药比为27:1。验证实验测定其包封率为37.83±1.49%,符合模型预测。2、POL-PL外观透明清亮并呈淡蓝色乳光,透射电镜下呈球形或椭圆形的囊泡,平均粒径和PDI分别为100.037±1.990 nm、0.232±0.003(n=3),Zeta电位为(-23.033±1.686)m V(n=3)。红外结果表明,POL-PL形成过程中没有形成新的化学键,是通过静电力作用结合形成;POL-PL的缓释性良好,4℃储存一个月包封率下降5%。3、POL-PL对小鼠淋巴细胞最大安全浓度为62.5μg·m L~(-1),最佳培养时间为24 h。与POL-P、BL、BC组相比,POL-PL可显著促进小鼠脾淋巴B、T细胞增殖(P<0.05),最佳剂量为16μg·m L~(-1)。POL-PL对小鼠脾淋巴B细胞IgG分泌量显著增加(P<0.05);流式细胞术测定POL-PL对小鼠脾淋巴T细胞亚群CD4~+/CD8~+的比值最显著(P<0.05)。4、POL-PL对小鼠巨噬细胞Raw264.7的最大安全浓度为62.5μg·m L~(-1),最佳培养时间为24 h。与POL-P、BL、BC组相比,POL-PL可以显著促进Raw264.7细胞增殖和吞噬活性(P<0.05),最佳剂量为16μg·m L~(-1)。POL-PL可显著上调Raw264.7细胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6及NO水平(P<0.05)。结论:综上所述,本研究采用逆相蒸发-微孔滤膜挤压法制备POL-PL,单因素-响应面法优化其最佳制备工艺。按照最佳制备工艺制备Cell CountersPOL-PL进行形态学及理化性质分析并进一步进行体外实验,明确了POL-P经过脂质体包被后增加了缓释性,并验证了其对小鼠脾淋巴细胞及巨噬细胞Raw264.7的免LEE011 NMR疫增强活性。该实验结果为提高中药活性成分的研究提供思路,且为研发多糖类免疫增强剂提供理论依据。

为探明蓖麻主要农艺性状间的内在联系，并为筛选出综合表现优良的蓖麻品种提供基础材料，本试验以16个蓖麻杂交组合及其8个亲本为材料，对其生育期、株高、主茎节数、有效分枝数、百粒重、容重和产量等共15个主要农艺性状进行变异分析、配合力Galunisertib浓度分析、相关性分析、主成分分析和隶属函数分析。结果表明，15个性状的变异系数范围在Foodborne infection3.90%～35.96%之间。一般配合力分析中，6906、Amk1和Amk85的一般配合力较为优良。特殊配合力分析中，Amk7×8927的SCA效应值最高且为正效应。主成分分析将供试材料的15个农艺性状综合成为5个主成分，其特征值分别为5.634、2.607、1.798、1.525、1.099,累积贡献率达84.419%。通过隶属函数分析，筛选出3个综合性状优良的组合，分别为：Amk1×6906、Amk85×6906和Amk85×3890。上述研究结果Bemcentinib抑制剂可为蓖麻的良种选育提供参考。

癌症严重威胁人类健康,针对癌症的治疗策略与药物研发已成为我国疾病治疗的重点研究领域之一。《Science》将癌症免疫治疗作为年度十大科技突破之首进行刊发,揭示了免疫治疗的巨大临床应用潜力。癌症免疫治疗(Cancer immunotherapy)主要是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环(Cancer-immunity cycle)来恢复机体抗肿瘤免疫反应,从而控制、清除肿瘤的一种治疗手段。但临床研究结果表明,只有少数患者从中获益,多数患者对免疫治疗策略响应率较差。以T淋巴细胞瘤内浸润不足和启动失败为主要特征的肿瘤“冷”特性是造成响应率低的重要原因,也是阻碍免疫治疗获益普适化的最大障碍。因此,逆转肿瘤由“冷”变“热”,增强T淋巴细胞的瘤内浸润和有效激活将成为肿瘤治疗普适化的重要突破口。树突状细胞(Dendritic cell,DC)作为一种专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC),是免疫反应的关键协调者,在先天和适应性免疫反应的启动和调节中发挥重要角色。在肿瘤微环境中,DC细胞可摄取、加工、呈递肿瘤抗原并提供共刺激性信号来激活T细胞免疫,因此,操控DC细胞具有诱导有效的抗肿瘤免疫的巨大潜力。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是先天免疫中一类十分重要的模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR),可检测局部感染和组织损伤,从而防止全身感染,监视恶性肿瘤细胞的产生。激活DC细胞的TLR,可诱导髓样分化因子(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)或 β 干扰素 TIR 结构域衔接蛋白(TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-β,TRIF)依赖的信号通路,激活核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB),诱导细胞因子和趋化因子分泌,激活先天免疫反应和获得性免疫反应,达到重塑肿瘤微环境的目的。在众多的TLR亚型中,针对TLR3、TLR4、TLR7/8和TLR9的激动剂在抗肿瘤应用中研究较为广泛。其中TLR7/8激动剂可以靶向所有内源性DC亚群,诱导更高水平促炎因子的分泌和共刺激受体的上调。除此之外,TLR7/8激动剂可同时激活TLR7和TLR8,展现出了更大的临床转化潜力。咪唑喹啉类小分子(Imidazoquinoline)是目前最常报道的TLR7/8激动剂,其中咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)已被美国FDA批准用于基底细胞癌(外用),雷西莫特(Resiquimod,R848)比IMQ多了一个羟基和一个乙氧基甲基链,表现出了更强的TLR8激动作用。Sunil A.David团队根据构效关系研究开发了一种更高效且容易修饰的新型TLR7/8激动剂(1-(4-(aminomethyl)benzyl)-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amine,IMDQ)。然而,以 TLR7/8 激动剂为单一组分的免疫治疗策略仍难以引起强效的T淋巴细胞免疫反应,进一步引入其他功能剂将有望提高DC细胞递呈功能,实现多模式免疫调节,进而诱导增强的细胞免疫反应。近年来,化学治疗(如奥沙利铂(Oxaliplatin,OXA)等)、光热治疗(Photothermal therapy,PTT)和化学动力学治疗(Chemodynamic therapy,CDT)等触发的肿瘤免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death,ICD)效应激起了科研人员的广泛研究兴趣。ICD可以促进“吃我”信号钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的外翻,“发现我”信号腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine-triphosphate,ATP)的分泌及高迁移率族蛋白 B1(High-mobility group box 1 protein,HMGB1)的释放,增强DC细胞功能并引发T淋巴细胞的瘤内浸润。因此,将ICD诱导剂合理、安全地应用到肿瘤治疗中,对于激活机体抗肿瘤免疫,产生长远的抗肿瘤效果具有重要意义。然而,由于以上化疗药物及免疫调节小分子注射后的非特异性分布特点,体内应用后容易诱发全身非选择性的细胞毒性和免疫激活,这极大限制了此类药物的临床应用。因此,药物在特定组织或细胞的精准递送,对于确保安全有效的免疫应答至关重要。纳米药物递送系统(Nano-based drug delivery systems,NDDS)因其具有改善药物药动学性质、肿瘤靶向递送能力、肿瘤微环境或肿瘤细胞内响应性定点释药等特性,有助于获得更优的抗肿瘤效果,具有潜在临床应用前景。目前,多种基于NDDS的药物制剂已获批用于PEG300纯度临床,显著提高了肿瘤治疗效果。其中,聚合物纳米载体(Polymer-based nanocarriers)一般由同时具有亲水端和疏水端的两亲性嵌段共聚物构成,具有较好的自组装能力,结构明确,载药量较高,主要包括聚合物胶束、聚合物囊泡、聚合物-药物偶联体等。聚合物-药物偶联物因易修饰、载药可控、性质稳定等优势在药物递送中展现着巨大潜力。可逆加成-断裂链转移(Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization,RAFT)聚合技术作为聚合物制备的重要工具,为聚合物-药物偶联物的按需设计提供了普适性平台。基于以上讨论,本课题主要开展了以下研究:第一部分:肿瘤选择性激活的TLR7/8激动剂纳米免疫调节系统用于肿瘤特异性免疫激活的研究。本部分针对小分子TLR7/8激动Blood Samples剂注射后的全身性免疫激活问题,采用化学手段暂时掩蔽其关键活性位点(C4位氨基)合成了肿瘤响应性药物单体IMQ-HEDSMA,利用RAFT聚合技术聚合该单体构建了嵌段共聚物pDMA-b-pIMQ。为解除T淋巴细胞的免疫抑制状态,同法构建了荷载免疫检查点抑制剂JQ1的嵌段共聚物pDMA-b-pJQ1。为进一步实现其肿瘤靶向功能,在聚合物端基上修饰肿瘤靶向肽(Cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys),c-RGD),制https://www.selleck.cn/products/Decitabine.html备了肿瘤靶向性嵌段共聚物c-RGD-pDMA-b-pIMQ和c-RGD-pDMA-b-pJQ1。上述肿瘤靶向性嵌段聚合物可通过自组装形成前药纳米免疫调节剂c-N@IM/JQ。静脉注射后,c-N@IM/JQ依靠c-RGD介导的肿瘤靶向作用聚集在肿瘤部位。然后在肿瘤富含的谷胱甘肽(Glutathione,GSH)作用下,二硫键中间体发生断裂而释放出IMQ和JQ1。释放的IMQ可促进DC细胞成熟,进而增强T淋巴细胞的瘤内浸润;JQ1可进一步解除T淋巴细胞的免疫抑制信号,两者协同触发肿瘤特异性的免疫响应。1H-NMR证明了功能性单体、嵌段共聚物的合成及其c-RGD 靶向修饰;粒径、电位、透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)图和释放曲线证明了 c-N@IM/JQ的成功构建和药物的肿瘤响应性释放;细胞毒性和BMDC活化等实验结果证明了 c-N@IM/JQ的细胞毒性和免疫调节功能;体内IVIS成像和流式分析表明了 c-N@IM/JQ的肿瘤靶向作用;体内抑瘤实验、免疫浸润分析和病理学考察证明了 c-N@IM/JQ良好的抑瘤效果和免疫激活能力。第二部分:“光热/化疗/免疫”三合一的多模式纳米递送平台用于肿瘤特异性免疫治疗的研究。本部分在TLR7/8激动剂免疫效果的基础上进一步联合ICD效应构建了“光热/化疗/免疫”三合一的新型多模式纳米递送平台用于增强癌症免疫治疗效果。本部分选择空心硫化铜(Hollow copper sulfide,CuS)纳米粒作为光热治疗剂,同时负载化疗药OXA形成OXA@CuS,两者均具有ICD效应,可作为ICD的放大组合体。采用RAFT聚合技术构建了具有DC细胞靶向性、TLR7/8激动剂接枝的DC细胞靶向性聚合物-药物偶联体Man-pIMDQ。为延长纳米粒的肿瘤滞留时间,我们同法构建了肿瘤靶向性聚合物FA-pDMA。最后,将FA-pDMA和Man-pIMDQ共同锚定在OXA@CuS表面构建了多模式纳米递送平台F/IMO@CuS。瘤内注射后,F/IMO@CuS依靠FA介导的肿瘤靶向作用延长了瘤内滞留时间。在808 nm近红外激光照射下,F/IMO@CuS发挥光热治疗的同时逐渐解体,所释放的OXA和光热治疗共同触发肿瘤ICD效应。ICD引发的免疫信号和Man-pIMDQ协同促进DC细胞的成熟。激活的DC细胞可进一步介导T淋巴细胞的有效瘤内浸润抑制肿瘤进展,并在体内形成了免疫记忆以阻止肿瘤复发。1H-NMR结果证明了功能性单体、聚合物的合成及配体的靶向修饰;粒径、电位和TEM图等证明F/IMO@CuS的成功构建;细胞毒性、细胞摄取、光热成像、ICD信号检测和BMDC活化等实验证明了 F/IMO@CuS的光热化疗效果、细胞靶向功能、ICD诱导和DC激活能力;体内IVIS成像和流式分析考察了 F/IMO@CuS的瘤内滞留和细胞内分布情况;体内抑瘤实验、免疫浸润分析和病理学考察证明了 F/IMO@CuS良好的抑瘤效果、免疫激活能力和体内免疫记忆的形成。

胞内菌在是临床上细菌性感染反复发生,迁延不愈的主要原因,它们存活于宿主细胞中,由于宿主细胞膜的屏障作用阻碍抗生素渗透入胞内而很难有效清除,还会干扰宿主细胞先天免疫反应,抗生素耐药菌株的出现加剧了这一问题,甚至造成威胁生命的感染。目的:本实验旨在开发一种可控载药的纳米颗粒,能够将抗生素递送入细胞内,增加细胞内有效抗生素浓度,并且能打破免疫抑制增强宿主细胞自身的先天免疫,为临床胞内菌的治疗提供一种新思路。方法:(1)使用水解-沉淀法合成内核CaO_2-万古霉素纳米颗粒(CaO_2-Vanco NPs,CV NPs),挑选合适比例的月桂酸、硬脂酸共晶混合物,作为热响应相变的外壳,以合成在理想的熔点可控释放的CaO_2-Vanco@PCM NPs(Canagliflozin纯度CVP NPs)。利用透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、X射线衍射图谱(XRD)和傅里叶红外变换光谱(FI-TR)等对CVP NPs的形貌结构进行表征;使用共聚焦荧光显微镜(CLSM)和流式细胞仪进行荧光共定位分析。(2)检测CVP NPs在不同pH和温度下释放万古霉素的速率;使用冷-热循环释药和96孔板释药实验检测CVP NPs释放万古霉素的时间分辨性和空间分辨性;与RAW 264.7细胞不同温度下共培养,评估CVP NPs在细胞水平的热响应释药效果;并使用氧电极评估释氧效率。(3)使用CCK-8、细胞形态荧光成像及溶血试验检测不同浓度梯度的纳米颗粒在37℃到40℃对RAW 264.7细胞与L-929细胞生长活性的影响。(4)通过菌落平板计数、FDA/PI活死染、流式细胞术和SEM成像评估CVP+HTD(CVP+Heated Treatment)处理组对浮游细菌的杀伤情况。使用FDA/PI活死染CLSM荧光成像及SEM成像评估CVP+HTD对生物膜的破坏。(5)建立MRSA感染的RAW 264.7模型,通过荧光成像技术和流式细胞术评估CVP NPs入胞效率;使用裂解细胞细菌后平板计数及CLSM荧光成像评估CVP+HTD清除胞内菌效果。(6)检测不同处理组细胞内乳酸和H~+,评估CVP+HTD去酸化porous media效果;使用蛋白质印迹(Western Blot,WB)检测各组细胞内i NOS、Arg-1和HIF-1α的表达量,判断巨噬细胞的极化状态;检测巨噬细胞内主要抗菌物质活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species,RNS)的产量。(7)验证CVP+HTD在体内清除胞内菌的效果,使用BABL/c小鼠,建立化脓性关节炎模型,通过观察关节局部的红肿、关节破坏;关节间隙X线片中的骨质黏连;冷冻切片荧光成像中胞内菌的清除情况以及组织石蜡染色结果评估体内治疗效果。结果:(1)合成的CV NPs是尺寸均一,分散性良好的球形结构;合成的CVP NPs具有高稳定性的球形核壳结构,以CV NPs为内核,脂肪酸为外壳。(2)万古霉素在CVP NPs中的负载率约为56.39%。IACS-010759体内实验剂量具有很好的释氧效果,在高温(40℃)和低pH环境下会加速万古霉素的释放,CVP NPs释药具有很高的时间分辨率和空间分辨率,并且这一特性在细胞水平也能保持。(3)在与不同组份纳米颗粒在40℃下共培养后的RAW 264.7及L-929细胞存活率均大于90%,所有组溶血百分比介于1.46-4.96%,均小于5%,表明CVP NP具有良好的细胞相容性和血液相容性。(4)CVP+HTD的对浮游MRSA的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)分别为3.90μg/m L和7.80μg/m L,显著小于不加热组。即使初始细菌密度达到10~8CFU/m L,相当于MIC测定的100倍,CVP+HTD的杀菌率也超过99%,且具有较高的生物膜破坏效果。(5)在CVP+HTD处理下,能高效实现万古霉素的跨膜运输并通过热响应相变按需释放,增加胞内有效杀菌浓度,几乎所有的细胞内MRSA(>99%)都被杀死,并且没有产生抗生素耐受性。(6)CVP+HTD可以通过与周围的水和H~+发生氧化还原反应,产生Ca(OH)2,与乳酸发生酸碱中和反应,消耗积累的乳酸,通过杀伤胞内MRSA减少与细菌代谢物相关的乳酸的产生,克服乳酸相关的免疫抑制,促进巨噬细胞M1极化。(7)体内实验表明CVP+HTD治疗组可以有效地消除关节滑液和滑膜中的浮游MRSA和细胞内MRSA,并能逆转病灶局部的免疫抑制。经过CVP+HTD治疗的小鼠,预后更好且具有优异的组织相容性,提供了一种有前景的治疗胞内菌的策略。结论:CVP NPs具有优异的热响应释药性能,并有效中和乳酸,减轻乳酸相关免疫抑制增加ROS和RNS的产出,为胞内菌治疗提供了一种安全有效的方案。

为探究玉米BTB-TAZ蛋白ZmBT2b在玉米抵抗病原菌侵染过程中的功能，本研究利用生物信LGX818作用息学技术对ZmBT2b基因进行了系统分析，确定了ZmBT2b具有BTB和TAZ结构域，具有明显的Programmed ventricular stimulation组织表达特性，在生物和非生物胁迫下呈现不同的表达规律。通过构建ZmBT2b基因过表达的拟南芥植株ZmBT2b-OE，对该基因在植物抗病过程中的功能进行研究，结果发现ZmBT2b-OE对灰葡萄孢和Pst. DC3000的抗性显著增强，确定了ZmBT2b基因在植物抗病过程中具有重要功能。为明确ZmFulvestrant采购BT2b基因在玉米抵抗禾谷镰孢侵染过程中的功能，本研究获得了该基因的玉米突变体Zmbt2b-1和Zmbt2b-2，对突变体的抗病性进行检测发现，突变体Zmbt2b-1和Zmbt2b-2对禾谷镰孢的抗性敏感性显著高于野生型，且突变体中JA合成途径关键合成基因ZmLOXs和病程相关基因ZmPRs在禾谷镰孢侵染过程中显著下调，表明ZmBT2b在玉米抗禾谷镰孢侵染过程中具有正调控功能。研究结果为阐明玉米BTB-TAZ蛋白在玉米抗病过程中的功能及其调控机制奠定了基础，为玉米抗病育种提供了基因资源。