目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌的大部分,目前是全球癌症相关死亡的第三大原因。HCC发生在多年慢性肝病之后,基因组中的突变是癌症的致病和决定性特征。慢性肝病尤其是在肝硬化阶段,会导致突变的进行性积累,从而推动癌症的发展。因此,了解导致特定突变的原因以及它们如何相互作用导致癌症的发生发展是了解、预防和应对肝癌的核心问题。由TP53基因编码的p53蛋白是一种肿瘤抑制转录因子,可作为防止多种癌症发生和寻找更多发展的基因守护者。TP53基因在大约一半的人类癌症病例中发生突变。p53突变调节许多细胞过程,包括增殖、迁移、侵袭、存活、代谢、化疗抗性等,以促进肿瘤进展。值得注意的是,已有研究表明TP53突变与HCC的免疫微环境密切相关。CD8~+T细胞是免疫微环境中主要的杀伤细胞,在肿瘤抗原持续刺激、免疫抑制细胞抑制以及理化状态失衡等多种因素的影响下,CD8~+T细胞会逐渐退化为增殖能力减弱、效应细胞因子水平下降、抑制性受体表达增高的功能失调状态,称为CD8~+T细胞耗竭。对于p53突变促进肿瘤恶性生物学行为的研究,大部分集中在肿瘤细胞依赖于自主信号来发挥作用,然而如今越来越多的研究强调了p53突变参与调节肿瘤细胞分泌组学从而促进癌症进展,那么p53突变型肝癌细胞是否可以通过外泌体影响CD8~+T细胞耗竭以及具体机制值得探索。因此本研究首先明确了p53 R249S突变型肝癌细胞是否促进了CD8~+T细胞耗竭,其次探讨了外泌体是否参与p53 R249S突变型肝癌细胞对CD8~+T细胞耗竭的促进作用,最后寻找p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进CD8~+T细胞耗竭可能的机制,为肝癌的发生发展机制的探索提供新思路。研究方法:13-MA核磁.实验材料:人肝癌细胞系Hep3B和PLC/PRF/5、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6、C57BL/6小鼠。2.实验方法:(1)细胞培养:培养人肝癌细胞系Hep3B、PLC/PRF/5以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6。(2)病毒转染:在Hep3B细胞系中转染p53 R249S突变,在PLC细胞系中转染shp53,在Hepa1-6细胞系中转染p53 R249S突变。(3)Western blot:用于检测病毒转染效率、验证外泌体纯度、肝癌细胞中外泌体释放相关蛋白(RAB35、RAB27A、RAB27B、RAB10、SNAP23、VAMP3)水平、肝癌细胞、外泌体以及CD8~+T细胞中SHP2水平。(4)细胞共培养实验:将病毒转染后的人肝癌细胞与CD8~+T细胞共培养,用于后续流式分析。(5)小鼠皮下成瘤实验:用于研究p53 R249S突变对小鼠肿瘤重量、体积和生长速度的影响。(6)免疫组化:用于研究p53 R249S突变对小鼠肿瘤中CD8~+T细胞数量的影响。(7)差异超速离心:用于提取外泌体。(8)NTA:用于检测外泌体粒径分布。(9)透射电镜:用于观察外泌体粒径和形态。(10)外泌体-细胞共培养:将肝癌细胞提取的外泌体与CD8~+T细胞共培养,用于后续流式分析。(11)小鼠皮下成瘤及鼠尾静脉注射外泌体实验:用于研究p53 R249S突变肝癌细胞来源外泌体对小鼠肿瘤重量的体积的影响。(12)流式细胞术:用于检测细胞共培养、外泌体-细胞共培养、瘤体组织和脾脏中CD8~+T细胞中Gzm B~+、Perforin~+、PD-1~+和Tim-3~+水平。(13)免疫荧光:用于检测CD8~+T细胞对外泌体的摄取情况。(14)Real time PCR:用于检测肝癌细胞中SHP2的m RNA水平。(15)统计学分析:使用软件SPSS 22.0完成统计,所有数据使用均数±标准差的形式进行展示,并且所有实验均完成3次独立重复实验。柱状图量化及折线图由Prism 9(Graph Pad Software)完成。通过t检验和one-way ANOVA确定统计显著性,当P<0.05时,认为该数据具备统计学差异。3.实验方案3.1明确p53 R249S突变型肝癌细胞促进CD8~+T细胞耗竭(1)评估CD8~+T细胞耗竭情况:流式细胞术检测CD8~+T细胞中Gzm B~+、Perforin~+、PD-1~+和Tim-3~+,其中Gzm B~+CD8~+T细胞和Perforin~+CD8~+T细胞百分比下降、PD-1~+CD8~+T细胞和Tim-3~+CD8~+T细胞百分比升高提示CD8~+T细胞耗竭。(2)构建p53 R249S突变型肝癌细胞系:慢病毒转染技术分别在Hep3B人肝癌细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53 R249S作为实验组;在PLC人肝癌细胞系中转染PLKO作为对照组,转染shp53即p53敲除作为实验组。在Hepa1-6小鼠肝癌细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53 R249S作为实验组。(3)细胞共培养体系构建:将上述构建的人肝癌细胞系(p53 R249S突变型肝癌细胞与p53空载的肝癌细胞相互对比)分别与CD8~+T细胞共培养。(4)动物实验:利用构建的Hepa1-6小鼠肝癌细胞分别注入C57BL/6小鼠皮下进行成瘤。记录肿瘤体积大小和重量,评估肝癌组织中CD8~+T细胞浸润水平以及小鼠肿瘤组织和脾脏中CD8~+T细胞耗竭情况。3.2探究p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进CD8~+T细胞耗竭(1)外泌体的提取与验证:使用差异超速离心法提取细胞上清外泌体,并通过透射电子显微镜、NTA、western blot对外泌体纯度进行鉴定。(2)外泌体与细胞共培养体系构建:将收集的p53不同状态肝癌细胞来源的外泌体与CD8~+T细胞共培养,流式细胞术检测CD8~+T细胞耗竭情况。(3)动物实验:小鼠皮下成瘤模型,鼠尾静脉注射p53不同状态肝癌细胞来源的外泌体,记录肿瘤体积大小和重量,流式细胞术检测肿瘤与脾脏CD8~+T细胞耗竭情况。3.3探讨p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进CD8~+T细胞耗竭的具体机制(1)外泌体释放量实验:以p53 R249S突变型肝癌细胞和p53空载肝癌细胞相互比较,western blot检测外泌体释放相关蛋白表达。收集肝癌细胞释放的外泌体,NTA检测外泌体大小、释放量的变化。综合判断p53 R249S突变能否影响肝癌细胞的外泌体释放。(2)CD8~+T细胞摄取外泌体实验:将Di D染料标记的外泌体与CD8~+T细胞共培养,免疫荧光验证CD8~+T细胞对外泌体的摄取。(3)探究外泌体中引起CD8~+T细胞耗竭的关键内容物:蛋白组学分析筛选差异蛋白。western blot和PCR验证肝癌细胞及其分泌的外泌体中SHP2水平。将外泌体与CD8~+T细胞共培养,western blot验证CD8~+T细胞中SHP2水平。实验结果:1.体内外实验证明了p53 R249S突变型肝癌细胞促进CD8~+T细胞耗竭。2.体内外实验证明了p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进了CD8~+T细胞耗竭。3.p53 R249S突变对肝癌细胞外泌体的释放量和释放相关蛋白无影响,并且CD8~+T细胞能neurogenetic diseases够摄取不同来源外泌体,p53 R249S突变肝癌细胞可以释放携带SHP2的外泌体递送到CD8~+T细胞并促进其耗竭。结论:1.p53 R249S突变型肝癌细胞能够促进CD8~+T细胞耗竭。2.p53 R249S突变型肝癌细胞来源的外泌体促进CD8~+T细胞的耗竭。3.p53 R249S突变肝癌细胞可以通过释放携带SHP2的外泌体递送至CD8~+T细胞进而促进CD8~+T细胞耗竭。
核酸适配体筛选与亲和力评价技术主要研究方向、进展与挑战
核酸适配体是一类具有特异性分子识别能力的单链DNA或者RNA分子，通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到。核酸适配体相比抗体具有热稳定性高、便于化学合成与修饰、免疫原性低等优点，在生Protein Tyrosine Kinase抑制剂物分析、生物医学、生物技术等众多领域引起广泛关注。高质量的核酸适配体是应用的基础，然而目前能够满足实际应用的核酸适配体数量还非常有限。如何获得高亲和力、高特异性、高体内稳定性的核酸适配体是核酸适配体领域的技术瓶颈。本文首先简单介绍了SELEX技术的基本原理和核酸库的设计、筛选过程监控、次级文库制备、测序和候选适配体筛选等关键步骤。接着归纳总结了30多年来核酸适配体筛选技术的6个主要研究方向、研究进展和局限性。这6个主要研究方向分别是提高适配体特异性的筛选方法、提高适配体稳定性（抗核酸酶降解能力）的筛选方法、快速筛选方法、复杂靶标适配体筛选方法、小分子靶标适配体筛选方法、提高适配体亲和力的筛选方法。其中快速筛选技术是长期以来持续关注的研究方向，几乎所有物理分离手段都已用于提高SELEX的筛选效率。最近，高效化学反应与SELEX技术的结合为核酸适配体的快速筛选提供了新的策略。本文随后对适合小分子靶标核酸适配体筛选的3类方法进展和存在的问题进行了重点评述。这3类方法分别是基于靶标固定的筛选技术、基于文库固定的筛选技术（捕获-SELEX,Capture-SELEX）和均相筛选技术（氧化石墨烯-SELEX,GO-SELEX）。基于靶标固定hematology oncology的筛选技术尽管存在空间位阻等众多问题，由于其操作的简单性，目前依然应用广泛。近年来Capture-SELEX应用广泛。结合36种靶标适配体的筛选实验条件（文库设计、正筛靶标浓度、负筛靶标的选择和浓度）和所获得的适配体的亲和力（K_D，解离常数，dissociation constant）和特异性，对Capture-SELEX的实验条件与适配体性能的关系进行了讨论。统计数据表明，降低正筛靶标浓度有利于提高适配体的亲和力，但不是必要条件。负筛选是目前提高适配体特异性的主要技术手段，但适配体的特异性还不能满足实际需求。负筛选靶标及其浓度的选择差异很大，而且36种靶标中有20种靶标的适配体筛选没有进行负筛选。如何提高核酸适配体的特异性是目前小分子靶标核酸适配体所面临的难题，www.selleck.cn/products/ch-223191急需寻找新的策略。本文还列表归纳了近三年利用GO-SELEX进行的13种小分子靶标的实验条件和所获得的适配体的K_D和特异性。统计数据表明，GO-SELEX比Capture-SELEX所需要的筛选轮数少，两种方法所获得的适配体的亲和力多在纳摩尔每升水平。Capture-SELEX相对较低的筛选效率应该主要由于文库的自解离问题。核酸适配体的亲和力评价是候选核酸适配体结构与性能评价的重要组成部分。常用的核酸适配体亲和力评价技术包括基于分离、基于固定、均相体系三大类十多种方法。假阳性和假阴性是各种评价技术都有可能存在的问题。本文以纳米金比色法和等温热滴定技术为例评述技术进展，讨论导致不同亲和力评价技术结果不一致性问题的根本原因。本文最后对核酸适配体筛选技术、亲和力评价技术和技术的标准化的未来发展趋势进行了展望。
曲妥珠单抗与帕妥珠单抗双靶向联合化疗药物在人表皮生长因子受体2阳性乳腺癌新辅助治疗中的效果以及影响因素
目的 分析曲妥珠单抗与帕妥珠单抗双靶向联合化疗药物(紫杉类+卡铂)在人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌新辅助治疗中的效果以及影响因素。方法 收集2020年6月1日至2022年3月31日在首都医科大学附属北京妇产医院乳腺科诊断为HER-2阳性的Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌的41例女性患者的临床资料进行回顾性分析。观察临床疗效，评估新辅助治疗后手术切除标本的病理学完全缓解(pCR)状态并通过残余肿瘤负荷分级评估病理疗效，评价用药安全性；分析影响新辅助治疗后pCR的相关因素。结果 41例患者临床总缓解率为90.2%(37/41),病理有效率为78.0%(32/41)。未出现严重不良事件。单因素分析结果显示淋巴结转移、组织学分级、脉管癌栓、孕激素受体、激素受体水平是影响pCR的相关因素，差异均有统计学意义(均P<0.05)此网站。多因素分析结果显示，激素受体阳性(比值比=5.625)、高组织学分级(比值比=4.278)、淋巴结转移(比值比=7.333)及脉管癌栓(比值比=6.000)是影响HER-2阳性乳腺癌患者新辅助治疗后pCR的独立危险因素(均P<0.05)。结论 曲妥珠单抗与帕妥珠单抗双靶向联合化疗药物新辅助治疗HER-2阳性乳腺癌患者immune diseases效果显著，激素受体阳性、高组CSF-1R抑制剂织学分级、淋巴结转移与脉管癌栓是影响pCR的独立危险因素。
脑增生性血管病的临床特征与处理：1例案例报道并文献复习
目的:报道并随访1例脑增生性血管病(CPA)患者,回顾目前国内外相关文献,总结该疾病临床特征及处理方案。方法:分析1例CPA患者的临床病例,对该名患者进行病情循证,包括病史、体格检查、影像学检查、实验室检查,评估患者病情,给予相应的诊断与治疗,并对患者病情进行随访。通过对国内外相关文献的回顾,进一步探讨其发病机制、诊断和bio-based crops治疗方法。结果:(1)患者76岁男性,因“头晕头痛、左侧购买Tamoxifen肢体麻木无力1月余”入院。神经系统检查:患者神志清楚,精神一般,言语清晰,理解力正常,定向力、记忆力减退,双瞳孔等大等圆,光反射灵敏,双眼水平眼震阳性,双眼向左视物模糊,口角无明显歪斜,伸舌居中,颈软,克布氏征(-),左侧肢体肌力Ⅳ级,右侧肢体肌力V级,左侧肢体浅感觉减退,左侧病理征阳性。(2)实验室检查结果:患者血常规检查、止凝血、肝肾功能、尿常规、粪便隐血加常规、免疫十一项、甲功三项、肿瘤十二项、血糖、ANCA/ACL全套等均未见显著异常,脑脊液常规显示潘氏反应阳性,脑脊液墨汁染色、革兰染色霉菌、细菌、结核菌涂片正常,脑脊液生化显示蛋白0.61 g/L、微量白蛋白528 mg/L、免疫球蛋白57 mg/L,脑脊液糖、氯正常,血清副肿瘤性神经综合征抗体谱检测结果为阴性。(3)影像学检查结果:胸腹盆腔计算机断层扫描(CT)结果提示两肺炎症、两侧胸膜增厚、前列腺钙化、膀胱前方正中致密影,考虑脐尿管结石可能、腹部CT平扫未见明显异常。脑磁共振成像(MRI)平扫结果显示右侧颞叶、顶叶、枕叶和胼胝体存在大面积脑梗死,并伴有轻微出血和胶质增生。脑增强MRI显示右侧颞枕交界区及胼胝体不规则环状增强,右侧脑室后角受压。此外,脑磁共振静脉造影(MRV)显示右侧髓静脉早显,通过右侧脉络丛静脉引流至环池深部静脉丛,右侧大脑中动脉(MCA)分支增多,上矢状窦、下矢状窦、右侧横窦、右侧乙状窦及扫及颈内静脉未见明显充盈缺损。头颈部计算机断层摄影血管造影(CTA)扫描结果显示双侧颈内动脉(ICA)轻度狭窄,右侧MCA增生,两侧大脑前动脉(ACA)粗细不均,右侧大脑后动脉(PCA)纤细。脑数字减影血管造影(DSA)结果显示右侧MCA供血区有大量增生血管形成,静脉显影稍提前,右侧ACA的A4段亦可见少量增生血管,左侧MCA、ACA未见明显异常,椎动脉造影可见右侧PCA的P3段、P4段大量增生血管,并可见引流静脉明显早现,左侧PCA未见明显异常。(4)临床诊断:定位诊断:患者老年男性,查体示:左Emricasan侧肢体肌力差、左侧肢体浅感觉减退,定位诊断于右侧皮质脊髓束、右侧脊髓丘脑束或其皮层投射纤维,患者无脑干交叉瘫、真性球麻痹等脑干体征,考虑前循环右侧大脑半球可能性大;定向力、记忆力减退,定位于大脑高级皮质功能,双眼向左视物模糊,定位于右侧枕叶;定性诊断:患者胸腹盆腔CT、副肿瘤综合征及肿瘤十二项检查结果均未见明显异常,故颅内肿瘤诊断不考虑。脑脊液检查示:潘氏反应阳性,白细胞数正常,蛋白0.61 g/L、微量白蛋白528 mg/L、免疫球蛋白57 mg/L,糖、氯正常,脑脊液墨汁染色、革兰染色霉菌、细菌、结核菌涂片正常,血常规、止凝血、肝肾功能、尿常规、粪便隐血加常规、免疫十一项、甲功三项、血糖、ANCA/ACL全套等均未见显著异常,故脑炎性病变亦不考虑。排除上述诊断后,结合患者头颅影像学检查可确诊为脑增生性血管病。(5)治疗与随访:考虑到患者年龄较大,身体素质较差,手术治疗的风险太高,患者家人拒绝手术,采取保守治疗,以降低颅内压和补充液体作为主要的治疗方法。在随后的1年随访过程中,患者的症状逐渐加重,并伴有意识障碍,最终去世。结论:与常见缺血性脑血管病相比,CPA在其流行病学、病理学、影像学特点、并发症表现、以及治疗方面既有一定的相通性,亦具一定的独特性,值得深入研究和探索点。
功能超分子自组装纳米材料原位构建与缓解癌症耐药研究
日益增长的癌症发病率逐渐成为威胁人类健康发展的主要原因之一,癌症耐药与转移作为癌症化疗失败的主要元凶,特别是癌症耐药问题,目前已经成为癌症化疗过程中最迫切需要解决的问题。纳米材料的发展为纳米医学研究奠定了基础,以超分子纳米材料为代表的医用纳米材料逐渐在医学研究中崭露头角。超分子纳米材料易于修饰,其设计能够从癌症特点出发进行。以药物外排引起多药耐药为研究出发点,利用超分子纳米材料易于修饰的特点,选择性连接了新型具有荧光特点的线粒体靶向基团喹唑啉酮衍生物(BQA)作为分子靶向部分和荧光定位部分,同时在多肽另一端侧链基团上连接了具有抗癌潜力的治疗Ⅱ型糖尿病经典药Protein Tyrosine Kinase抑制剂物二甲双胍。该纳米材料能够在耐药癌细胞高活性氧(ROS)水平作用下,在线粒体内选择性聚集和发生自组装。首先设计合成了超分子自组装纳米材Fasciotomy wound infections料的主体部分—多肽链,然后在偶联作用下加上修饰功能基团BQA和二甲双胍;再通过核磁和质谱验证后得到目标分子BQA-GGFFK-Met(BPM),验证该分子在氧化还原环境中的组装性能及稳定性,加入双氧水后,可以观察到该分子能够形成凝胶形态,利用旋转流变仪检测到所生成的凝胶具有良好凝胶特性。在细胞外水平下确认分子性能后,进一步对该分子癌细胞耐药缓解效果进行验证。结果显示在BPM作用后耐药细胞对阿霉素(Dox)半抑制浓度降低了 96.5%,证实了 BPM具有良好的缓解癌症耐药作用。通过一系列癌细胞缓解耐药机理验证发现BPM分子抑制耐药癌细胞内34.1%三磷酸腺苷(ATP)的产生,同时使细胞内活性氧水平提升至150%。并且二甲双胍抑制了细胞内线粒体ATP产生,同购买MRTX849时引发信号通路AMP活化蛋白激酶(AMPK)激活。同时BPM作用引发线粒体膜电位降低,进一步启动癌细胞凋亡程序。该项工作合成的功能超分子纳米材料BPM具有良好自组装性能,且能很好地缓解阿霉素耐药,也为后续超分子自组装纳米材料缓解耐药研究提供一些参考。
低分子肝素钙对2型糖尿病合并脑梗死患者神经功能及日常生活能力的影响
目的 观察低www.selleck.cn/products/mrtx1133分子肝素钙对2型糖尿病（T2DM）合并脑梗死患者神经功能及日常生活能力的影响。方法 随机将2020年6月至2023年1月九江市第一人民医院收治的T2DM合并脑梗死患者74例分为两组，各37例。对照组给予常规降Genetic research糖、脑卒中二级预防等治疗，在此基础上观察组给予低分子肝素治疗，连续治疗15 d。比较两组血液流变学指标、神经功能、日常生活能力和不良反应发生情况。结果 Talazoparib IC50治疗15 d后两组高切黏度、低切黏度、血浆黏度、纤维蛋白原均降低，且观察组改善更显著（P<0.05）；治疗15 d后两组NIHSS评分降低，且观察组改善更显著（P<0.05）；治疗15 d后两组Barthel指数提高，且观察组改善更显著（P<0.05）；两组治疗期间未见严重不良反应。结论 低分子肝素钙治疗可有效改善T2DM合并脑梗死患者血液微循环，促进受损神经功能恢复，提高日常生活能力，且具有较高的治疗安全性。
红花类黄酮生物合成相关MYB63基因的克隆及功能研究
红花(Carthamus tinctorius L.)是我国传统的中草药,花色鲜红,故称红花。红花类黄酮(Safflower flavonoids)是红花的主要有效成分,被广泛应用在冠心病、高血压、脑梗塞、抗肿瘤、糖尿病并发症等疾病上,其需求量较大。近几年虽然红花种植面积在我国不断扩大,但仍未能解决红花类黄酮化合物资源匮乏问题。因此,提高红花自身类黄酮化合物的含量,培育高类黄酮含量的红花新品系,具有重要意义。转录因子在植物次生代谢合成中发挥重要调节作用,相关文献表明与类黄酮生物合成的转录因子主要有MYB、b HLH、WD40、b ZIP等。本研究重点关注红花中的MYB转录因子,在红花基因组测序基础上,筛选并鉴定了红花MYB家族成员,分析了其家族的表达模式,筛选出CtMYB63基因;对CtMYB63基因进行克隆及亚细胞定位分析,并进一步通过在拟南芥中过表达CtMYB63基因,通过在红花瞬时转化体系中过表达和沉默CtMYB63来研究该基因在类黄酮积累中的功能。具体研究结果如下:1.从基因组数据库中筛选出440个MYB蛋白,构建系统进化树,将红花MYB基因家族分为12个亚类。通过基因结构分析表明R2R3-MYB蛋白具有保守结构域;CtMYB基因启动子中存在光响应、茉莉酸甲酯响应等顺式作Berzosertib细胞培养用元件。2.CtMYB基因表达分析表明,其中7个MYB基因在花瓣衰落期高表达,17个MYB基因在茎中高表达,9个MYB基因在根中高表达,其中CtMYB63基因和CtMYB77基因在叶片中高表达,而CtMYB63基因表达量最高。3.成功克隆一条编码区为912 bp长度的CtMYB63基因。构建pCAMBIA1302-CtMYB63表达载体,通过Puerpal infection亚细胞定位实验证明该基因定位在细胞核。4.构建植物表达载体pCAMBIA3301-CtMYB63并转化拟南芥,获得OE-8和OE-9两株高表达株系以及COM4和COM8两株回补株系,比较不同株系拟南芥之间的表型发现,高表达拟南芥叶片颜色最深,叶片大小也最大;突变体回补株系VX-765使用方法无论叶片颜色还是大小均有回升。通过Me JA胁迫处理,说明其促进类黄酮积累,且CtMYB63基因对外源茉莉酸甲酯(Me JA)胁迫具有一定的敏感性。紫外光(UV-B)胁迫下,高表达株系存活率最高,野生型株系次之,突变体株系最低;通过丙二醛(MDA)含量变化和DAB、NBT染色,表明过表达拟南芥在UV-B胁迫下的受伤害程度最小,说明CtMYB63基因对紫外光(UV-B)具有一定的耐受性。5.构建红花叶片瞬时转化体系,利用超表达和基因沉默技术(VIGS)对红花叶片进行侵染,随后在Me JA胁迫和UV-B胁迫下显示:CtMYB63基因在瞬时过表达中显著上调,与类黄酮代谢途径中的下游结构基因(CtCHI1、CtDFR1、CtFLS1和Ct4CL1)表达量呈正相关,且总黄酮、花青素、原花青素含量显著升高,而DAB、NBT染色程度最浅受损伤最小。沉默株系与之相反。整体结果与拟南芥相似,再次验证CtMYB63基因促进类黄酮积累且对这两种胁迫下具有一定的敏感性和耐受性。
青光眼患者角膜滞后量与视网膜神经纤维层厚度之间的关系
目的 探讨青光眼患者角膜滞后量(CH)与视网膜神经纤维层(RNFL)厚度之间的关系。方法 选取我院眼科收治的开角型青光眼患者133例Tamoxifen(186眼)作为研究对象，随访时间为(3.8±0.8)年，平均随访9次。采用眼反应分析仪测量患者CH,在每次随访时采用SD-OCT测量患者RNFL厚度。采用Stata软件进行数据分析。年龄、基线CH、眼压和中央角膜厚度(CCT)与RNFL厚度的关系用单变量和多变量线性回归模型进行统计分析。结果 本组186眼，基线CH为(9.2±1.8)mmHg(1 kPa=7.5 mmHg),RNFL厚度为(76.4±18.1)μm,眼压为(13.8±3.7)mmHg, CCT为(533±42)μm。单变量模型分析结果显示，在随访期间基线CH与RNFL厚度具有正相关关系(P<0.05),CH越低，RNFL越薄，CH每降低1 mmHg, RNFL厚度减少0.13μm,提示低CH可能参与青光眼的发生和进展。单变量模型分析结果还显示，眼压与RNFL厚度具有显著负相关性(P<0.05),眼压越高，RNFL越薄。但年龄和CCT与RNFL厚度均无明显相关关系(均为P>0.05)。多变量模型分析结果显示，排除年龄、眼压和CCT影响后，在随访期间基线CH仍然与RNFLCH-223191分子式厚度具有显著正相关性(P<0.05)。CH每降低1 adolescent medication nonadherencemmHg, RNFL厚度同样减少0.13μm。结论 青光眼患者基线CH与RNFL厚度具有正相关关系，CH越低，RNFL越薄，低CH可能参与青光眼的发生和进展。
调控p62观察通腑养髓方对Wilson病模型神经元铁死亡损伤的保护机制
Wilson病(Wilson’s disease,WD)是一种由ATP7B基因突变导致的常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病,是神经遗传病领域重点防治的疾病。课题组前期临床研究发现,脑型WD患者(尤其是出现严重运动障碍和病程较长的难治性脑型WD患者)常规驱铜治疗的疗效差,病情康复缓慢,生活质量和学习、工作能力明显下降,严重者甚至危及生命。因此,研究WD神经细胞的损伤机制及治疗策略对改善脑型WD患者的病情和预后有重要意义。基于WD诊疗的临床需求,课题组根据脑型WD患者的中医辨证研究结果,创用通腑养髓方治疗脑型WD患者获得显著疗效。基于相关基础和临床研究发现,WD除铜代谢障碍外还存在铁代谢障碍,这可能是其治疗效果不佳的原因之一。近期研究发现,一种铁依赖性非程序性细胞死亡方式(铁死亡)参与了多种神经遗传变性病的发生发展,与脑型WD的神经细胞损伤机制相契合,泛素结合蛋白(ubiquitin-binding protein,p62)-Kelch样ECH相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)-核因子E2-关联因子(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)信号通路是调控铁死亡的一个重要通路,是WD神经细胞损伤的潜在治疗靶点。课题组前期以WD模型TX乳鼠皮质神经元为研究对象的结果发现,WD神经元存在铁死亡损伤,p62-Keap1-Nrf2通路中Nrf2是调控TX小鼠神经元铁死亡的一个重要环节。有研究发现,p62是p62-Keap1-Nrf2通路的上游环节,可与Nrf2竞争结合Keap1,阻止Nrf2的降解,在通路调节中起关键作用。并有研究指出,发生铁死亡的神经细胞免疫荧光染色检测转铁蛋白受体(transferrin receptor,Tf R)表达水平增加、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平升高,并出现阳离子转运调控样蛋白1(cation transport regulator-like protein1,CHAC1)、过氧化物合酶2(peroxide synthase2,PTGS2)等铁死亡相关基因的表达异常,是铁死亡的特异性指标。基于此,本研究假设通腑养髓方通过激活p62抑制TX小鼠脑内铁死亡而具有对WD神经元损伤的保护作用,通过抑制p62的表达观察通腑养髓方治疗TX小鼠脑内Tf R表达水平、MDA水平,CHAC1、PTGS2等铁死亡相关基因的表达以及铁死亡相关蛋白的表达水平,并探讨其神经元损伤的保护机制。目的:调控p62观察通腑养髓方对WD神经元铁死亡的干预效应,并探讨通腑养髓方作用的具体环节与位点。方法:1.体外实验:制备通腑养髓方含药大鼠血清;Elisa法检测各组MDA水平;采用TUNEL染色法观察各组小鼠海马神经元损伤;荧光定量PCR的检测各组铁死亡相关基因表达;。2.体内实验:透射电镜观察线粒体超微结构;Fluoro-Jade B(FJB)染色观察小鼠神经细胞损伤程度;免疫荧光技术检测各组小鼠海马TStochastic epigenetic mutationsf R的表达量;Elisa法检测各组MDA水平;荧光定量PCR的检测各组铁死亡相关基因表达;Western Blotting法分析各组铁死亡相关蛋白及通路相关蛋白的表达。结果:1.小鼠丙二醛MDA水平的表达:与DL组比较,TX组脑内MDA水平显著上升(P<0.01);与TX组比较,TX+DFO组和模型+Fer-1组脑内,MDA水平显著下ICI 46474采购降(P<0.01)。与NC组相比,MOD组、NC+Fer-1组MDA水平显著升高(P<0.01);与MOD组相比,MOD+DFO组、MOD+Fer-1组MDA水平显著降低(P<0.01)。与TX组比较,TX+TFYS组MDA水平显著下降(P<0.01);治疗后TX+sip62;与MOD组相比,MOD+TFYS组MDA水平显著降低(P<0.01)。2.各组小鼠线粒体结构的观察:DL组、DL+DFO组、DL+Fer-1组小鼠脑组织细胞线粒体结构正常;TX组小鼠脑组织细胞线粒体膜皱缩,嵴数量减少或消失,出现空泡;TX+DFO组、TX+Fer-1组与TX组比较,线粒体膜平滑,嵴数量增加,损伤程度减轻。TX+sip62组小鼠脑组织细胞线粒体膜皱缩,嵴数量减少或消失,出现空泡;TX+TFYS组、TX+sip62+TFYS组与TX组比较,线粒体膜平滑,嵴数量增加,损伤程度减轻。3.各组小鼠CHAC1、PTGS2m RNA的表达:与DL组比较,TX组CHAC1、PTGS2m RNA均显著升高(MRTX849分子量P<0.01);与TX组比较,TX+DFO组、TX+Fer-1组CHAC1、PTGS2m RNA均显著降低(P<0.01);与DL组比较,DL+DFO组、DL+Fer-1组CHAC1、PTGS2m RNA无显著差异。与DL组比较,TX组、TX+sip62组CHAC1、PTGS2m RNA均显著升高(P<0.01);与TX组比较,TX+TFYS组、TX+sip62+TFYS组CHAC1、PTGS2m RNA均显著降低(P<0.01)。4.通腑养髓方对Tf R表达水平的影响:与DL组比较,TX组Tf R表达水平显著增加(P<0.01);与TX组比较,TX+DFO组Tf R表达水平显著减少(P<0.01)。5.通腑养髓方减轻小鼠皮质神经细胞的损伤:与DL组比较,TX组、TX+sip62组小鼠皮质神经细胞损伤程度显著增加(P<0.01);与TX组比较,TX+TFYS组、TX+sip62+TFYS组皮质神经细胞损伤程度显著减少(P<0.01)。6.通腑养髓方减轻海马神经元的凋亡:与MOD组比较,MOD+TFYS组海马神经元凋亡数目显著减少。7.通腑养髓方对铁死亡通路相关蛋白表达的影响:与DL组相比,TX组小鼠脑内GPX4蛋白表达水平显著下降(P<0.01),Tf R、ACSL4蛋白水平显著上升(P<0.01)。与TX组相比,TX+DFO组、TX+Fer-1组小鼠脑内GPX4蛋白表达水平显著上升(P<0.01),Tf R、ACSL4蛋白水平显著下降(P<0.01)。与DL组相比,TX组、TX+sip62组小鼠脑内GPX4蛋白表达水平显著下降(P<0.01),Tf R、ACSL4蛋白水平显著上升(P<0.01),p62磷酸化显著降低(P<0.01)。与TX组相比,TX+TFYS组、TX+sip62+TFYS组小鼠脑内GPX4蛋白表达水平显著上升(P<0.01),Tf R、ACSL4蛋白水平显著下降(P<0.01),p62磷酸化显著升高(P<0.01)。结论:p62-Keap1-Nrf2通路在TX小鼠神经元铁死亡的发生中发挥重要作用;通腑养髓方通过促进p62的磷酸化,显著减少铁死亡导致的神经元损伤,降低TX小鼠神经元氧化应激水平,起到WD神经保护的作用。
非维生素K拮抗剂口服抗凝药对心房颤动射频消融术中活化凝血时间达标的影响
目的 研究非维生素K拮抗剂口服抗凝药(NOAC)对心房颤动(简称房颤)射频消融术中活化inborn genetic diseases凝血时间(ACPLX4032小鼠T)的影响，为制定更优的肝素负荷方案，提高ACT达标率提供一定依据。方法 按入选排除标准纳入自2019年10月至2021年11月在徐州医科大学附属医院心内科行射频消融术的房颤患者。术前抗凝方案为达比加群酯(110 mg, 2次/天)、利伐沙班(15 mg, 1次/天)。患者均给予100U/Kg首剂肝素，在肝素给药前及初始肝素给药后30min(30min-ACT)及其后每30min测定ACT值。按30min-ACT分为：达标组(ACT≥250 s),未达标组(ACT<250 s)。按基础ACT分为基础ACT≤145 s; 145 s