目的 探讨血液涂片细胞形态学、全自动血细胞分析仪联合检查的应用价值。方法 选取在我院行血常规检验的52例患者，均接受血selleck CH-223191液涂片细胞形态学和全自动血细胞分析仪检查。对比血液涂片细胞形态学、全自动血细胞分析仪及联合检测对血常规指标、血细胞与血小板阳性检出率。结果 血液涂片细胞形态学、全自动血细胞分析仪联合检测对淋巴细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、单核细胞与中性粒细胞阳性检出率分别为91.94%、90.32%、88.71%、85.48%、90.32%，均高于单一检测（P<0.05）；血液涂片LY-188011分子量细胞形态学、全自动血细胞分析仪联合检测对红细胞、白细胞、血小板阳性检出率分别为90.32%、87.10%、92.31%，均高于单一检测（P<0.05）。结论 在血常规检查中使用血液涂片细胞形态学、全自动血细胞分析仪联合检查可提高各指标阳性检出率，为临床诊治提供CSF biomarkers参考。
烟曲霉Hsp70和HscA的抗原性、免疫原性及其潜在临床意义研究
研究背景:曲霉菌属是种广泛存在于自然环境中的机会性致病真菌,主要通过吸入的方式感染机体,由曲霉菌引起的侵袭性肺炎和血行播散性感染,称之为侵袭性肺曲霉病(Invasive pulmonary aspergillosis,IPA)或侵袭性曲霉病(Invasive aspergillosis,IA),其中烟曲霉是临床最为常见的曲霉菌。IA是最致命的曲霉病,尽管真菌感染的治疗及护理手段已经取得了不小的进步,但IA死亡率仍居高不下。IA的高感染率和死亡率,决定了其早期诊断以及及时治疗的重要意义与价值,由于烟曲霉感染没有较为特异的临床特征,细菌/真菌培养需要一定周期,因此IA的早期诊断较为棘手,易被误诊。有研究显示Sensors and biosensors,IA的误诊率可高达73%。近年有研究指出烟曲霉Hsp70和Hsc A分布于菌体表面并有可能具有诱导保护性免疫反应或介导免疫逃避的抗原表位,故此本研究对Hsp70和Hsc A的抗原性及免疫原性分别进行评估以探究其作为烟曲霉血清学检测候选抗原或疫苗靶点的潜点击此处力。方法:此次研究通过构建重组Hsp70和Hsc A质粒并利用原核表达载体表达重组蛋白,然后利用镍离子凝胶亲和柱进行蛋白纯化,注射纯化后的Hsp70和Hsc A于实验动物进行免疫。然后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测临床烟曲霉感染的患者以及Hsp70/Hsc A免疫后小鼠的血清/血浆中特异Ig G抗体及其Ig G亚型水平。此外,本研究利用体外试验,进一步探究经Hsp70/Hsc A免疫后小鼠脾细胞的抗原特异性免疫应答和Th1/Th2/Th17型细胞因子分泌模式。最后,利用流式细胞术探究经Hsp70/Hsc A免疫后小鼠外周血/脾脏的淋巴细胞亚群分类特征等。结果:成功表达重组蛋白并免selleck抑制剂疫小鼠,经Hsp70或Hsc A免疫后小鼠外周血中皆存在识别烟曲霉菌体蛋白Ig G型抗体。另外,临床烟曲霉感染患者的Hsp70特异性Ig G水平高于未感染对照组(Hsp70 AUC=0.8400,cut-off值>1.089,敏感度为76.00%,特异度为86.67%)。Hsp70免疫后小鼠的血浆中存在Hsp70特异性Ig G抗体,Ig G亚型分析显示Ig G1是其主要型别。Th1型、Th2型和Th17型的细胞因子均有分泌。Hsp70免疫后小鼠外周血/脾脏的B淋巴细胞百分比均低于对照组,而脾脏T淋巴细胞百分比高于对照组。同样地,烟曲霉感染患者中Hsc A特异性Ig G水平显著地高于未感染的对照患者(Hsc A AUC=0.9867,cut-off值>1.008,敏感度为96.00%,特异度为100.00%)。经过Hsc A蛋白免疫后的小鼠宿主外周血中亦可检测到可观的针对Hsc A蛋白特异性Ig G抗体,其Ig G亚型也主要表现为Ig G1型。该免疫小鼠体内亦存在Th1型、Th2型和Th17型的细胞因子分泌。经Hsc A免疫后该类小鼠外周血/脾脏的主要淋巴细胞亚群分类比例同对照组无显著性差异。结论:研究结果显示本研究中临床烟曲霉感染患者体内明确地存在针对烟曲霉Hsp70与Hsc A的抗体;通过检测外周血烟曲霉Hsp70和/或Hsc A抗体水平,在辅助判断宿主是否存在烟曲霉感染方面,具有较高的敏感度和特异度且Hsc A优于Hsp70;实验结果显示此两种蛋白皆具有良好的抗原性及免疫原性,都可诱导Th1/Th2/Th17型细胞因子分泌和更好的细胞及体液免疫应答,包括高水平Ig G1抗体的产生;提示Hsp70/Hsc A具有成为诊断烟曲霉感染候选抗原及疫苗靶点的潜在价值。
乌司他丁联合依诺肝素治疗脓毒症并发急性肺损伤临床疗效及安全性研究
目的:探讨乌司他丁联合依诺肝素在脓毒症并发急性肺损伤患者治疗中的应用价值。方法:选取118例脓毒症并发急性肺损伤患者为研究对象，根据治疗方法不同分为对照组、乌司他丁组和乌司他丁+依诺肝素组三组。对照组采用常规方法治疗，乌司他selleckchem丁组和乌司他丁+依诺肝素组在对照组常规方法治疗的基础上分别给予乌司他丁和乌司他丁联合依诺肝素治疗。观察三组患者治疗前后呼吸功能指标血氧分压(PaO_2)、氧合指数(PaO_2/FiO_2)、肺血管外肺水指数(ELWI)、血清炎症因子白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)水平、肺PD0325901溶解度损伤预测评分(LIPS)、急性生理和慢性健康状况(APACEⅡ)评分、全身性感染相关性器官功能衰竭(SOFA)评Unlinked biotic predictors分和视觉模拟疼痛评分(VAS)以及疗效。结果:对照组、乌司他丁组和乌司他丁+依诺肝素组呼吸功能指标PaO_2、PaO_2/FiO_2均较治疗前升高，且乌司他丁+依诺肝素组显著高于对照组和乌司他丁组，而ELWI则均较治疗前显著下降(P<0.05)。对照组、乌司他丁组和乌司他丁+依诺肝素组炎症因子水平IL-6、TNF-α、CRP和PCT,肺功能相关评分LIPS评分、APACHEⅡ评分、SOFA评分和VAS评分均较治疗前显著降低，且乌司他丁+依诺肝素组显著低于对照组和乌司他丁组，组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。乌司他丁+依诺肝素组的总有效率(97.0%)显著高于对照组(82.0%)和乌司他丁组(88.0%),而发生急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、使用有创机械通气和28 d病死率均显著低于对照组和乌司他丁组(均P<0.05)。结论:乌司他丁联合依诺肝素可改善脓毒症并发急性肺损伤患者肺功能和凝血异常，减轻炎性反应和疼痛，临床效果显著、安全性高。
基于单细胞测序分析肿瘤相关巨噬细胞来源的半乳糖凝集素3的功能
目的：从肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在化疗前后的表型变化入手，寻找通过调控肿瘤免疫微环境（TIME）从而影响肿瘤治疗效果和预后的功能分子。方法：利用欧洲核苷酸数据库（ENA）的PRJEB45598数据集，分析进展期胃癌患者化疗前后活检肿瘤组织单细胞测序数据，采用主成分分析（PCA）和一致流形近似与投影（UMAP）降维，获得31个亚群细胞，并进一步进行TAM亚型分析、差异基因筛选，寻找化疗后M2型TAM中高表达的基因。通过黑色素瘤B16-F10细胞皮下移植瘤模型验证化疗前后特定基因m RNA和蛋白水平表达变化，并通过Incucyte体外分析该蛋白是否调控化疗药物诱导的肿瘤细胞死亡。结果：聚Neuroscience Equipment焦单细胞测序数据中M2型TAM的特征表达基因，发现半乳糖凝集素3(LGALS3)在胃癌化疗后m RNA水平显著升高（P<0.01），在多种肿瘤中LGALS3高表达且与患者生存期呈负相关（P<0.05或P<0.01）。黑色素瘤B16-F10细胞移植瘤模型中，LGALS3在M2型TAM中高表达（P<0.01），且奥沙利铂化疗后表达进一步升高（P<0.05）。体外对肿瘤细胞给予重组LGALS3蛋白可抑制3-MA抑制剂化疗药物奥沙利铂诱导的肿瘤细胞死亡（P<0.01）。结论：奥沙利铂化疗后的M2型TAM通过合成和分泌LGALS3促进黑色素瘤细胞的化疗抵抗，因此通过免疫治疗的方法靶向LSTM2457体内GALS3分子可能有效提高肿瘤的治疗效果。
黄瓜花叶病毒为骨架的多联弱毒疫苗构建和疫苗施用方案优化的研究
植物病毒病是危害植物生长最严重的病害之一,降低作物产量、影响品质,对我国农业经济造成巨大损失。弱毒疫苗交叉保护是预防植物病毒病的一种有效措施,但疫苗存在剂型单一、货架期短、单剂疫苗所能防治的靶标病毒有限等限制。鉴于病毒病的混合侵染特性,有必要研制能够兼抗多种植物病毒病的单剂多联弱毒疫苗,并优化疫苗的保存方式,延长其货架期。黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)是宿主数量最多、分布范围最广的植物病毒之一,并且其多节段基因组为致弱突变提供多个位置选择,在弱毒疫苗的研制中具有极大潜力。本研Negative effect on immune response究以黄瓜花叶病毒为基础疫苗载体骨架,构建单联双靶、双联三靶、三联四靶弱毒疫苗,同时比较不同低温保存法的疫苗保质期,为植物病毒病的防治提供弱毒疫苗材料和延长货架期的可行性方案。以构建的CMV_(Fny)RNA2弱毒突变体p CC_FR2-2b PTII、p CC_FR2-2b PTIII为疫苗基础载体。在弱毒突变体p CC_FR2-2b PTII中插入TVBMV不同保守区域的100 bp病毒片段(TVBMV_(7600-7699)、TVBMV_(7700-7799)、TVBMV_(8880-8979)、TVBMV_(8980-9079)),构建了4种单联双靶弱毒突变体;在弱毒突变体p CC_FR2-2b PTII中插入来源于TVBMV和TMV的共221bp不同组合片段(TVBMV_(7600-7699)TMV_(2158-2278)、TMV_(2158-2278)TVBMV_(7600-7699)),构建了2种双联三靶弱毒突变体;在弱毒突变体p CC_FR2-2b PTIII中插入来源于TVBMV、TMV和PVY不同排列顺序的共321 bp片段(TMV_(2158-2278)PVY_(517-616)TVBMV_(7600-7699)、TMVGSK2118436试剂2158-2278TVBMV7600-7699PVY517-616、PVY517-616TVBMV7600-7699TMV2158-2278、PVY517-616TMV2158-2278TVBMV7600-7699、TVBMV7600-7699PVY517-616TMV2158-2278、TVBMV_(7600-7699)TMV_(2158-2278)PVY_(517-616)),构建了6种三联四靶弱毒突变体。将各突变体分别与CMV_(Fny)野生型RNA1和RNA3混合后接种本氏烟,均显示弱致病性且具备良好的遗传稳定性。预先接种以上突变体7 d后进行靶标病毒的单独或混合挑战接种,对CMV的防效最好(72.0%～100%),对各靶标病毒也显示一定的防效(7.4%～46.2%)。在单联双靶弱毒突变体的交叉保护效果实验中,TVBMV的4种插入型突变体对TVBMV的交叉保护效果差异较明显,插入TVBMV_(7600-7699)片段的突变体对TVBMV和混合强毒的防效最好,分别为37.0%和22.2%;在双联三靶弱毒突变体的交叉保护效果实验中,各突变体对TVBMV、TMV以及混合强毒均表现良好的交叉保护效果,分别为40.0%～44.4%、32.0%～37.0%、24.0%～32.0%,对靶标病毒的防效与病毒片段插入顺序不显示明显相关性;在三联四靶弱毒突变体的交叉保护效果实验中,6种突变体对CMV、TVBMV、TMV和PVY单独或混合侵染均表现良好的交叉保护效果,对各靶标病毒单独侵染的防效分别为87.0%～100%、22.2%～46.2%、22.2%～44.4%和28.5%～44.4%,对混合强毒的防效为16.0%～37.0%,对靶标病毒的防效与病毒片段插入顺序不显示明显相关性。为指导田间应用和尽可能地降低疫苗使用成本,需要确定疫苗稳定存在的接种起始浓度范围。对突变体p CC_FR2-2b PTII以及插入100 bp、221 bp异源病毒片段的突变体(起始菌液OD_(600)=1.2)的稀释限点进行分析。突变体p CC_FR2-2b PTII稀释10~1～10~5倍后接种,仍然具备良好的遗传稳定性,病情指数为3.7～26.0,维持弱毒特征;插入100 bp异源病毒片段的突变体在稀释10~4倍后开始出现一定比例的突变回复现象,在稀释10~5倍后基本已完全回复,病情指数达到48.1,显示一定的强毒特征;插入221 bp异源病毒片段的突变体在稀释10~3倍后开始出现突变回复现象,并随着稀释倍数增大,回复越完全,稀释10~5倍后接种的病情指数达到70.4,已回复为强毒。综上表明,疫苗使用过程中,过度稀释的起始接种浓度会导致疫苗稳定性下降。初始浓度OD_(600)=1.2的疫苗菌液在田间使用过程中建议稀释倍数不要超过10~2倍。为降低大体积菌液型疫苗的保存和长途运输成本,本研究比较分析了菌液型弱毒疫苗的3种低温保存方法(离心保存法、直接冻干保存法、离心冻干保存法)处理后的疫苗稳定性和交叉保护效果。离心保存法:高速离心去上清的疫苗菌体在两组低温下(4℃,-20℃)保存15 d,30 d或60 d后重悬接种,均表现良好的遗传稳定性,对CMV的交叉保护效果良好,随着保存时间的延长,相对防效逐渐降低,在4℃保存15 d,30 d和60 d后接种的相对防效为74.1%、51.9%和51.9%,在-20℃保存15 d,30 d和60 d后接种的相对防效为74.1%、59.3%和44.4%,而在28℃条件下保存15 d、30 d,疫苗仍具备良好稳定性,对CMV的交叉保护效果相比于两组低温保存来说更差,仅为37.0%、22.2%,而保存60 d后已完全回复至野生型,基本不再表现明显的交叉保护效果,相对防效只有7.4%。直接冻干保存法:菌液型疫苗经冻干机处理后的疫苗菌粉在4℃,-20℃保存30 d、60 d后重悬接种,均具备良好的遗传稳定性,且对CMV表现非常好的交叉保护效果,相对防效均在88.0%以上。离心冻干保存法:高速离心去上清的菌体经冻干机处理的疫苗菌粉在4℃,-20℃保存30 d、60 d后分别用灭菌水、纯水、自来水重悬接种,均具备良好的遗传稳定性,保存30 d的各处理组对CMV的相对防效达到72.0%以上,而保存60 d后用灭菌水重悬要优于用纯水、自来水重悬,在4℃保存重悬的整体相对防效(66.7%～100%)要高于在-20℃保存重悬的相对防效(66.7%～74.1%)。以上三种菌液型疫苗的低温冻存法,解决了菌液型疫苗不易大体积保存的难题,提高了长距离运输的便利性,同时也降低了成本。本研究筛选出了遗传稳定、兼抗多种病毒的12种多联弱毒疫苗,为相应种类的植物病毒病防治提供了疫苗材料;同时疫苗稀selleck HPLC释后稳定性分析以及3种低温保存法的比较,为疫苗应用过程中降低使用、保存、运输成本提供了数据支持。
基于单细胞测序分析肿瘤相关巨噬细胞来源的半乳糖凝集素3的功能
目的：从肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在化疗前后的表型变化入手，寻找通过调控肿瘤免疫微环境（TIME）从而影响肿瘤治疗效果和预后的功能分子。方法：利用欧洲核苷酸数据库（ENA）的PRJEB45598数据集，分析进展期胃癌患者化疗前后活检肿瘤组织单细胞测序数据，采用主成分分析（PCA）和一致流形近似与投影（UMAP）降维，获得31个亚群细胞，并进一步进行TAM亚型分析、差异基因筛选，寻找化疗后M2型TAM中高表达的基因。通过黑色素瘤B16-F10细胞皮下移植瘤模型验证化疗前后特定基因m RNA和蛋白水平表达变化，并通过Incucyte体外分析该蛋白是否调控化疗药物诱导的肿瘤细胞死亡。结果：聚Neuroscience Equipment焦单细胞测序数据中M2型TAM的特征表达基因，发现半乳糖凝集素3(LGALS3)在胃癌化疗后m RNA水平显著升高（P<0.01），在多种肿瘤中LGALS3高表达且与患者生存期呈负相关（P<0.05或P<0.01）。黑色素瘤B16-F10细胞移植瘤模型中，LGALS3在M2型TAM中高表达（P<0.01），且奥沙利铂化疗后表达进一步升高（P<0.05）。体外对肿瘤细胞给予重组LGALS3蛋白可抑制3-MA抑制剂化疗药物奥沙利铂诱导的肿瘤细胞死亡（P<0.01）。结论：奥沙利铂化疗后的M2型TAM通过合成和分泌LGALS3促进黑色素瘤细胞的化疗抵抗，因此通过免疫治疗的方法靶向LSTM2457体内GALS3分子可能有效提高肿瘤的治疗效果。
黄瓜花叶病毒为骨架的多联弱毒疫苗构建和疫苗施用方案优化的研究
植物病毒病是危害植物生长最严重的病害之一,降低作物产量、影响品质,对我国农业经济造成巨大损失。弱毒疫苗交叉保护是预防植物病毒病的一种有效措施,但疫苗存在剂型单一、货架期短、单剂疫苗所能防治的靶标病毒有限等限制。鉴于病毒病的混合侵染特性,有必要研制能够兼抗多种植物病毒病的单剂多联弱毒疫苗,并优化疫苗的保存方式,延长其货架期。黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)是宿主数量最多、分布范围最广的植物病毒之一,并且其多节段基因组为致弱突变提供多个位置选择,在弱毒疫苗的研制中具有极大潜力。本研Negative effect on immune response究以黄瓜花叶病毒为基础疫苗载体骨架,构建单联双靶、双联三靶、三联四靶弱毒疫苗,同时比较不同低温保存法的疫苗保质期,为植物病毒病的防治提供弱毒疫苗材料和延长货架期的可行性方案。以构建的CMV_(Fny)RNA2弱毒突变体p CC_FR2-2b PTII、p CC_FR2-2b PTIII为疫苗基础载体。在弱毒突变体p CC_FR2-2b PTII中插入TVBMV不同保守区域的100 bp病毒片段(TVBMV_(7600-7699)、TVBMV_(7700-7799)、TVBMV_(8880-8979)、TVBMV_(8980-9079)),构建了4种单联双靶弱毒突变体;在弱毒突变体p CC_FR2-2b PTII中插入来源于TVBMV和TMV的共221bp不同组合片段(TVBMV_(7600-7699)TMV_(2158-2278)、TMV_(2158-2278)TVBMV_(7600-7699)),构建了2种双联三靶弱毒突变体;在弱毒突变体p CC_FR2-2b PTIII中插入来源于TVBMV、TMV和PVY不同排列顺序的共321 bp片段(TMV_(2158-2278)PVY_(517-616)TVBMV_(7600-7699)、TMVGSK2118436试剂2158-2278TVBMV7600-7699PVY517-616、PVY517-616TVBMV7600-7699TMV2158-2278、PVY517-616TMV2158-2278TVBMV7600-7699、TVBMV7600-7699PVY517-616TMV2158-2278、TVBMV_(7600-7699)TMV_(2158-2278)PVY_(517-616)),构建了6种三联四靶弱毒突变体。将各突变体分别与CMV_(Fny)野生型RNA1和RNA3混合后接种本氏烟,均显示弱致病性且具备良好的遗传稳定性。预先接种以上突变体7 d后进行靶标病毒的单独或混合挑战接种,对CMV的防效最好(72.0%～100%),对各靶标病毒也显示一定的防效(7.4%～46.2%)。在单联双靶弱毒突变体的交叉保护效果实验中,TVBMV的4种插入型突变体对TVBMV的交叉保护效果差异较明显,插入TVBMV_(7600-7699)片段的突变体对TVBMV和混合强毒的防效最好,分别为37.0%和22.2%;在双联三靶弱毒突变体的交叉保护效果实验中,各突变体对TVBMV、TMV以及混合强毒均表现良好的交叉保护效果,分别为40.0%～44.4%、32.0%～37.0%、24.0%～32.0%,对靶标病毒的防效与病毒片段插入顺序不显示明显相关性;在三联四靶弱毒突变体的交叉保护效果实验中,6种突变体对CMV、TVBMV、TMV和PVY单独或混合侵染均表现良好的交叉保护效果,对各靶标病毒单独侵染的防效分别为87.0%～100%、22.2%～46.2%、22.2%～44.4%和28.5%～44.4%,对混合强毒的防效为16.0%～37.0%,对靶标病毒的防效与病毒片段插入顺序不显示明显相关性。为指导田间应用和尽可能地降低疫苗使用成本,需要确定疫苗稳定存在的接种起始浓度范围。对突变体p CC_FR2-2b PTII以及插入100 bp、221 bp异源病毒片段的突变体(起始菌液OD_(600)=1.2)的稀释限点进行分析。突变体p CC_FR2-2b PTII稀释10~1～10~5倍后接种,仍然具备良好的遗传稳定性,病情指数为3.7～26.0,维持弱毒特征;插入100 bp异源病毒片段的突变体在稀释10~4倍后开始出现一定比例的突变回复现象,在稀释10~5倍后基本已完全回复,病情指数达到48.1,显示一定的强毒特征;插入221 bp异源病毒片段的突变体在稀释10~3倍后开始出现突变回复现象,并随着稀释倍数增大,回复越完全,稀释10~5倍后接种的病情指数达到70.4,已回复为强毒。综上表明,疫苗使用过程中,过度稀释的起始接种浓度会导致疫苗稳定性下降。初始浓度OD_(600)=1.2的疫苗菌液在田间使用过程中建议稀释倍数不要超过10~2倍。为降低大体积菌液型疫苗的保存和长途运输成本,本研究比较分析了菌液型弱毒疫苗的3种低温保存方法(离心保存法、直接冻干保存法、离心冻干保存法)处理后的疫苗稳定性和交叉保护效果。离心保存法:高速离心去上清的疫苗菌体在两组低温下(4℃,-20℃)保存15 d,30 d或60 d后重悬接种,均表现良好的遗传稳定性,对CMV的交叉保护效果良好,随着保存时间的延长,相对防效逐渐降低,在4℃保存15 d,30 d和60 d后接种的相对防效为74.1%、51.9%和51.9%,在-20℃保存15 d,30 d和60 d后接种的相对防效为74.1%、59.3%和44.4%,而在28℃条件下保存15 d、30 d,疫苗仍具备良好稳定性,对CMV的交叉保护效果相比于两组低温保存来说更差,仅为37.0%、22.2%,而保存60 d后已完全回复至野生型,基本不再表现明显的交叉保护效果,相对防效只有7.4%。直接冻干保存法:菌液型疫苗经冻干机处理后的疫苗菌粉在4℃,-20℃保存30 d、60 d后重悬接种,均具备良好的遗传稳定性,且对CMV表现非常好的交叉保护效果,相对防效均在88.0%以上。离心冻干保存法:高速离心去上清的菌体经冻干机处理的疫苗菌粉在4℃,-20℃保存30 d、60 d后分别用灭菌水、纯水、自来水重悬接种,均具备良好的遗传稳定性,保存30 d的各处理组对CMV的相对防效达到72.0%以上,而保存60 d后用灭菌水重悬要优于用纯水、自来水重悬,在4℃保存重悬的整体相对防效(66.7%～100%)要高于在-20℃保存重悬的相对防效(66.7%～74.1%)。以上三种菌液型疫苗的低温冻存法,解决了菌液型疫苗不易大体积保存的难题,提高了长距离运输的便利性,同时也降低了成本。本研究筛选出了遗传稳定、兼抗多种病毒的12种多联弱毒疫苗,为相应种类的植物病毒病防治提供了疫苗材料;同时疫苗稀selleck HPLC释后稳定性分析以及3种低温保存法的比较,为疫苗应用过程中降低使用、保存、运输成本提供了数据支持。
岩藻糖基乳糖的高效生物合成及限速酶的分子改造研究
2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllacbiomass additivestose,2’-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose,3-FL)是母乳中结构简单且分泌最丰富的中性母乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)。因其具有维持肠道稳态、免疫调节、炎症抑制、抗病毒及促进婴儿大脑发育等多种生理功能而被广泛应用于婴幼儿配方奶粉、老年食品、功能性饮料及保健品等领域。目前,2’-FL和3-FL均已被美国食品药品管理局(FDA)批准为一般公认安全食品(GRAS),并被欧盟批准为新型食品(NF),且在商业化的岩藻糖基乳糖(FL)生产中主要使用大肠杆菌(Escherichia coli)为底盘宿主进行微生物合成。由于微生物合成法具有绿色高效、成本低廉等典型特征,现已逐渐成为FL工业化生产的主要策略。此外,应用于FL生产的岩藻糖基转移酶是代谢过程的主要限速酶,限速酶的性能提升对FL的高效合成至关重要。为此,本论文以具有高底物消耗率且生长迅速的大肠杆菌为宿主,使用代谢工程策略和工具构建了高效生产2’-FL和3-FL的质粒型微生物细胞工厂,通过操控微生物的遗传单元、重构细胞的生化网络,实现了胞内乳糖自合成的FL整合型无抗菌株的构建,同时基于酶工程技术筛选并改善了限速酶α-1,2-岩藻糖基转移酶的生产性能。主要研究内容和结果如下:(1)岩藻糖基乳糖大肠杆菌细胞工厂的构建与优化。以E.coli BL21(DE3)为出发菌株,异源表达从头合成FL的α-1,2/3-岩藻糖基转移酶基因,通过独立或组合过表达基因簇man C-man B和gmd-wca G探究对产物合成的影响,发现组合过表达最有利于FL的生产。不同细菌来源α-1,2/3-岩藻糖基转移酶的筛选表明,H.pylori ATCC 26695的Hpfut C和H.pylori NCTC 11639的七点突变体Hp M32生产FL的效果最佳。基因lac Z和wca J的敲除结果表明,底物乳糖的利用率得到显著提高,关键前体GDP-L-岩藻糖的胞内积累得到明显改善。利用不同质粒拷贝数组合优化上游关键基因(模块一)和下游糖基转移酶(模块二)的表达水平,获得最佳质粒组合为PLX5622溶解度p RSF-CBGW和p ET-Hpfut C/Hp M32。在胞内建立NADPH和GTP再生系统,比较4组单基因和4组多基因过表达对菌株生产性能的影响,结果表明,含zwf和gsk的过表达菌株生产性能最好。此外,培养基和诱导条件的优化显示,在使用M9CA培养基、诱导温度为25°C,诱导浓度为0.3 m M的条件下,菌株的生长状态和产物合成的协同效果最佳,摇瓶水平下2’-FL和3-FL的产量提升至2.21±0.06 g/L和1.88±0.05 g/L。在3-L发酵罐中进行补料分批发酵,最终产生了24.4 g/L的2’-FL和18.89 g/L的3-FL。(2)基因编辑技术改造底盘微生物及限速酶的性能提升。以E.coli BL21(DE3)Δlac Z为出发菌株,通过一轮至四轮潜在竞争靶基因(nud D、nud K、wca J、lon、mtl D、pfk A、pfk B、fsa A和fas B)的筛选与迭代敲除,上调了三个关键中间体包括果糖-6-磷酸、GDP-D-甘露糖和GDP-L-岩藻糖的碳通量。显著地,lac Z、wca J、nud D、pfk A和lon基因缺失的BZWNDPAL菌株获得了最高生产水平,2’-FL和3-FL的产量分别为6.24±0.14 g/L和3.56±0.11 g/L。通过优化合成生物学元件(启动子、RBS、融合肽以及基因拷贝数)缓解了α-1,2/3-岩藻糖基转移酶低催化活力和低可溶性表达的瓶颈问题。结果显示,在T7启动子和RBS(BBa＿B0034)调控下,菌株产生了7.87±0.14 g/L的2’-Fselleck化学L和5.26±0.12 g/L的3-FL。融合肽ple B促进了岩藻糖基转移酶的可溶性表达。当质粒上串联二拷贝基因时,2’-FL和3-FL的产量进一步提高。通过单因素培养基成分的优化,2’-FL和3-FL的产量提升至9.82±0.16 g/L和6.68±0.14 g/L。最终,在3-L发酵罐的补料分批发酵中,重组菌获得了64.62 g/L的2’-FL和40.68 g/L的3-FL。(3)乳糖合成新途径设计与岩藻糖基乳糖无抗菌株的构建。以BZWNDPAL为出发菌株,敲除了葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABC~(Glc)组件编码基因crr和pts G,并在该位点整合了糖外排转运蛋白基因set A和葡萄糖转运蛋白基因glf。强化了NPTS~(Glc)系统的菌株BP3的葡萄糖转运速率和细胞生物量相较于初始菌株得到了显著提升。筛选不同来源的β-1,4-Gal T并实现乳糖合成菌株的构建,将gal E基因整合至染色体的ugd位点,将优选的脑膜炎奈瑟球菌来源的Nmlgt B基因整合至glk位点。消除糖酵解模块副产物和阻遏蛋白的抑制并引入FL生物合成途径,在工程菌BP8-0和BP9-0染色体的ack A-pta,pfl B和ldh A位点进一步整合了man C-man B,gmd-wca G和man A表达盒,2’-FL和3-FL的胞外输出含量提升至3.34±0.11 g/L和2.78±0.09 g/L。为了进一步提高FL的产量,基因组上内源的GDP-L-岩藻糖模块关键基因(man A、man B、man C和gmd)的野生启动子被替换为更强的T7启动子,最终菌株BP10-3和BP10-3含有18个基因修饰,摇瓶检测2’-FL和3-FL的胞外输出产量为4.36±0.14 g/L和3.23±0.12 g/L。在3-L发酵罐的补料分批发酵中,菌株在甘油和葡萄糖混合培养中生产了40.44 g/L的2’-FL和30.42 g/L的3-FL。(4)α-1,2-岩藻糖基转移酶的分子改造与性质研究。通过多序列比对设计并建立了17个α-1,2-岩藻糖基转移酶的单双点饱和突变文库,酶法合成供体底物GDP-L-岩藻糖并在此基础上对小型突变库进行体内初筛和体外复筛,最终获得酶活力提升的6个单点突变体K102T、R105C、D115S、Y251F、A255G和K282E。对单点正向突变体进行有序叠加,获得了6个酶活力和可溶性表达同时提高的组合突变体。其中突变体V6的催化活力由野生酶的0.71 U/mg提升至1.62 U/mg。对野生Hpfut C和突变体进行酶学性质研究,结果显示,野生型Hpfut C的最适反应温度为37℃,最适p H为5.0,不属于金属依赖型酶,但Mn~(2+)对反应具有促进作用。突变体K102T、D115S、Y251F和K282E的热稳定性均有不同程度的改善。特别地,突变体V6对底物乳糖和GDP-L-岩藻糖的亲和力和催化速率得到大幅度提升,两种不同底物浓度下突变体V6的K_m值比野生酶分别低34.5%(乳糖)和25.0%(GDP-L-岩藻糖),而k_(cat)/K_m值分别高出1.20和1.25倍。应用Alpha Fold 2预测的结构模型进行分子对接和酶活提升机制分析,结果表明,高刚性结构、新氢键的形成、增加的疏水性氨基酸和有利的静电势可能对突变体的稳定性具有促进作用。
基于数据挖掘的青光眼动物模型的应用特点分析
目的 研究青光眼动物模型应用情况，为其动物实验方法和模型完善提供参考。方法 以“青Berzosertib临床试验光眼”和“动物模型”为主题词，在中国知网、PubMed中收集2012年11月1Medical home日～2022年11月2日青光眼动物模型的相关文献，总结实验动物种类、性别、造模方法、检测指标等，建立数据库进行统计分析。结果 共筛选得到符合标准的400篇文献，其中实验动物多为C57BL/6LBH589核磁J小鼠，动物性别以雄性居多；造模方法多采用前房注射物质诱导型、转基因型和激光光凝诱导型；高频检测指标主要包括眼压测量、组织病理、蛋白免疫印迹和免疫组化。结论 目前青光眼动物模型造模方法种类较多，但是相关中医因素干预较少，建议增加病证结合的青光眼动物模型。本研究通过对青光眼动物模型实验进行挖掘分析，对不同动物模型进行评估，通过挖掘内容为构建造模成功率高、重现性好、与临床吻合度高的动物模型提供参考，为模型完善提供思路。
未行手术的卵巢子宫内膜异位囊肿对体外受精结局和卵泡颗粒细胞铁死亡的影响
背景卵巢子宫内膜异位囊肿(OMA)对体外受精(IVF)中卵泡微环境、卵子、胚胎、内膜及妊娠的影响存争议,铁死亡是潜在机制之一。本研究从这五点分析未行手术的OBioactive CryptidesMA对IVF妊娠结局和卵泡颗粒细胞铁死亡的影响。目的1、探讨OMA是否影响卵巢功能下降(DOR)患者多次IVF累积妊娠结局和效率;2、探讨OMA是否影响DOR患者胚胎整倍体率及妊娠结局;3、探讨OMA是否增加种植失败者内膜炎(CE)和种植窗偏移的发生;4、检测OMA患者卵泡液铁死亡标志物及其与卵子质量的关系;5、探讨OMA对卵泡颗粒细胞铁死亡状态的影响。方法1、回顾Mirdametinib临床试验性分析493名DOR患者(OMA:90名;非OMA:403名)1079个IVF周期,比较妊娠结局及活产时间。2、回顾性配对分析100名DOR患者(按年龄、PGT类型及妊娠史1:4配对,OMA:20名;非OMA:80名)123个PGT周期,比较囊胚整倍体率及妊娠结局。3、回顾性分析:368名一次以上移植失败行CE检测者(OMA:40名;非OMA:328名),比较CE率及妊娠结局;30名反复种植失败者(OMA-ERA:10名;非OMA-ERA:20名)行内膜容受性评估(ERA),比较ERA类型占比、种植窗偏移率及结局。4、检测40名患者(按年龄及妊娠史配对,OMA组和非OMA组各20名)卵泡液铁离子、GSH及MDA,比较两组差异,并与卵子质量行相关性分析。5、检测并比较三组(OMA侧、OMA对侧和非OMA组,各8例)卵泡液铁死亡标志物和颗粒细胞线粒体形态、GSSG、MDA、ROS及通路蛋白Beclin-1、SLC7A11 及 GPX4 的水平。结果1、OMA和非OMA者在每取卵和每移植周期的种植率、活产率及每患者和每有优质胚胎者的累积活产率、活产时间的差异无统计学意义(P>0.05)。2、OMA和非OMA者在囊胚整倍体率、整倍体囊胚种植率、临床妊娠率、流产率及活产率上差异无统计学意义(P>0.05)。3、OMA组和非OMA组CE率、CD138转阴后累积妊娠率、活产率相似;OMA-ERA组和非OMA-ERA组种植窗偏移率及后续移植妊娠率相似(P>0.05)。4、OMA组首优势卵泡获卵率及总获卵率均明显低于非OMA组,OMA组卵泡液Fe2+及MDA升高,GSH降低,差异有统计学意义(P<0.05)。未获卵的卵泡液中GSH显著低于有获卵的卵泡液,GSH与OMA组D3优确认细节质胚胎率正相关(P<0.05)。5、OMA侧卵泡液Fe2+和MDA升高、GSH降低;OMA侧颗粒细胞线粒体改变、Beclin-1和SLC7A11高表达、GPX4抑制,伴ROS、GSSG和MDA升高;OMA对侧未出现以上改变。结论未行手术的卵巢子宫内膜异位囊肿可能并未影响卵巢储备功能下降患者IVF累积妊娠结局和达活产时间,未影响其PGT周期整倍体囊胚率和移植结局;在种植失败者中也可能并未增加其慢性子宫内膜炎和种植窗偏移的发生率;因此,对存在3-5 cm卵巢子宫内膜异位囊肿的DOR患者,在IVF前需慎重进行仅以改善妊娠结局为目的的手术治疗。但卵巢子宫内膜异位囊肿仍有可能通过诱导邻近的卵泡颗粒细胞铁死亡,产生氧化应激进而影响局部卵子的质量。