目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌的大部分,目前是全球癌症相关死亡的第三大原因。HCC发生在多年慢性肝病之后,基因组中的突变是癌症的致病和决定性特征。慢性肝病尤其是在肝硬化阶段,会导致突变的进行性积累,从而推动癌症的发展。因此,了解导致特定突变的原因以及它们如何相互作用导致癌症的发生发展是了解、预防和应对肝癌的核心问题。由TP53基因编码的p53蛋白是一种肿瘤抑制转录因子,可作为防止多种癌症发生和寻找更多发展的基因守护者。TP53基因在大约一半的人类癌症病例中发生突变。p53突变调节许多细胞过程,包括增殖、迁移、侵袭、存活、代谢、化疗抗性等,以促进肿瘤进展。值得注意的是,已有研究表明TP53突变与HCC的免疫微环境密切相关。CD8~+T细胞是免疫微环境中主要的杀伤细胞,在肿瘤抗原持续刺激、免疫抑制细胞抑制以及理化状态失衡等多种因素的影响下,CD8~+T细胞会逐渐退化为增殖能力减弱、效应细胞因子水平下降、抑制性受体表达增高的功能失调状态,称为CD8~+T细胞耗竭。对于p53突变促进肿瘤恶性生物学行为的研究,大部分集中在肿瘤细胞依赖于自主信号来发挥作用,然而如今越来越多的研究强调了p53突变参与调节肿瘤细胞分泌组学从而促进癌症进展,那么p53突变型肝癌细胞是否可以通过外泌体影响CD8~+T细胞耗竭以及具体机制值得探索。因此本研究首先明确了p53 R249S突变型肝癌细胞是否促进了CD8~+T细胞耗竭,其次探讨了外泌体是否参与p53 R249S突变型肝癌细胞对CD8~+T细胞耗竭的促进作用,最后寻找p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进CD8~+T细胞耗竭可能的机制,为肝癌的发生发展机制的探索提供新思路。研究方法:13-MA核磁.实验材料:人肝癌细胞系Hep3B和PLC/PRF/5、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6、C57BL/6小鼠。2.实验方法:(1)细胞培养:培养人肝癌细胞系Hep3B、PLC/PRF/5以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6。(2)病毒转染:在Hep3B细胞系中转染p53 R249S突变,在PLC细胞系中转染shp53,在Hepa1-6细胞系中转染p53 R249S突变。(3)Western blot:用于检测病毒转染效率、验证外泌体纯度、肝癌细胞中外泌体释放相关蛋白(RAB35、RAB27A、RAB27B、RAB10、SNAP23、VAMP3)水平、肝癌细胞、外泌体以及CD8~+T细胞中SHP2水平。(4)细胞共培养实验:将病毒转染后的人肝癌细胞与CD8~+T细胞共培养,用于后续流式分析。(5)小鼠皮下成瘤实验:用于研究p53 R249S突变对小鼠肿瘤重量、体积和生长速度的影响。(6)免疫组化:用于研究p53 R249S突变对小鼠肿瘤中CD8~+T细胞数量的影响。(7)差异超速离心:用于提取外泌体。(8)NTA:用于检测外泌体粒径分布。(9)透射电镜:用于观察外泌体粒径和形态。(10)外泌体-细胞共培养:将肝癌细胞提取的外泌体与CD8~+T细胞共培养,用于后续流式分析。(11)小鼠皮下成瘤及鼠尾静脉注射外泌体实验:用于研究p53 R249S突变肝癌细胞来源外泌体对小鼠肿瘤重量的体积的影响。(12)流式细胞术:用于检测细胞共培养、外泌体-细胞共培养、瘤体组织和脾脏中CD8~+T细胞中Gzm B~+、Perforin~+、PD-1~+和Tim-3~+水平。(13)免疫荧光:用于检测CD8~+T细胞对外泌体的摄取情况。(14)Real time PCR:用于检测肝癌细胞中SHP2的m RNA水平。(15)统计学分析:使用软件SPSS 22.0完成统计,所有数据使用均数±标准差的形式进行展示,并且所有实验均完成3次独立重复实验。柱状图量化及折线图由Prism 9(Graph Pad Software)完成。通过t检验和one-way ANOVA确定统计显著性,当P<0.05时,认为该数据具备统计学差异。3.实验方案3.1明确p53 R249S突变型肝癌细胞促进CD8~+T细胞耗竭(1)评估CD8~+T细胞耗竭情况:流式细胞术检测CD8~+T细胞中Gzm B~+、Perforin~+、PD-1~+和Tim-3~+,其中Gzm B~+CD8~+T细胞和Perforin~+CD8~+T细胞百分比下降、PD-1~+CD8~+T细胞和Tim-3~+CD8~+T细胞百分比升高提示CD8~+T细胞耗竭。(2)构建p53 R249S突变型肝癌细胞系:慢病毒转染技术分别在Hep3B人肝癌细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53 R249S作为实验组;在PLC人肝癌细胞系中转染PLKO作为对照组,转染shp53即p53敲除作为实验组。在Hepa1-6小鼠肝癌细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53 R249S作为实验组。(3)细胞共培养体系构建:将上述构建的人肝癌细胞系(p53 R249S突变型肝癌细胞与p53空载的肝癌细胞相互对比)分别与CD8~+T细胞共培养。(4)动物实验:利用构建的Hepa1-6小鼠肝癌细胞分别注入C57BL/6小鼠皮下进行成瘤。记录肿瘤体积大小和重量,评估肝癌组织中CD8~+T细胞浸润水平以及小鼠肿瘤组织和脾脏中CD8~+T细胞耗竭情况。3.2探究p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进CD8~+T细胞耗竭(1)外泌体的提取与验证:使用差异超速离心法提取细胞上清外泌体,并通过透射电子显微镜、NTA、western blot对外泌体纯度进行鉴定。(2)外泌体与细胞共培养体系构建:将收集的p53不同状态肝癌细胞来源的外泌体与CD8~+T细胞共培养,流式细胞术检测CD8~+T细胞耗竭情况。(3)动物实验:小鼠皮下成瘤模型,鼠尾静脉注射p53不同状态肝癌细胞来源的外泌体,记录肿瘤体积大小和重量,流式细胞术检测肿瘤与脾脏CD8~+T细胞耗竭情况。3.3探讨p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进CD8~+T细胞耗竭的具体机制(1)外泌体释放量实验:以p53 R249S突变型肝癌细胞和p53空载肝癌细胞相互比较,western blot检测外泌体释放相关蛋白表达。收集肝癌细胞释放的外泌体,NTA检测外泌体大小、释放量的变化。综合判断p53 R249S突变能否影响肝癌细胞的外泌体释放。(2)CD8~+T细胞摄取外泌体实验:将Di D染料标记的外泌体与CD8~+T细胞共培养,免疫荧光验证CD8~+T细胞对外泌体的摄取。(3)探究外泌体中引起CD8~+T细胞耗竭的关键内容物:蛋白组学分析筛选差异蛋白。western blot和PCR验证肝癌细胞及其分泌的外泌体中SHP2水平。将外泌体与CD8~+T细胞共培养,western blot验证CD8~+T细胞中SHP2水平。实验结果:1.体内外实验证明了p53 R249S突变型肝癌细胞促进CD8~+T细胞耗竭。2.体内外实验证明了p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进了CD8~+T细胞耗竭。3.p53 R249S突变对肝癌细胞外泌体的释放量和释放相关蛋白无影响,并且CD8~+T细胞能neurogenetic diseases够摄取不同来源外泌体,p53 R249S突变肝癌细胞可以释放携带SHP2的外泌体递送到CD8~+T细胞并促进其耗竭。结论:1.p53 R249S突变型肝癌细胞能够促进CD8~+T细胞耗竭。2.p53 R249S突变型肝癌细胞来源的外泌体促进CD8~+T细胞的耗竭。3.p53 R249S突变肝癌细胞可以通过释放携带SHP2的外泌体递送至CD8~+T细胞进而促进CD8~+T细胞耗竭。