马铃薯卷叶病毒属病毒(poleroviruses)寄主范围非常广泛,能够侵染十字花科、葫芦科、禾本科等多个科的植物,引起严重病害,对一些经济重要性作物在生产上造成严重损失。芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus,Br YV)是一种能够侵染十字花科的Polerovirus病毒。前期研究寻找更多表明NbRAF2(Rubisco Assembly Factor 2)负调控Br YV-A的侵染,超表达细胞核中的NbRAF2增强对Br YV-A的抗性。目前,NbRAF2参与调控生物胁迫(抗病毒)的生物学功能及抗病作用机制MK-2206 MW尚不清楚。本研究在已有基础上,主要围绕NbRAF2蛋白展开研究,筛选NbRAF2的互作寄主蛋白,对互作蛋白功能及抗病性进行初步的研究与分析。本文主要研究内容如下:1.NbRAF2互作寄主蛋白筛选和验证自激活试验证明NbRAF2蛋白不具有自激活活性。将NbRAF2作为诱饵用于酵母文库筛选试验,筛选到的候选互作蛋白(RAF2 interacting protein,RIP2)如下:蛋白激酶相关蛋白(RIP2-1)、富含半胱氨酸/组氨酸的结构域蛋白(RIP2-2)、前折叠素(RIP2-3)、蛋白磷酸酶(RIP2-4)、PPPDE家族蛋白(RIP2-biodiesel production5)。利用酵母双杂交技术(Yeast Two Hybrid,Y2H)、双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,Bi FC)和免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)证明NbRAF2蛋白与RIP2-1、RIP2-2、RIP2-3、RIP2-4和RIP2-5在体内外均存在互作关系。2.NbRAF2互作蛋白的抗感病毒活性验证利用农杆菌介导烟草瞬时表达系统,分别过表达互作蛋白RIP2-1、RIP2-2、RIP2-3、RIP2-4和RIP2-5并接种Br YV-A,检测Br YV-A积累量,结果表明RIP2-1、RIP2-3和RIP2-4对Br YV-A积累量没有明显影响,不具有抗Br YV-A活性,RIP2-2和RIP2-5显著抑制Br YV-A积累,具有明显的抗Br YV-A活性。结合以上结果,为了进一步探究RIP2-2和RIP2-5抑制Br YV-A积累的作用机制,利用实时荧光定量PCR检测PR1(pathogenesis-related gene 1)的表达情况,结果表明分别过表达RIP2-2和RIP2-5均能显著上调PR1表达水平。3.NbRAF2及突变体(NLS-NbRAF2)的转基因材料获得与初步鉴定以pCAMBIA1381为基础载体,构建含有NbRAF2及NLS-NbRAF2的超表达载体p CAMBIA1381-NbRAF2及p CAMBIA1381-NLS-NbRAF2。利用根癌农杆菌GV3101介导进行烟草遗传转化,获得NbRAF2及突变体NLS-NbRAF2转基因植物材料。对T_0代转基因株系进行PCR检测和蛋白水平鉴定,最终获得NbRAF2转基因植株3株、NLS-NbRAF2转基因植株2株。本论文筛选并验证了RIP 2-1、RIP 2-2、RIP 2-3、RIP 2-4和RIP 2-5五个NbRAF2互作蛋白,RIP2-2和RIP2-5过表达诱导PR1上调,并显著抑制Br YV-A积累。推测RIP2-2和RIP2-5能够与NbRAF2互作形成复合体,共同调控PR1表达,进而调控寄主对Br YV-A抗性。综上,这些结果为进一步解析NbRAF2抗病毒机制提供重要数据,对获得新的潜在的植物抗病基因具有一定的理论意义。