研究背景和目的Rett综合征(RTT),是一种以神经发育倒退为特征的遗传罕见病,临床表现为出生后6-18月的正常发育期后,开始出现认知和运动发育退化,呈进行性加重,主要表现如语言技能下降和有目的地使用手能力丧失;同时,患者还往往出现疼痛感觉迟钝和自闭症行为等伴随症状。致病基因MECP2编码表观遗传蛋白MeCP2A/2B,它们高度同源,在人类中仅在N端12个氨基酸不同,其中2B在神经系统高表达。MeCP2含有功能已知的DNA结合域和转录抑制域,也包含功能未知的AT-hook1保守结构域。前期我们发现一例非典型RTT患者携带有位于AT-hook1功能域的临床意义未明错义变异R190H(对应于2A的位点,2B相当于R202H),并构建了 MeCP2位于AT-hook1(aa 184-195)部位八个保守氨基酸缺失(aa186-193,RGRGRPKG)的Mecp2ΔAT-hook1/y突变雄性小鼠,再现了部分RTT表型,如认知功能下降、焦虑、疼痛异常等,且小鼠海马区病理分析发现:CA1区细胞层变薄,其机制不清。qPCR发现抑制性神经元相关基因表达失调。本研究目的为了进一步深入探讨AT-hook1功能域对下游基因的表达影响。研究方法1.体内实验:Mecp2ΔAT-hook1/y突变雄性小鼠进行全脑组织转录组数据分析及qPCR验证相关差异基因的表达;2.体外实验:构建稳定表达MeCP2B、MeCP2BAT-hook1点突变(R202H)和MeCP2B AT-hook1缺失突变(ΔAT)的SH-SY5Y和HEK-293T稳定表达细胞株:SH-SY5Y/MeCP2B、SH-SY5Y/MeCP2B-R202H、SH-SY5Y/MeCP2B-ΔAT,以及 HEK-293T/MeCP2B、HEK-293T/MeCP2B-R202H、HEK-293T/MeCP2B-ΔAT,观察以下各种指标:1)突变的MeCP2的亚细胞定位;2)对抑制性神经元相关基因进行qPCR验证表达水平;3)对动物转录组学提示的G蛋白偶联受体(GPCRs)相关基因进行qPCR验证表达水平;4)细胞活力测定;5)凋亡信号通路检测:WB 检测 MeCP2B、MeCP2B-R202H 和 MeCP2B-ΔAT稳转株凋亡相关指标Cleaved Caspase-3;6)对基因HTR7编码受体蛋白5-HT7R通过WB验证表达水平;通过5-HT7R拮抗剂和激动剂的处理,观察稳定表达野生型MeCP2B和突变型MeCP2B的SH-SY5Y稳转株的活力变化;7)统计方法:本研究使用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析,统计方法为单因素方差分析(one-way analysis of variaselleck抑制剂nce,ANOVA)或 T 检验(Student’s t test),p<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1.Mecp2ΔAT-hook1/y突变雄性小鼠的转录组学分析显示GPCRs家族表达显著失调,与行为和情绪调节相关的G蛋白偶联受体中Htr1d、Drd3、Tacr2、Avpr1b、Gabra6和Adra2b 6种基因在Mecp2ΔAT-hook1/y突变雄性小鼠脑组织内呈显著下调,而Htr7、Chrnb4和Prdm2 3种基因显著上调。2.成功构建了 8种稳定表达细胞株:SH-SY5Y/MeCP2B、SH-SY5Y/MeCP2B-R202H、SH-SY5Y/MeCP2B-ΔAT、SH-SY5Y/Cstomach immunityN,以及 HEK-293T/MeCP2B、HEK-293T/MeCP2B-R202H、HEK-293T/MeCP2B-ΔAT、HEK-293T/CN,并在这些稳转株中进行了以下分析:1)MeCP2AT-hook1突变的蛋白核定位正常;2)AT-hook1突变引起抑制性神经元相关基因的表达发生变化;3)AT-hook1突变导致GPCRs相关基因表达发生变化;4)AT-hook1突变引起细胞活力下降和凋亡;5)激活5-HT7受体对AT-hook1突变引起的神经元细胞活力下降起保护作用。结论1.体内实验:MeCP2 AT-hook1突变导致模型鼠的GPCRs相关基因的表达和对神经活性配体-受体的相互作用的影响最为显著;2.体外实验:(1)MeCP2 AT-hook1突变影响抑制性神经元和GPCRs相关基因的表达;(2)MeCP2 AT-hook1突变不影响MeCP2蛋白的PD-0332991生产商亚细胞定位,但影响了细胞的活力并出现凋亡,通过激活5-HT7受体能够改善稳定表达MeCP2 AT-hook1 点突变和缺失突变的 SH-SY5Y 细胞的活力。