红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)和须癣毛癣菌(T.mentagrophytes)是皮肤癣菌病最常见的致病菌,这种疾病影响到全世界数百万人。分泌性蛋白酶是皮肤癣菌侵袭宿主的重要毒力因子。皮肤癣菌拥有多拷贝的分泌性蛋白酶编码基因,这些分子在不同条件(如底物、pH等)下呈现差异性表达。研究目的:选取最具有代表性的红色毛癣菌和须癣毛癣菌作为实验菌株,探讨两种癣菌的生长特性,研究M35家族在两种癣菌中的表达差异,并且构建了其中恒定高表达的Np IIc和Np IId两个分子基因敲除模型,初步探讨其在癣菌侵袭宿主过程中的作用。实验方法:主要包含以下六部分,简述如下:1.真菌培养与鉴定通过宏观表型、微观结构以及分子生物学技术对红色毛癣菌和须癣毛癣菌进行鉴定,并对这两种真菌的菌落形态以及镜下结构进行比较分析。2.不同营养成分对红色毛癣菌和须癣毛癣菌生长特性的影响将红色毛癣菌和须癣毛癣菌接种于不同营养成分(氨基酸、葡萄糖、角质粉)的培养基上,动态观察菌落的生长速率、菌落形态和颜色等变化并拍照记录。3.筛选刺激红色毛癣菌和须癣毛癣菌分泌蛋白酶的培养体系以Tr1(毛癣菌琼脂培养1号)培养基为基本对照,增减其他营养成分(氨基酸、葡萄糖、角质粉)为实验组,并向培养基中加入天青角蛋白,动态检测各培养体系蛋白酶分泌情况并拍照记录。4.不同pH条件红色毛癣菌和须癣毛癣菌M35家族的基因表达变化建立刺激分泌蛋白酶的培养体系,并将pH值调至4,6和8,收获菌丝进行总RNA提取和反转录获得c DNA,并采用实时荧光定量PCR技术检测在不同pH值下M35家族中各基因的表达情况。5.CRISPR/Cas9技术构建红色毛癣菌NpⅡc和NpⅡd基因突变株针对基因特异性片段,设计引物;体外转录得到sgRNA,将sgRNA和Cas9蛋白以及Ura3片段一同转化至菌株STRB18(ΔURA3)原生质体中,随着对目的DNA的定位和切割形成双链缺口,细胞通过外源性Ura3片段对缺口进行修复造成基因突变,并通过双向营养筛选方式选出目的转化子,对其提取DNA进行PCR扩增验证及测序验证。6.野生型与基因突变型菌株角蛋白酶分泌的动态测量通过添加天青角蛋白(keratin-azure)结合分光光度法,对红色毛癣菌野生型,基因突变型SCNB19(ΔNpⅡc)和SCNB20(ΔNpⅡd)分泌的角蛋白酶进行测定。实验结果:按以下六部分进行简述1.真菌培养与鉴定TDirect genetic effectsr1培养基上红色毛癣菌正面表现为蓬松至绒毛状的红色菌落;须癣毛癣菌正面则表现为颗粒状至粉状的淡黄色菌落,生长速度较红色毛癣菌快。显微镜下观察红色毛癣菌的菌丝为间隔状,典型直角分枝。须癣毛癣菌可观察到圆形或卵圆形小分生孢子,呈葡萄串样排列。2.不同营养成分对红色毛癣菌和须癣毛癣菌生长特性的影响红色毛癣菌和须癣毛癣菌在培养基中均呈放射性生长,红色毛癣菌在未经改良的Tr1培养基和SC培养基上生长最为旺盛。在只含有氨基酸的培养基上生长水平稍差。在角质粉培养基中菌落密度最稀疏。红色毛癣菌在加葡萄糖培养基中可产生色素,不加时无法产生色素。须癣毛癣菌生长状态与红色毛癣菌基本相似,除了在SC基础培养基中,须癣毛癣菌生长速率明显较其他培养基慢,但产生色素最丰富。3.筛选刺激红色毛癣菌和须癣毛癣菌分泌蛋白酶的培养体系第2周时,在角质粉培养基中可以明显观察到蓝色,提示外泌性蛋白酶的分泌。而在其他培养基中均未出现颜色改变。4.不同pH条件红色毛癣菌和须癣毛癣菌M35家族的基因表达变化在红色毛癣菌和须癣毛癣菌中,M35家族中的NpⅡa、NpⅡb和NpⅡe在不同pH值下表达相对稳定且表达量较低。NpⅡc在红色毛癣菌中具有高水平表达,而在须癣毛癣菌中,NpⅡd表达量较其他M35家族蛋白酶高。除此之外,还可以发现M35家族基因表达在酸性及偏中性条件较碱性条件活跃。5.CRISPR/Cas9技术构建红色毛癣菌NpⅡc和NpⅡd基因突变株通过双向营养筛选选出目的转化子,对其提取DNA进行PCR扩增验证并测序比对,结果提示URA3基因片段成功插入NpⅡc和NpⅡd基因中,成功获得ΔNpⅡc突变菌株SCNB19和ΔNpⅡd突变菌株SCNB20。6.野生型与基因突Z-VAD-FMK试剂变型菌株角蛋白酶分泌的动态测量在所有检测时间点中GW-572016,野生型的蛋白酶活性均高于基因突变型菌株。在第5天时,野生型菌株与SCNB20的蛋白酶活性到达了一个高峰期,SCNB19则在第7天。在第15天时,红色毛癣菌野生型和基因突变型产酶几乎一致随后逐渐上升并在第20天时再次达到一个高峰。结论1.通过在不同营养成分对红色毛癣菌和须癣毛癣菌生长特性的影响实验中,发现:1)仅有碳源(葡萄糖)而没有氮源的情况下,皮肤癣菌无法生长;2)若无碳源(葡萄糖)的情况下,氮源可以同时作为碳源与氮源;3)氮源的种类(氨基酸或角质粉)不同,皮肤癣菌生长形态也随之不同,在氨基酸营养条件下皮肤癣菌生长更好;4)葡萄糖可能对皮肤癣菌色素的产生起重要作用。2.酸性环境和角质粉均有助于诱导M35家族蛋白酶的表达。3.NpⅡc和NpⅡd对溶解角质、激活癣菌致病具有重要意义,但是推测其生物学功能不止角质溶解作用,其更多的分子功能需要进一步探索。4.皮肤癣菌中蛋白酶基因的富集允许对蛋白酶的分泌进行复杂的调节,以应对外界环境的不断变化。