第一部分:M2型巨噬细胞来源外泌体对急性哮喘小鼠的治疗作用optical biopsy目的:探究M2型巨噬细胞来源外泌体对急性哮喘小鼠的治疗作用。方法:1.通过卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)腹腔注射致敏及连续雾化吸入1周激发的方法构建急性哮喘小鼠模型。selleck HPLC将24只C57BL/6小鼠随机分成对照组、OVA诱导模型组、OVA+PBS组、OVA+M2(?)-Exo治疗组,其中在第20天至第23天,OVA+M2(?)-Exo治疗组小鼠连续4天尾静脉注射100μl M2型巨噬细胞来源的外泌体(M2(?)-Exo),OVA+PBS组小鼠连续4天尾静脉注射100μl PBS。2.评估哮喘小鼠模型气道炎症的情况:酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测哮喘小鼠外周血中炎症因子(肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α),白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),白介素-6(Interleukin-6,IL-6))的表达水平,免疫组化TUNEL(Td T-mediated d UTP nick end labeling)染色观察细胞凋亡情况,Masson染色观察小鼠肺组织纤维化水平,免疫荧光检测肺组织CD31表达以评估内皮细胞损伤水平,荧光染色(二氢乙锭法)检测肺组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果:1.与对照组相比,OVA诱导的急性哮喘小鼠外周血炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)表达、肺组织细胞凋亡程度、肺纤维化及肺组织ROS水平均明显增加(p<0.001),肺组织CD31表达较对照组明显降低(p<0.05)。2.与OVA+PBS组相比,M2(?)-Exo处理组小鼠的外周血炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)表达、肺组织细胞凋亡程度、肺纤维化水平及肺组织ROS水平均明显降低(p<0.01),而肺组织CD31表达水平较OVA+PBS模型组明显升高(p<0.001)。结论:1.OVA诱导可成功构建急性哮喘小鼠模型。急性哮喘小鼠外周血炎症因子水平、肺组织细胞凋亡程度、肺纤维化及肺组织ROS水平均明显升高,并存在内皮细胞炎性损伤。2.尾静脉注射M2(?)-Exo可有效降低急性哮喘小鼠外周血炎症因子表达,减轻细胞凋亡、肺纤维化及肺组织ROS积聚,改善内皮细胞损伤。第二部分:circ RNA-Eif3c在M2型巨噬细胞来源外泌体调节小鼠急性哮喘中的作用目的:1.筛选M2(?)-Exo中差异表达的环状RNA(circular RNA,circ RNA),明确目标circ RNA。2.阐明目标circ RNA在急性哮喘小鼠中的治疗作用。方法:1.利用高通量测序检测M0(?)-Exo和M2(?)-Exo中circ RNA表达情况,其中在M2(?)-Exo差异高表达的为候选差异circ RNA。2.利用荧光定量PCR(Quantitative PCR,q PCR)检测M0(?)-Exo和M2(?)-Exo中候选差异cir RNA的表达情况,筛选在M2(?)-Exo中相对表达最高且实验结果稳定的为目标cir RNA。3.利用IL-4诱导野生型和干扰组的M0巨噬细胞向M2型转换,向诱导后的干扰组细胞转染目标circ RNA干扰载体,收集外泌体并通过尾静脉注射到哮喘小鼠体内。4.ELISA检测小鼠外周血炎性因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的表达水平;TUNEL染色观察小鼠肺组织细胞凋亡水平;Masson染色观察小鼠肺组织纤维化水平;免疫荧光检测肺组织CD31表达评估内皮细胞损伤情况;荧光染色(二氢乙锭法)检测肺组织ROS水平。结果:1.通过高通量测序筛选出9个在M2(?)-Exo中差异高表达的候选circ RNA。利用q PCR明确其中相对表达水平最高且结果稳定的mmu＿circ＿0001628为目标circ RNA(p<0.001)。2.查阅网站circ Base(http://circbase.org/)提示mmu＿circ＿0001628(circ-Eif3c)是由基因EIF3c(eukaryotic translation initiation factor 3,subunit C)转录后反向剪接RNA成环而来,大小为364 bp。3.与常规M2(?)-Exo组相比,经尾静脉注射干扰circ-Eif3c表达后的M2(?)-Exo实验组,小鼠外周血炎症因子水平、肺组织细胞凋亡程度、肺纤维化及肺组织ROS水平均明显升高(p<0.001),CD31表达水平明显降低(p<0.001)。结论:1.M2(?)-Exo可以通过circ-Eif3c负向调控急性哮喘小鼠炎症因子分泌、肺组织细胞凋亡、肺纤维化、肺组织ROS积聚以及内皮细胞损伤过程,减轻哮喘炎症反应及损伤。第三部分:circ RNA-Eif3c调控mi R-15a-5p/GSS和mi R-15a-5p/SOCS6信号通路对气道上皮细胞氧化应激的影响目的:1.探寻circ RNA-Eif3c下游靶点及其相互作用。2.探究circ RNA-Eif3c调控mi R-15a-5p/GSS、mi R-15a-5p/SOCS6对气道上皮细胞的影响。方法:1.预测并证实circ RNA-Eif3c下游靶分子(1)利用多个生物信息学数据库预测circ RNA-Eif3c下游微小RNA(micro RNA,mi RNA)潜在结合位点,采用Arraystar mi RNA软件初步筛选,再通过Talazoparib溶解度DIANA数据库定向筛选目标mi RNA。利用生物信息学数据方法,筛选目标mi RNA的下游靶点。(2)通过双荧光素酶报告实验探索circ RNA-Eif3c与目标mi RNA间的直接结合及靶向调控作用。(3)通过双荧光素酶报告实验探索目标mi RNA与下游靶点间的直接结合及靶向调控作用。2.circ RNA-Eif3c、mi RNA及下游靶点之间的靶向作用对气道上皮细胞的影响(1)用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导人正常肺上皮细胞(BEAS-2B细胞)构建炎性细胞模型。通过转染质粒构建circ RNA-Eif3c过表达组、circ-Eif3c+mi RNA mimic组、circ-Eif3c过表达+mi RNA下游靶点干扰组。(2)q PCR检测各组气道上皮细胞中circ RNA-Eif3c、mi RNA及其下游靶点表达水平。(3)流式细胞技术检测各组细胞凋亡水平,荧光染色(二氢乙锭法)检测气道上皮细胞内ROS水平,Tubule实验评估气道上皮细胞血管生成能力。结果:1.结合多个数据库预测结果提示mi R-15a-5p可能是circ RNA-Eif3c下游靶点,GSS、SOCS6可能是mi R-15a-5p的下游作用靶点。2.双荧光素酶报告实验发现circ RNA-Eif3c与mi R-15a-5p、mi R-15a-5p与GSS、mi R-15a-5p与SOCS6可靶向结合。3.在利用LPS构建的BEAS-2B炎性细胞模型系列实验中发现:(1)与对照组相比,circ RNA-Eif3c过表达组的circ RNA-Eif3c、GSS、SOCS6表达水平明显上调(p<0.001),而mi R-15a-5p表达显著降低(p<0.001)。(2)与对照组相比,circ-Eif3c过表达+mi R-15a-5p mimic组中circ RNA-Eif3c、mi R-15a-5p、GSS、SOCS6表达均明显上调(p<0.01)。与circ RNA-Eif3c过表达组相比,circ-Eif3c过表达+mi R-15a-5p mimic组中circ RNA-Eif3c的表达无明显差异(p>0.05),而mi R-15a-5p显著增加(p<0.01),GSS以及SOCS6表达水平呈现降低(p<0.01)。(3)与对照组相比,circ-Eif3c过表达+SOCS6干扰组中,circ RNA-Eif3c、GSS表达明显上调(p<0.01),而mi R-15a-5p、SOCS6表达明显降低(p<0.001)。与circEif3c过表达组相比,circ-Eif3c过表达+SOCS6干扰组的circ-Eif3c、mi R-15a-5p、GSS表达均无明显差异(p>0.05),而SOCS6表达明显降低(p<0.001)。(4)与对照组相比,circ-Eif3c过表达+GSS干扰组中,circ RNA-Eif3c、SOCS6表达明显上调(p<0.01),而mi R-15a-5p、GSS表达明显降低(p<0.001)。与circ-Eif3c过表达组相比,circ-Eif3c过表达+GSS干扰组的circ-Eif3c、mi R-15a-5p、SOCS6表达均无明显差异(p>0.05),而GSS表达明显降低(p<0.001)。4.流式细胞学检测结果提示,与对照组相比,其余四组的细胞凋亡水平均明显降低(p<0.001),而与circ-Eif3c过表达组相比,其余三组:circ-Eif3c过表达+mi R-15a-5p mimic组、circ-Eif3c过表达+GSS干扰组、circ-Eif3c过表达+SOCS6干扰组的细胞凋亡水平均较之升高(p<0.001)。5.利用荧光染色(二氢乙锭法)检测细胞内ROS水平可见,与对照组相比,circ RNA-Eif3c过表达组细胞内ROS水平明显降低(p<0.001)。其余三组:circ-Eif3c过表达+mi R-15a-5p mimic组、circ-Eif3c过表达+GSS干扰组、circ-Eif3c过表达+SOCS6干扰组的细胞内ROS水平均较对照组降低(p<0.05),而较circ RNA-Eif3c过表达组升高(p<0.001)。6.Tubule实验可见,与对照组相比,circ-Eif3c过表达组、circ-Eif3c过表达+mi R-15a-5p mimic组、circ-Eif3c过表达+GSS干扰组、circ-Eif3c过表达+SOCS6干扰组中血管生成能力均明显增加(p<0.01)。但与circ RNA-Eif3c过表达组相比,其余三组:circ-Eif3c过表达+mi R-15a-5p mimic组、circ-Eif3c过表达+GSS干扰组、circ-Eif3c过表达+SOCS6干扰组的血管生成能力呈现降低(p<0.01)。结论1.circ-Eif3c可靶向结合mi R-15a-5p,而mi R-15a-5p可与下游GSS、SOCS6靶向结合。2.circ-Eif3c可通过特异性吸附mi R-15a-5p,进一步促进GSS、SOCS6的表达,从而改善气道上皮细胞凋亡,抑制气道上皮细胞内ROS的积聚,促进血管生成及损伤修复。