PBLD是一种吩嗪类生物合成样结构域蛋白,在多种癌症疾病中表达异常,故作为癌症发生的标志性蛋白。在人肠上皮细胞中过表达PBLD会抑制NF-κB,进而抑制TNFα诱导的炎症反应,改善肠道屏障;此外在癌症细胞中PBLD可诱导细胞凋亡维持宿主细胞的健康状态。综上,目前尚无PBLD参与病毒复制及Ⅰ型干扰素信号反应的研究报道。IRF3(Interferon Regulatory Factor 3)又称干扰素调节因子3,不仅是调控Ⅰ型干扰素信号转导通路的关键节点分子,还可诱导细胞凋亡。本研究率先发现PBLD通过IRF3促进抗病毒Ⅰ型干扰素反应及诱导细胞凋亡,并深入探讨其分子机制。研究结果如下:(1)病毒感染下过表达PBLD上调IRF3的表达分别构建稳定过表达和敲除PBLD的He La细胞系,用BPIV3、VSV、HSV-1接种以及RNA病毒模拟物poly(I:C)和DNA病毒模拟物poly(d A:d T)处理,通过RT-q PCR和Western Blot检测,发现过表达PBLD促进IRF3的蛋白表达,而敲除PBLD则抑制IRF3的蛋白表达,表明病毒感染后PBLD上调IRF3的表达。(2)PBLD通过激活IRF3(S385/386)的磷酸化促进病毒介导的Ⅰ型干扰素反应用HSV-1和DNA病毒模拟物poly(d A:d T)处理过表达或敲除PBLD的He La细胞系,通过RT-q PCR和Western Blot检测,发现过表达PBLD促进ISG15、IFITM3的表达,并抑制病毒基因ICP0的m RNA表达,而敲除PBGefitinib-based PROTAC 3抑制剂LD则抑制ISG15、IFITM3的表达,表明PBLD促进抗HSV-1的Ⅰ型干扰素反应。为进一步探讨PBLD与Ⅰ型干扰素关键分子IRF3的关系,在稳定过表达PBLD的He La细胞系中沉默Intrapartum antibiotic prophylaxisIRF3,用BPIV3、VSV、HSV-1接种,通过RT-q PCR和Western Blot检测,发现沉默IRF3后抑制PBLD上调IFNβ和部分ISGs的表达,表明PBLD促进的Ⅰ型干扰素反应依赖于IRF3。成功构建IRF3发生磷酸化的关键位点S385/386和S396位的突变体表达质粒,将其以及野生型的IRF3分别与PBLD共同转进敲除IRF3的He La细胞系中,用BPIV3、VSV、HSV-1接种,通过Western Blot检测,发现IRF3的S385/386位突变抑制p-IRF3和部分ISGs的表达,表明PBLD是通过IRF3的S385/386位发生磷酸化促进Ⅰ型干扰素反应,而非IRF3的S396位。(3)PBLD通过IRF3募集PUMA定位线粒体促进病毒诱导的细胞凋亡用VSV、HSV-1分别接种过表达或敲除PBLD的He La细胞系,通过Western Blot检测,发现过表达PBLD上调C-PARP的表达,敲除PBLD抑制C-PARP的表达,表明PBLD可促进病毒诱导的细胞凋亡。用BPIV3、VSV、HSV-1接种过表达或沉默IRF3的He La细胞,通过Western Blot检测,发现过表达IRF3上调C-PARP的表达,沉默IRF3抑制C-PARP的表达,表明IRF3可促进病毒诱导的细胞凋亡。为探讨PBLD诱导细胞凋亡与IRF3诱导细胞凋亡之间的关系,在稳定过表达PBLD的He La细胞系中沉默IRF3,用BPIV3、VSV、HSV-1接种,通过Western Blot检测,发现沉默IRF3后PBLD促进的细胞凋亡显著减弱,表明沉默IRF3抑制PBLD促进病毒诱导的细胞凋亡。成功构建IRF3诱导细胞凋亡的K193和K313/315位的突变体表达质粒,将其以及野生型的IRF3分别与PBLD共同转进敲除IRF3的He La细胞系中,用BPIV3、VSV、HSV-1接种,通过Western Blot检测,发现IRF3的K313/315位突变抑制C-PARP的表达,表明IRF3的K313/315位是PBLD促进病毒诱导细胞凋亡的关键位点,而非IRF3的K193位。为研究PBLD通过IRF3诱导细胞凋亡的具体机制,通过免疫共沉淀发现IRF3能与PUMA相互作用,并且IRF3与PUMA的相互作用具有PBLD依赖性。通过线粒体分离实验,发现PBLD可促进IRF3和PUMA由细胞质向线粒体转移。通过免疫荧光实验,发现PBLD能增强IRF3与PUMA的相互作用并定位在线粒体上,而敲除PBLD则抑制IRF3与PUMA的相互作用。在敲除PUMA的He La细胞系中分别过表达IRF3和PBLD,用BPIV3、VSV、HSV-1接种,通过Western Blot检测,发现C-PARP的表达均被抑制,表明敲除PUMA抑制IRF3及PBLD促进病毒诱导的细胞凋亡。以上数据表明PBLD通过IRF3募集PUMA定位线粒体促进病毒诱导的细胞凋亡。(4)PBLD通过IRF3介导的Ⅰ型干扰素和诱导的细胞凋亡抑制病毒复制PBLD诱导的细胞凋亡抑制病毒复制。在He La细胞中过表达PBLD后用凋亡诱导剂和凋亡抑制剂处理,通过Western Blot检测和TCID_(50)检测病毒滴度,发现凋亡诱导剂处理后,过表达PBLD促进C-PARP的表达,抑制病毒的复制,而加入凋亡抑制剂后,抑制C-PARP蛋白的表达,促进病毒的复制。PBLD通过IRF3抑制病毒复制。在敲除IRF3的细胞系中过表达PBLD,与对照组相比,敲除IRF3时,PBLD发挥抑制病毒复制的能力较弱;在稳定过表达PBLD的He La细胞系中过表达IRF3,与对照组相比,PBLD和IRF3共同表达时显著抑制病毒复制。PBLD通过IRF3促进Ⅰ型干扰素反应和诱导细胞凋亡抑制病毒复制。分别将IRF3发生磷酸化的S385/386A突变体和IRF3诱导细胞凋亡的K313/315N突变体与PBLD在He La细胞中共同表达,通过TCID_(50)检测病毒滴度,发现PBLD通过IRF3促进Ⅰ型干扰素反应以及PBLD通过IRF3诱导的细胞凋亡均抑制病毒的复制。综上所述,本研究分别从PBLD促进抗病毒Ⅰ型干扰素反应和诱导细胞凋亡的角度,以PBLD通过IRF3调控Ⅰ型干扰素反应及诱导细胞凋亡通路为主线,率先发现PBLD通过IRF3对病毒复制的新功能,揭示PBLDGDC-0973通过IRF3促进抗病毒Ⅰ型干扰素反应及诱导细胞凋亡的分子机制,为抗病毒药物研发提供候选靶标分子及新线索。