H6亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)于1965年首次分离于美国以来,已经在家禽和野生鸟类中呈现地方流行性以及遗传多样性。更值得注意的是,H6 AIV在不断与不同亚型的禽流感病毒进行重组,还出现跨宿主传播人和猪的报道。这都提示我们H6 AIV对于公共卫生存在重大安全隐患。血凝素(HA)是禽流感病毒表面最丰富的糖蛋白,其主要负责与唾液酸受体结合,并促进病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合。同时HA还是流感病毒主要保护性抗原,目前已经鉴定了数个HA亚型的抗原表位,但是H6 AIV的HA抗原表位研究存在空缺,同时市面缺少检测H6 AIV的ELISA试剂盒。1.H6亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备本研究通过用分离于野鸟并在BALB/c小鼠上适应的H6N2 AIV毒株(A/Eurasianteal/Jiangxi/2018WB0417(H6N2))(MAE-Teal/417)免疫 BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,通过间接免疫荧光技术(IFA)对杂交瘤细胞进行筛选,通过两次亚克隆共获得15株H6 AIV的HA单克隆抗体,命名为1A5、1D4、2C5、3B9、3D7、4A7、4B4、4B8、4C2、4G2、5E9、5G2、6D2、6D11以及6E3。为进一步确定这些selleck化学单克隆抗体的特性,对这15株单克隆抗体进行了亚类鉴定、血凝抑制(HI)试验、蛋白免疫印记试验(Western Blot,WB)和ELISA试验。亚类鉴定结果显示15株单克隆抗体均为IgG亚类,其中1D4、3B9、4A7、4G2、5E9、6D11 为 IgG1 亚类,2C5、3D7、6D2 为 IgG2a 亚类,1A5、4B4、4B8、4C2、5G2、6E3为IgG2b亚类;HI试验结果表明,其中 1A5、2C5、3B9、3D7、4B4、4B8、4C2、5G2、6D2、6D11 以及 6E3 等 11 株单克隆抗体具有HI效价,效价为25-213;其他4株单克隆抗体——1D4、4G2、4A7、5E9没有HI效价;WB结果显示,只有6D11没有反应性,其余14株单克隆抗体均能有效结合pDP2002-HA转染的293T细胞中的HA蛋白。ELISA结果显示,15株单克隆抗体均对MA E-Teal/417具有较强的结合能力。为了进一步鉴定这些单克隆抗体的反应谱,我们检测了这15株单克隆抗体与两株和E-Teal/417不同进化谱系的H6 AIV的反应性,ELISA结果显示所有单克隆抗体均能与这两株H6 AIV结合,HI结果显示1 1株具有HI特性的单克隆抗体也均能与这两株H6 AIV有效结合,但结合能力具有较大差异,其中1A5、4C2、5E9和6E3这4株单克隆抗体与所检测的3株H6 AIV反应良好。以上单克隆抗体的研制为下一步鉴定H6抗原表位提供了必要材料。同时筛选到的4株与H6 AIV反应良好的单克隆抗体为后续建立检测H6 AIV双夹心ELISA方法提供了材料基础。2.抗体压力下H6 AIV的HA蛋白抗原位点氨基酸变异分析为鉴定H6禽流感病毒HA抗原表位,我们用具有HI效价的11株单克隆抗体制备MA E-Teal/417病毒抗体逃逸株。结果11株单克隆抗体共制备15株抗体逃逸株,通过对逃逸株HA序列进行测序分析,共发现9个氨基酸位点发生变异,分别Biodegradation characteristics是69、89、120、124、139、140、149、221、246 位点。通过对 NCBI 上公布的 2270株H6 AIV HA全序列分析发现,田间野生的H6 AIV在这9个位点上氨基酸都有不同程度的突变。鉴于4C2和6E3单克隆抗体靶的结合位点在相对保守的140和89位氨基酸,我们以BALB/c小鼠为模型,检测了这两株单克隆抗体对病毒的保护性,结果显示这两株单克隆抗体对于小鼠具有很好的预防效果,同时也具有相对良好的治疗效果。3.双抗体夹心ELISA方法的建立鉴于目前市面缺少检测H6AIV的ELISA试剂盒,我们用筛选出的4株(1A5、4C2、5E9、6E3)与所检测的H6 AIV反应性均较好的单克隆抗体建立检测H6 AIV抗原的双夹心ELISA方法。首先我们对这4株单克隆抗体进行过氧化酶标记,并用未酶标的单克隆抗体与酶标后的单克隆抗体交叉组合进行双抗体夹心ELISA试验;结果确定5E9株单克隆抗体作为捕获抗体,酶标6E3单克隆抗体作为检测抗体具有良好的检测效果。我们进一步对建立的ELISA方法进行优化,确定捕获抗体的浓度为4μg/mL,用2%BSA封闭液37℃封闭60 min,被检测的抗原37℃下作用时间为90 min,用1%脱脂乳将HRP标记6E3抗体稀selleck激酶抑制剂释成0.76μg/mL,37℃下反应60 min,TMB显色15 min为效果最好。同时对此ELISA方法的灵敏度、特异性及稳定性进行检测。结果显示此ELISA方法最低检测病毒低度为2.32 × 103 TCID50/mL,与 AIV-H1、AIV-H3、AIV-H4、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、AIV-HI0、AIV-H12 及FAdV-4、DAdV-3、IBV、NDV、GAstV、GPV、ALV、FAdV-8、IBDV 病毒不能反应,显示其有很好的特异性;批内重复实验的变异系数为1.55%-6.26%,批间重复性实验的变异系数为1.97%-7.13%,这表明该方法具有较好的稳定性。