己糖激酶(HXK)作为一个双功能酶,不仅催化糖酵解反www.selleck.cn/products/VX-765应第一步,促使植物体内糖代谢正常进行,还担任葡萄糖信号感知器,参与调控植物的生长发育、次生代谢和逆境响应等过程。由于目前对于HXK的糖信号感知功能的机理和互作因子的研究主要集中在拟南芥等模式植物中,在草莓等果树作物中研究尚少。本试验通过对二倍体草莓HXK基因家族的生物信息学分析、亚细胞定位、激酶活性关键位点突变、拟南芥HXK1功能缺陷突变体gin2-1的回补等试验,探究五叶草莓FpHXK1的葡萄糖信号感知功能及其机理;通过瞬时转化,分析FpHXK1及其激酶活性对草莓果实糖代谢的影响;通过NAG抑制五叶草莓HXK激酶活性以及FpHXK1转基因拟南芥材料的干旱胁迫处理,探究FpHXK1及其激酶https://www.selleck.cn/products/empagliflozin-bi10773.html活性对干旱胁迫的响应;通过构建转基因五叶草莓Cell Analysis材料,为免疫共沉淀与质谱联用挖掘FpHXK1的互作蛋白提供材料。主要结果如下:1.通过生物信息学分析,鉴定了森林草莓(Fragaria vesca)和五叶草莓(Fragaria pentaphylla)中各存在4个HXK基因。分析结果Fv HXK1(FpHXK1)与拟南芥At HXK1在氨基酸序列和动力学特征上最相似。设计特异性引物,克隆获得五叶草莓FpHXK1开放阅读框(m ORF),构建FpHXK1::e GFP重组质粒,分别以带红色荧光的细胞核标记m Cherry-Fa HY5和线粒体标记m Cherry-At SRT2为对照,在本氏烟草中检测FpHXK1蛋白的亚细胞分布,结果显示FpHXK1大部分定位于线粒体,少部分定位于细胞核。2.通过SOE-PCR将FpHXK1第177位丝氨酸突变为丙氨酸(S177A),构建p EAQ-FpHXK1和p EAQ-FpHXK1~(S177A)过表达载体,在本氏烟草中过表达重组蛋白,测定和比较两者激酶活性,结果表明FpHXK1~(S177A)的激酶活性显著降低,说明第177位丝氨酸是FpHXK1激酶活性发挥的关键位点之一。3.在草莓果实中瞬时过表达FpHXK1和FpHXK1~(S177A),以空载为对照。结果显示35S::FpHXK1转化果实葡萄糖、蔗糖含量波动不大,35S::FpHXK1~(S177A)果实葡萄糖和蔗糖含量显著高于空载和35S::FpHXK1;35S::FpHXK1果实中花青素含量显著高于空载;35S::FpHXK1~(S177A)果实中总酚含量显著低于空载和35S::FpHXK1。表明FpHXK1参与调控草莓果实初生代谢和次生代谢,并且受其激酶活性影响。4.PEG-6000模拟干旱条件下,以不含PEG-6000的缓冲液处理为对照,NAG抑制HXKs激酶活性的五叶草莓苗受到严重胁迫,其过氧化酶系统被破坏,ABA合成被抑制,干旱诱导基因也被抑制表达。构建FpHXK1和FpHXK1~(S177A)稳定过表达拟南芥植株,干旱条件下At HXK1功能缺陷型突变体gin2-1和野生型Ler受胁迫最明显,35S::FpHXK1和35S::FpHXK1~(S177A)转基因植株对干旱的耐受能力更强。5.35S::FpHXK1和35S::FpHXK1~(S177A)分别回补转化拟南芥At HXK1功能缺陷型突变体gin2-1。结果表明35S::FpHXK1转基因拟南芥幼苗在6%葡萄糖培养基中不能正常生长,光合作用相关基因CAA/CAB转录被抑制,表现和野生型一致。而35S::FpHXK1~(S177A)转基因拟南芥幼苗在6%葡糖糖培养基中能正常生长,表现类似gin2-1,子叶扩张和根系生长优于gin2-1,高水平葡萄糖对CAA/CAB的转录抑制效应也被打破。35S::FpHXK1转基因植株的分枝数量和花苔粗度与野生型一致,但抽苔期明显延迟;而35S::FpHXK1~(S177A)的长势与gin2-1相似,抽苔数较少,枝条纤细,叶片皱缩。说明FpHXK1对高水平葡糖糖敏感,具有感知葡萄糖信号功能,并且对葡萄糖信号的感知依赖其激酶活性。6.构建了地塞米松诱导型FpHXK1和FpHXK1::3×Flag转基因五叶草莓材料,以及FpHXK1基因编辑五叶草莓材料,为后续Co IP-MS挖掘和鉴定FpHXK1互作蛋白提供了材料。