目的本文通过顺铂(Cis-dichlorodiammine platinum(Ⅱ),CDDP)研究铁死亡(Ferroptosis)对卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)的促进作用,并探讨铁抑素-1(Ferrostatin-1,FER-1)抑制ferroptosis对卵巢功能的影响及相关机制,为治疗化疗损伤性POF提供新思路。方法第一部分构建大鼠卵巢颗粒细胞(Ovarian granulosa cells,GCs)模型,分为6组:对照组(CON组)、模型组(CDDP组)、FER-1预处理组(FER-1组)、GSH过氧化物酶4抑制剂(1S-3R-RSL3,RSL3)预处理组(RSL3组)、治疗组(CDDP+FER-1组)和过损伤组(CDDP+RSL3组)。通过CCK8法检测不同影响因素下的细胞活力,确定后续实验的药物浓度。1.选择Ferro Orange探针检测细胞内Fe2+水平,用Mito-Ferrogreen探针分析线粒体Fe2+水平。2.使用DCFH-DA检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,采取Mito SOX Red探针观察线粒体ROS水平。3.通过Rhodamine123探针检测线粒体膜电位水平。第二部分建立POF大鼠模型,分为3组:对照组(CON组)、模型组(CDDP组)和治疗组(CDDP+FER-1组)。采用阴道涂片监测大鼠动情周期,选取酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法分析血清促卵泡激素(Follicle stimulating hormone,FSH)、雌二醇(Estradiol,E2)水平,测量大鼠体重、双侧卵巢及子宫湿重分别计算卵巢指数、子宫指数。1.通过丙二醛(Malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、总谷胱甘肽(Glutathione,GSH)评估大鼠机体氧化应激水平。2.利用亚铁嗪法检测卵巢组织内Fe2+含量。3.采取蛋白印迹法分析Keclch样ECH关联蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1,KEAP-1)、核红细胞E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2 related factor 2,NRF2)、血红素加氧酶-1(Haemoxygenase-1,HO-1)和谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的相对蛋白表达水平。结果第一部分大鼠GCs模型:将30μmol/L CDDP、30μmol/L FER-1和3μmol/L RSL3作为实验药物浓度。1.相比于CON组,FER-1组无明显变化(P>0.05),差异无统计学意义。与CON组比较,CDDP组和RSL3组细胞内、线粒体都有Fe2+蓄积(P<0.01),差异有统计学意义。与CDDP组相比,CDDP+RSL3组细胞内、线粒体Fe2+水平可继续增加(P<0.01);CDDP+FER-1组可改善细胞内、线粒体过量Fe2+的现象(P<0.01),差异均具有统计学意义。2.与CON组比较,FER-1组未有显著Pevonedistat改变(P>0.05),差异无统计学意义。相比于CON组,CDDP组和RSL3组细胞内、线粒体均产生过量ROS(P<0.01),差异有统计学意义。相比与CDDP组,CDDP+RSL3组细胞内、线粒体ROS水平将进一步升高(P<0.01);CDDP+FER-1组细胞内、线粒体ROS水平则明显降低(P<0.01),差异均有统计学意义。3.与CON组相比,FER-1组线粒体膜电位未见明显变化(P>0.05),差异无统计学意义。与CON组比较,CDDP组和RSL3组都有部分线粒体膜电位丧失(P<0.01),差异有统计学意义。与CDDP组相比,CDDP+RSL3组中线粒体膜电位大部分丧失(P<0.01);CDDP+FER-1组可明显恢复线粒体膜电位(P<0.01),差异均有统计学意义。第二部分POF大鼠模型:与CON组相比,CDDP组动情周期紊乱,FSH水平升高(P<0.01)、E2水平降低(P<0.01)、卵巢指数和子宫指数均下降(P<0.01),差异均有统计学意义。与CDDP组相比,CDDP+FER-1组经两周治疗后,可改善紊乱的动情周期、减低FSH水平(P<0.01)、提高E2水平(P<0.05)、卵巢指数和子宫指数均有回升(P<0.01),差异均有统计学意义。1.相比于CON组,CDDP组血清MDA水平增加(P<0.01)、血清SOD含量减少(P<0.01)、组织总GSH水平降低(P<0.01),差异均有统计学意义。与CDDP组相比,CDDP+FER-1组血清MDA水平降低(P<0.01)、血清SOD含量增多(P<0.01)、组织总GSH水平升高(P<0.05)差异均具有统计学意义。2.相比于CON组,CDDP组卵巢组织铁含量增加(P<0.01),差异有统计学意义。与CDDP组相比,CDDP+FER-1组卵巢组织铁含量减少(P<0.01),差异有统计学意义。3.与CON组比较,CDDP组KEAP-1蛋白表达升高(P<0.01),NRF2(P<0.05)、HO-1(P<0.01)及GPX4(P<0.01)蛋白表达降低,差异均有统计学意义。与CDDP组相比,CDDP+FER-1组KEAP-1蛋白表达下降(P<0.01)、NRF2(P<0.05)、HO-1(P<0.01)和GPX4(P<0.01)蛋白表达升高,差异均有统计学意义。Medical officer结论1.CDDP引发的selleck激酶抑制剂卵巢功能障碍和GCs损伤中存在ferroptosis。2.RSL3促进ferroptosis使GCs损伤加重,FER-1抑制ferroptosis减轻GCs损伤。3.FER-1可调节血清FSH、E2激素水平,改善卵巢氧化应激状态。4.FER-1通过KEAP-1/NRF2/HO-1通路抑制ferroptosis,改善CDDP诱导的卵巢损伤。