目的:果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)缺乏症是由果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)基因突变导致的常染色体隐性遗传性疾病。果糖-1,6-二磷酸酶是糖异生途径中的关键催化酶,该酶的缺陷导致1,6-二磷酸果糖不能转化为6-磷酸果糖,影响丙酮酸、乳酸、甘油等糖异生底物向葡萄糖转化,导致胰高血糖素抵抗性低血糖。患儿在糖原储存减少和饥饿、感染、应激等糖原大量消耗的情况下,极易发生低血糖、高乳酸血症和代谢性酸中毒。由于该病临床表现多样且症状缺乏特异性,易与其他遗传代谢病混淆,近几年得以深入开展的基因检测技术使该病的及时、有效诊断成为可能。本研究报告一个FBPase缺乏症的中国男孩的反复低血糖和癫痫发作临床表型,鉴定了FBP1基因存在c.761A>G(H254R)和c.962C>T(S321F)复合杂合突变,并阐明NEDD4-2介导的突变型FBP1泛素化增强和蛋白酶体降解的分子机制。研究方法:1.Nedd4-2基因敲除小鼠在本研究课题组前期研究中已经构建完成。2.收集患儿急性发病期的尿液标本,并用气相色谱/质谱(GC/MS)检测甘油、乳酸及甘油三磷酸;回顾患儿病史,收集脑部核磁共振结果及多次急性发病时碳酸氢钠、乳酸、葡萄糖数值。3.患儿及父母进行全外显子测序和一代测序突变位点验证,筛选潜在的致病变异;应用SIFT、Mutation Taster和polyphen2对突变位点有害性进行评分。4.使用Mega version 7软件针对患儿突变位点进行物种保守性分析。5.通过文献检索和综述、查询Clin Var和HGMD数据库对FBP1基因突变谱分析总结。6.构建HA标记的野生型以及S321F和H254R突变型FBP1表达载体,并转染Hep G2和U251细胞。Western blot检测转染野生型、S321F、H254R或空白对照的Hep G2和U251细胞中的FBP1蛋白水平。7.为了检测突变型FBPase酶活性是否降低,NADP-耦合分光光度法检测转染FBP1突变型的细胞系中和患者及其父母外周血白细胞中FBPase酶活。8.为了检测突变型FBP1蛋白稳定性,野生型、S321F、H254R突变型FBP1转染Hep G2细胞和U251细胞,给予放线菌酮(CHX,100μg/m L)处理0、2、4小时,CB-839Western blot检测FBP1表达变化。9.为了检测突变型FBP1泛素化水平,野生型、S321F、H254R突变型FBP1转染Hep G2细胞和U251细胞,Co-IP检测细胞系中FBP1与Ub的结合。10.为了证实突变型FBP1降解途径,用蛋白酶体抑制剂MG132处理Hep G2细胞和U251细胞24小时,Western blot检测野生型、S321F、H254R突变型FBP1表达变化。11.Ubi Browser预测FBP1的泛素E3连接酶。12.HDOCK Server软件分析FBP1与NEDD4-2的蛋白-蛋白相互作用,Py Mol软件分析二者的分子对接。13.为了体内、体外证实Nedd4-2对Fbp1的负调控作用,Western blot检测Nedd4-2~(+/-)小鼠和培养细胞中Nedd4-2和Fbp1蛋白水平。14.为了体内、体外证实Fbp1是Nedd4-2新的泛素化底物,Co-IP检测Nedd4-2~(+/-)小鼠模型中和培养细胞中Nedd4-2与Fbp1结合。结果:1.GC/MS分析患儿急性期尿液有机酸代谢物,表明甘油、乳酸、酮类含量升高;对既往发病急性期的葡萄糖、碳酸氢盐和乳酸进行回顾性分析发现患儿葡萄糖、碳酸氢钠水平降低,乳酸升高;脑部核磁表明侧脑室扩张,胼胝体变薄,额叶萎缩;腹部CT未发现肝脏等器官异常。2.外显子测序在FBP1基因中发现了2个杂合变异,其中c.962C>T(p.S321F)可在NCBI db SNP数据库(rs747191202)和Ex Ac数据库中的等位基因频率为0.000008。c.761A>G(p.H254R)为新突变,在db SNP、1000基因组和Exome Variant Server数据库中未见报道。一代测序表明变异是分别遗传自父母的复合杂合突变。SIFT、Mutation Taster和polyphen2有害性预测结果表明两种突变有害。3.通过氨基酸保守性分析发现,患者的两个突变位点在上述11种物种间高度保守。4.通过文献综述及HGMD和Clin Var数据库分析,发现58种FBP1基因突变(不包括8种涉及FBP1基因的大片段缺失),中国人群共报道FBP1基因突变导致的果糖-1,6-二磷酸酶缺乏症20余例。5.Western blot结果表明,S321F突变型较野生型FBP1蛋白水平显著降低;H254R突变型FBP1几乎检测不到,双突变型表达也下降(P<0.05)。6.NADP-耦合分光光度法检测发现与野生型相比,转染细胞的突变型FBPase活性明显下降,顺序为Adavosertib浓度S321F>S321F+H254R>H254R,与蛋白表达水平平行;同时,与20名健康对照组相比,患儿外周血白细胞的FBPase活性显著降低,母亲(携带H254R突变)也有所降低,父亲(携带S321F突变)仅略有降低,与细胞系检测的结果一致。7.Western blot所示,与野生型对照相比,在CHX处理2 h和4 h后,H254R突变型FBP1蛋白不稳定而表达水平急剧下降,S321F突变型FBP1水平与野生型相当。8.Co-IP结果表明,H254R突变型FBP1的泛素化水平显著增强,S321F突变型FBP1的泛素化与野生型对照无显著差异。9.Western blot表明,用MG132蛋白酶体抑制剂对转染细胞处理24小时,H254R突变型FBP1的蛋白水平得到明显恢复。10.Ubi Browser预测FBP1的泛素E3连接酶,NEDD4-2置信度较高。11.HDOCK在线预测NEDD4-2可以与FBP1对接,S321F突变位于互作接合面之外,而H254R突变位于接合面,H254R突变型FBP1拉近了与NEDD4-2分子E57的平均距离,并增加了一个新的氢键。12.Nedd4-2~(+/-)小鼠肝脏和脑组织Western blot检测可见Nedd4-2表达下降呈单倍剂量不足,Fbp1表达上调,约为野生型对照的2倍;Hep G2和U251细胞分别通过si RNA敲低NEDD4-2和转染质粒过表达NEDD4-2,Western blot检测可见NEDD4-2敲低的细胞系中FBP1表达增加,NEDD4-2过表达的细胞系中FBP1表达降低。13.Nedd4-2~(+/-)小鼠肝脏和脑组织Co-IP检测提示Nedd4-2与Fbp1存在相互作用,与野生型对照相比,Nedd4-2~(+/-)小鼠的相互作用结合带减弱;NEDD4-2与野生型、S321F、H254R突变型FBP1共转染Hep G2和U251细胞,Co-IP检测可见:NEDD4-2免疫沉淀、FBP1免疫印迹时,NEDD4-2与H254R突变型FBP1结合带信号增强;FBP1免疫沉淀、NEDD4-2免疫印迹时,H254R突变型FBP1可能因不稳定而与NEDD4-2结合信号减弱。结论:1、本项目从临床病例入手,首次鉴定FBP1基因的c.761A>G(p.H254R)为果糖-1,6-二磷酸酶缺乏症的新致病突变。2、H254R突变型FBPinterstellar medium1泛素化和蛋白酶体降解增加,通过患者外周血白细胞和体外培养的细胞系,检测FBP1基因变异降低了FBP1的蛋白表达和酶活性。3、通过体外培养的细胞系和Nedd4-2基因敲除小鼠模型,证明FBP1是NEDD4-2的新泛素化底物,并鉴定H254R突变型FBP1不稳定性增加,通过与NEDD4-2结合引起泛素化修饰,并通过蛋白酶体途径降解。