研究背景:自2013年被《Science》杂志评为年度最重要的突破以来,肿瘤免疫疗法一直是人们关注的焦点。肿瘤免疫疗法包括检查点抑制剂和过继细胞疗法,调控免疫系统来识别和杀伤肿瘤细胞。肿瘤免疫疗法存在以下特征:肿瘤微环境的选择性靶向、使得肿瘤免疫正常化以及肿瘤微环境中免疫反应的重塑。近几年来,以抗CTLA-4和PD-1为代表的免疫检查点抑制剂通过促进免疫反应的激活或缓解免疫抑制在多种肿瘤患者的治疗中取得了Standardized infection rate良好的治疗效果。然而,由于肿瘤发生发展过程中多环节、多步骤的复杂性以及对其中机制了解的不透彻,迄今为止,肿瘤免疫疗法在多种肿瘤类型中疗效有限。单一的免疫检查点抑制剂往往容易产生新的免疫耐受进而导致肿瘤的无反应或者复发。双重阻断T细胞上的PD-1/CTLA-4共抑制受体在黑色素瘤患者中显示出良好的治疗效果。在与免疫系统的长期相互作用中,肿瘤细胞可以利用多种机制来抵抗免疫细胞的监视和杀伤,其中包括多种免疫检查点分子的上调。除了经典的PD-L1/PD-1通路以外,还有许多其他抑制性分子共同调节肿瘤微环境的免疫状态和强度。目前已有多项研究表明,联合抑制多个免疫调节位点可以加强肿瘤的治疗效果。CD155(NECL-5/PVR/TAGE4)是连接素/连接素样分子家族的成员之一,可以与PDGF受体和整合素ανβ3合作,降低细胞间的接触抑制,在细胞粘附、运动、增殖和生存中发挥重要作用。CD155在大多数成人器官上表达很低,而在多种癌症类型的肿瘤细胞上异常高表达,并与患者预后较差相关,提示CD155分子可能有利于肿瘤细胞在体内的生长。CD155分子可以与细胞表面受体相互作用,包括共抑制性的T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、共刺激受体CD226(DNAM-购买AZD67381)以及目前存在争议的受体CD96。这三种受体之间的平衡调节抗肿瘤免疫反应。CD155分子与PD-L1相似,在抗原提呈细胞上低表达,并可以被LPS、IL-6、IFN-γ等炎症因子上调,在肿瘤细胞上高表达。分别对应于CD155和PD-L1分子的受体TIGIT和PD-1,作为免疫检查点分子,在肿瘤浸润性免疫细胞上上调,从而发挥免疫抑制功能。阻断PD-1或其配体PD-L1的抗体ABT-263 molecular weight已被批准用于治疗非小细胞肺癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤等各种实体癌和血液系统恶性肿瘤。目前对CD155的研究还不够充分,需要更多的探索性研究。研究目的:本研究通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术,成功构建了CD155基因敲除的B16F10细胞系和MC38细胞系,对CD155基因的功能进行初步的探索。检测CD155分子对多种肿瘤细胞体外生长的影响,并揭示CD155分子在肿瘤细胞和/或宿主细胞缺失时对肿瘤微环境中免疫细胞状态的影响。对CD155免疫检查点分子和免疫逃逸相关机制的研究可以为开发针对性免疫疗法提供理论依据。研究方法:通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建CD155敲除的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10-CD155KO和小鼠结肠癌MC38-CD155KO细胞系。通过几次流式分选的方式将经过转染过CD155 sg RNA的B16F10-CD155KO细胞和MC38-CD155KO细胞分选出来并进行体外扩增,以获得较高纯度的B16F10-CD155KO细胞和MC38-CD155KO细胞;通过将相同数量的control(野生型)肿瘤细胞及CD155KO肿瘤细胞在体外共培养,并用流式细胞术分析CD155对肿瘤细胞体外生长的影响;将野生型(B16F10-control)和CD155缺陷的细胞株(B16F10-CD155KO)分别通过皮下注射的方式移植到WT的小鼠,15天后将皮下瘤取下消化,通过流式细胞检测肿瘤浸润的NK、CD4~+T和CD8~+T细胞上DNAM-1、CD96分子的百分比及表达水平;将野生型和CD155缺陷的细胞株(B16F10)分别通过皮下注射的方式移植到WT和CD155~(-/-)的小鼠。12天将皮下瘤取下消化,通过流式细胞检测肿瘤浸润的宿主髓系细胞和NK、CD4~+T和CD8~+T细胞。分析CD155在肿瘤细胞和宿主细胞的缺失对肿瘤微环境中免疫细胞状态的影响。实验结果:通过CRISPR/Cas9靶向敲除CD155基因之后,通过流式检测发现得到的具有较高纯度的B16F10-CD155KO细胞系,提示成功建立敲除CD155基因的B16F10-CD155KO细胞和MC38-CD155KO细胞;将相同数量的肿瘤control细胞及CD155KO细胞在体外进行共同培养,流式细胞术检测发现CD155阳性细胞和CD155阴性细胞均维持在50%左右,说明CD155阳性细胞和CD155阴性细胞均没有明显的生长优势;WT小鼠皮下种瘤(B16F10-control或B16F10KO),15天后取瘤消化,流式细胞检测肿瘤浸润的NK、CD4~+T和CD8~+T细胞上DNAM-1和CD96分子的百分比以及表达水平,发现CD155在肿瘤细胞的缺失使肿瘤微环境中DNAM-1阳性的NK细胞比例、CD96阳性的NK、CD4~+T和CD8~+T细胞比例增加;肿瘤微环境中CD8~+T细胞上CD96的表达水平也上调;通过流式细胞检测肿瘤浸润的宿主髓系细胞和NK,CD4~+T,CD8~+T细胞,B16F10肿瘤微环境中可以发现CD155分子可以从CD155阳性肿瘤细胞(B16F10-Ctrl)转移到CD155~(-/-)小鼠宿主的CD11b~+髓系细胞。B16F10肿瘤微环境中还发现CD155在肿瘤细胞的缺失和宿主细胞的缺失共同增加肿瘤微环境中NK细胞、CD4~+T和CD8~+T细胞上DNAM-1的表达水平。结论:CD155不影响肿瘤细胞的体外生长;CD155在肿瘤细胞的缺失会破坏肿瘤微环境中相关受体之间的平衡;CD155在肿瘤细胞和宿主细胞中的缺失协同上调肿瘤微环境中免疫细胞上DNAM-1的表达水平。