甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国主要的油料作物,是食用油的重要来源。菜籽油的品质与油菜籽粒颜色密切相关,相对于黑籽油菜,黄籽油菜具有蛋白质含量高、种皮薄、油质清澈的特点,黄籽油菜是主要的育种目标。黄色籽粒的形成是由于种皮内皮层类黄酮物质原花青素合成受阻,种皮缺少色素而呈现种胚的颜色即黄色。甘蓝型油菜在自然种质中无黄籽资源,且遗传背景复杂,得到稳定遗传的甘蓝型黄籽油菜十分困难。目前甘蓝型油菜关于粒色的研究,大部分是以拟南芥类黄酮途径为基础,在油菜中找到其同源基因并进行验证。但甘蓝型油菜是异源四倍体,存在大量同源基因,与拟南芥相比,粒色调控机制更为复杂。前期已经通过QTL定位与全基因组关联分析找到一些重要QTL位点与相关候选基因,但候选基因功能并未进行验证,油菜粒色调控网络仍然需要完善。因此,挖掘调控油菜粒色的关键基因,解析甘蓝型油菜粒色的分子调控机制对育成高品质油菜具有重要意义。本研究通过对甘蓝型油菜中双11不同发育时期的种皮进行转录组共表达分析,发现了一个hub基因BnaC03.MYB56,可能参与苯丙烷合成途径、花青素与原花青素合成途径,目前BnaC03.MYB56在甘蓝型油菜中是否参与类黄酮途径物质合成还未见报道。本研究围绕BnaC03.MYB56在甘蓝型油菜种皮色素合成中的生物学功能进行初步探究,主要结果如下:(1)通过对中双11不同时期组织器官转录组数据和定量PCR结果进行分析,甘蓝型油菜中MYB56的六个同源基因,BnaC03.MYB56与BnaA03.MYB56两个基因在花后20-30天的种皮中高水平表达,且BnaC03.MYB56基因表达水平最高,此外在花、根中仅有少量表达。将BnaC03.MYB56基因启动子与带有GUS标签的表达载体融合并转化野生型拟南芥,对纯合转基因拟南芥进行GUS染色,在早期的种子、苗期的根、毛状体和花序中检测到较强GUS信号,与定量结果基本一致。亚细胞定位结果表明BnaC03.MYB56定位于细胞核中,转录活性分析显示BnaC03.MYB56具有较高的转录抑制活性。(2)我们构建BnaC03.MYB56超表达载体转化野生型拟南芥,观察其表型。与野生型拟南芥相比,突变体拟南芥未发现显著表型差异,但超表达拟南芥种子颜色偏黄,种皮色素积累减少;利用香草醛进行种子染色,发现超表达种子染色更浅;进一步利用UPLC-HESI-MS/MS对超表达种子进行次生代谢物分析,结果发现表儿茶素与原花青素的三种复合体含量显著减少。此外,超表达植株整体长势较弱,叶片小且卷曲,根系短,侧根发育异常,表明BnaC03.MYB56能影响拟南芥生长发育。(3)通过遗传转化和组织培养获得BnaC03.MYB56超表达油菜,表型分析发现超表达油菜花后25天的种子经过香草醛染色后,比对照的染色更浅。进一步对其进行UPLC-HESI-MS/MS检测,所检测selleck激酶抑制剂到的差异代谢物主要包括类黄酮类物质,其中表儿茶素与原花青素的五种复合体均显著减少,此外以山奈酚与芥子酸为标量的相关物质含量同样减少,而以槲皮素为标量的物质含量增加,但并不显著,结果表明BnaC03.MYB56影响油菜种子类黄酮物质和原花青素合成。(4)构建BnaC03.MYB56及其同源基因的敲除载体,通过遗传转化与组织培养获得了25棵植株,经靶点序列检测得到一株敲除成功的油菜以待后续研究。(5)我们对对照和超表达油菜种子进行转录组测序,KEGG分析结果表明,差异表达基因主要富集在苯丙烷合成途径、淀粉蔗糖代谢途径和类黄酮合成途径。我们筛选出BnaC03.MYB56下游调控的候选靶基因BAN2、CHIL2、4CL、LDOX、FLS2与DFR1,启动子分析结果显示,这些基因均具有MYB结合位点。q RT-PCR表明,相较于对照,所有候选靶基Entinostat体外因在超表达油菜中的表达水平均显著下调。我们对对照和超表达拟南芥类黄酮途径关键基因的表达水平进行q RT-PCR检测,发现At PAL、At C4H、At4CL、At CHI、At BAN、At LDOX、At DFR、At TTG1和At TT8均下调表达,表明BnaC03.MYB56通过负调控类黄酮途径相关基因表达减少原花青素及其衍生物的合成。通过Y2H和Bi FC实验发现BnaC03.MYB56与类黄酮调节因子BnaMYB61、根系发育蛋白BnaMYB77、木质素相关蛋白BnaMYB54以及功能未知蛋白Bnab HLH96相互作用。综上所述,BnaC03.MYB56能负调控类黄酮途径关键基因的转录水平,从而减少类黄酮和原花青素等物质的含量使种皮色素积累减少。BnaC03.MYB56在甘蓝型油菜粒色形成中具有重要意义,其分Cometabolic biodegradation子作用机制还需继续探究。