Author: admin

目的:调查耳内科疾病病人的疾病感知现状，探讨其影响因素，为改善病人负性疾病感知提供依据，为医Erdafitinib溶解度护人员实施干预提供切入点。方法:选择2021年6月12日—2022年1月18日于某医院耳鼻咽喉科住院的耳内科疾病病人Muscle biomarkers为研究对象，设计调查工具含一般资料调查表、广泛焦虑量表-2、病人健康问卷-2、维克森林医师信任量表、10项目大五人格量表及疾病感知问卷简化版，采用问卷星或纸质版问卷进行调查，运用单因素分析、Pearson相关LY-188011纯度分析及多元线性回归对数据进行分析。结果:114例耳内科病人疾病感知得分为(53.04±9.43)分。单因素分析显示疾病感知可能影响因素有性别、就医第一症状、发病次数、费用影响、自感首要致病原因、自感治疗效果(P<0.05)。Pearson相关系数分析显示，疾病感知与焦虑、抑郁得分呈正相关(P<0.05),而与医护仁爱呈线性负相关(P<0.05);多元线性回归分析显示，疾病感知的独立影响因素为医护仁爱、就医第一症状眩晕及焦虑。结论:耳内科疾病病人对疾病认知不足，深受疾病症状尤其眩晕症状的影响，表现出较多消极情绪尤其焦虑情绪，对医护人员尤其仁爱缺乏信任。因此，医护人员应当关注此类病人的疾病感知，尤其有眩晕症状的病人，给予关爱，通过心理干预方法减轻病人焦虑情绪。

随着糖尿病发病率的升高,目前糖尿病肾病(DKD)已成为慢性肾脏病的首要病因之一,除肾脏病理活检外,通过血清、尿液特异标志物等获得糖尿病肾病早期诊断对改善患者预后有重要意义Belnacasan溶解度。外泌体是一种细胞外囊泡,可参与细胞间信息交流、免疫调节等病理生理过程。由于外泌体具有易获取、稳定性高、诊断特异性高等优点,目前已成为糖尿病肾病病理生理机制的探索及早期诊断的研究热点。间充质干细胞外泌体可降低糖尿病肾病肾组织内白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤PR-171说明书坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子表达,抑制炎症反应biomass pellets、改善肾脏纤维化,已有临床试验证实干细胞治疗对糖尿病患者有保护肾脏的作用。近年来研究发现,细胞自噬作用减弱是糖尿病肾病发生及发展的重要病理生理机制之一,外泌体可通过雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径调节细胞自噬,减轻糖尿病肾病足细胞损害,因此自噬相关基因或蛋白可成为糖尿病肾病潜在的治疗靶点。

目的 探究系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患儿血清降解单糖水平变化特征及其与病情严重程度、免疫功能紊乱的关系。方法 回顾性收集2019年1月—2022年3月青岛大学附属医院首次确诊并住院治疗的SLE患儿及同期体检且年龄、性别与SLE患儿按1∶1比例相匹配的健康儿童临床资料。以健PEG300溶解度康儿童为对照，分析SLE患儿血清甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖5种降解单糖水平变化，并对不同疾病活动度SLE患儿进行组内比较。采用Pearson线性相关法分析Protein Biochemistry血清降解单糖水平与SLE患儿疾病活动度及免疫指标的相关性。结果 共入选符合纳入与排除标准的SLE患儿45例(轻度疾病活动13例、中度疾病活动15例、重度疾病活动17例),健康儿童50名。相较于健康儿童，SLE患儿血清甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖水平均升高(P均<0.05),且血清甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖水平随疾病活动度增加而逐渐升高(P均<0.05),不同疾病活动度SLE患儿的氨基葡萄糖、氨基半乳糖水平均无显著差异(P均>0.05)。Pearson相关性分析FG-4592溶解度显示，血清降解单糖水平与疾病活动度及多种免疫指标存在正相关。结论 SLE患儿血清降解单糖水平升高且部分降解单糖水平与疾病活动度及免疫功能紊乱具有相关性。

龋齿是一种慢性口腔疾病,防治不当甚至会引发全身疾病,严重危害人民身体健康。填充修复是治疗龋齿的重要手段,从获悉更多传统银汞合金到牙科复合树脂,龋齿修复填充材料不断得以发展。牙科复合树脂凭借良好的生物相容性和与自然牙齿相近的美观性,已被广泛应用于临床牙齿的修复。然而,口腔环境内的细菌滋生易引起继发龋,导致复合树脂修复失败。因此,研发具有抗菌性能的牙科复合树脂是防止继发龋并延长复合树脂服役寿命的关键。目前,关Bio finishing于抗菌型牙科复合树脂的研究已有一定的进展,但是依然存在与牙体组织相容性不好和抗菌时效较短等问题。研究发现,桦木醇是一种天然五环三萜类化合物,具有良好的生物相容性、抗菌和抗癌性能。因此,本课题选用桦木醇作为Trichostatin A研究对象,通过对桦木醇的分子结构进行改性,制备新型抗菌单体,并进一步将其与双酚A-双甲基丙烯酸缩水甘油酯(Bis-GMA)、双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯(TEGDMA)按照一定比例进行共混,探究桦木醇基抗菌单体的化学结构及其含量对牙科树脂基体综合性能的影响,主要包括力学性能、抗菌性能流变性能、透过率、双键转化率以及细胞活性等。具体研究内容主要包括以下几个方面:首先,选用顺丁烯二酸酐与桦木醇作为起始反应物,通过酯化反应在桦木醇的C-3和C-28号位上引入顺丁烯二酸酯基团,制备了双取代的顺丁烯二酸酯化桦木醇基单体(MABet),通过核磁共振氢谱、碳谱、红外光谱及高分辨率质谱表征单体结构。以等比例的Bis-GMA/TEGDMA树脂基体作为对照组,将MABet按10、30和50 wt%的添加量部分或完全替代对照组体系中的Bis-GMA,探究MABet添加量对牙科树脂基体综合性能的影响。结果表明,当MABet添加量为10 wt%,对应树脂基体的力学性能和细胞活性最佳,且流变性能、透过率、双键转化率与对照组之间无显著性差异,同时该树脂基体对变形链球菌的抑菌率为95.39%。其次,以MABet结构中的羧基作为活性位点,选用具有不同分子量和链长的聚乙二醇单甲醚与MABet进行酯化反应,制备了顺丁烯二酸酯聚乙二醇酯化桦木醇基单体(P_7MABet、P_(12)MABet和P_(16)MABet),分别通过核磁共振氢谱、碳谱、傅里叶红外光谱及高分辨率质谱确认单体的结构。结果表明,聚乙二醇C-O-C柔性链结构的引入提高了单体的流动性,使单体变为液体状,其粘度明显低于常用牙科树脂单体Bis-GMA。添加10 wt%P_7MABet和P_(12)MABet单体的树脂基体力学性能有所提升。本研究为天然抗菌单体的结构改性及其在牙科树脂基体中的应用提供了思路和研究基础。

目的 采用微透析技术，比较丁桂散经脐部、脐部旁开与口服给药后，活性成分在皮肤组织中的局部药物代谢动力学(简称“药动学”)行为。方法 SPF级雄性SD大鼠分为4组，即正常大鼠脐部给药组(N-CV8)、溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠脐部给药组(UC-CV8)、UC模型大鼠神阙穴旁开给药组(UC-PA)、UC模型大鼠口服给药组(UC-oral),每组4只。造模后第4天，分别在正常大鼠及模型大鼠的神阙与神阙旁开2 mm部位外敷(0.1 g/只)及灌胃丁桂散(0.1 g/只)。将微透析探针埋入各外敷组给药部位皮下组织、口服组神阙穴皮下组织。以20%乙醇生理盐水溶液作为灌流液，流速为0.2 mL/h进行灌流。给药15 min后，开始收集透析液，每30 min收集1次，共收集20次，持续600 min。透析液直接进高效液相色谱仪，检测其中主要有效成分丁香酚与桂皮醛的代谢物肉桂酸的含量。所得数据以DAS 2.1药动学分析软件进行非房室模型拟合，分析比较各组药动学参数。结果 丁香酚与肉桂酸的微透析体外正向回收率分别为41.4%±2.6%和51.6%±2.1%,反向回收率分别为45.9%±1.5%和50.6%±0.6%;丁香酚与肉PCI-32765配制桂酸的体内平均回收率分别为40.4%和42.8%。各时间点下，各经皮给药组大鼠皮下组织中的丁香酚质量浓度均高于UC-获悉更多oral(小于0.15 mg/L),且UC-CV8最高。UC-CV8丁香酚局部血药浓度-时间曲线下面积(AUC_(0-t))与峰浓度(C_(max))均较N-CV8、UC-PA及UC-oral增加(P<0.05)。大多数时间点下，UC-oral大鼠皮肤组织中肉桂酸质量浓度较低(小于0.15 mg/L)。在4个组中，UC-oral大鼠皮肤组织中肉桂酸C_(max)及AUC_(0-t)最低，UC-CV8最高，2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 脐部给药提高了药物在局部皮肤组织中的吸收分布。皮肤微透析技术适genetic obesity合中药复方经皮给药评价。

研究目的:Notch信号通路由4种受体、5种配体和下游靶基因组成,具有调控细胞增殖、分化和凋亡的功能。Notch1-4受体Genetic therapy为跨膜蛋白,结构高度相似,但功能不同,有关运动对Notch1-4受体的影响还未见文献报道,故本研究通过有氧运动和抗阻运动对大鼠肾脏和骨骼肌中Notch1-4受体表达的影响,分析不同运动模式下Notch1-4受体的可能生物学机制,为运动模式下Notch信号通路的各途径研究,筛选出具有蛋白表达信号的受体。研究方法:本研究得到了成都体育学院伦此网站理委员会批准,批准号为[2022]58号。(1)将24只雄性SD大鼠随机分为对照组(C组,n=8)、有氧训练组(AE组,n=8)和抗阻训练组(RE组,n=8)。(2)有氧运动干预方案:3天跑台适应性训练后,进入正式运动干预。第1天跑台坡度0°,速度16m/min、时间5min;第2天与第3天,坡度与速度不变,时间分别为10min、15min;3天后,大鼠以20m/min、60min/d、5d/w的强度进行训练,共计8周。抗阻运动干预方案:适应性无负重爬梯训练3天后,在尾部负重递增负荷训练3天。之后进入正式抗阻训练,尾部分别负重50%、75%、90%、100%,每一个负重级别爬行3次,100%最大负重时,如不能完成3次者以实际运动能力为限,5d/w,共计8周。(3)8周运动干预后,分别取大鼠左肾和左股四头肌,分成2份。一份置于4%的多聚甲醛固定液中,4°冰箱保存,用于HE染色的组织学观察、免疫组化检测的定位和相对定量研究。另一份装入冷冻管中,液氮急冻后-80°冰箱保存,用于免疫印迹法的半定量研究。使用SPSS26.0软件进行统计学检验,首先进行正态分布和方差齐性检验,如符合正态分布和方差齐性,进行单因素方差分析,如不符合,则使用秩和检验。研究结果:(1)HE染色的组织形态学观察。(1)肾脏:C组未见结缔组织增生及炎性渗出;皮质区肾小球未见毛细血管基底膜增生,无变性、坏死及纤维化;肾小管结构较为完整,间质未见明显炎性浸润及纤维增生;近曲小管与远曲小管界限清晰。AE组肾脏组织未见结缔组织增生及炎性渗出;皮质与髓质分界较为清晰,其中2例皮质区肾小球轻微肿大,肾小囊腔明显变小;肾小管结构较为完整,少量肾小管上皮细胞胞质空泡化,1例少量肾小管变性坏死,见上皮细胞胞质空泡化,胞核固缩,少量上皮细胞脱落;间质未见明显炎性浸润及纤维增生;髓质集合管结构完整清晰,其他未见明显病理改变。RE组肾脏组织未见结缔组织增生及炎性渗出;皮质与髓质分界较为清晰,系膜细胞与毛细血管内皮细胞轻中度肿胀,肾小囊腔隙变窄;间质未见明显炎性浸润及纤维增生;髓质集合管结构完整清晰,其中1例皮质区肾小球轻微肿大,少量肾小管变性坏死;间质未见明显炎性浸润及纤维增生;髓质集合管结构完整清晰。(2)骨骼肌:C组肌纤维呈长圆柱状,排列整齐,肌束结构清晰,边界分明,肌纤维形态正常,细胞核呈扁圆形或椭圆形,偶见部分肌纤维胞质染色不均,无波浪样、空泡或脂肪变性,未见明显坏死;间质未见明显炎细胞浸润和增生。AE组肌纤维呈长圆柱状,排列整齐,肌束结构清晰,边界分明,肌纤维形态正常,其中4例局部区域部分肌纤维轻微至轻度波浪样变,未见明显坏死;间质未见明显炎细胞浸润和增生。RE组肌纤维呈长圆柱状,排列整齐,肌束结构清晰,边界分明,肌纤维RSL3体外形态正常,其中1例局部区域少量肌纤维轻微波浪样变,未见明显坏死;间质未见明显炎细胞浸润和增生。(2)免疫组化检测研究。(1)肾脏:Notch1-4的阳性产物分布在肾小管的上皮细胞和足细胞、近端小管和远端小管的上皮细胞中,为胞质表达;Notch1蛋白水平AE组、RE组较C组呈显著性升高(P<0.05),Notch2蛋白水平AE组、RE组较C组呈极显著性升高(P<0.01),Notch3和Notch4蛋白水平未出现显著性变化。(2)骨骼肌:Notch1-4的阳性产物分布在肌纤维的胞浆中,也为胞质表达。Notch1蛋白水平AE组、RE组较C组呈极显著性升高(P<0.01),Notch2蛋白水平AE组较C组呈极显著性升高(P<0.01);Notch3和Notch4蛋白水平未出现显著性变化;(3)肾脏与骨骼肌组织比较,各指标均未出现显著性差异变化。(3)免疫印迹法研究。(1)肾脏:Notch1蛋白水平AE组较C组呈显著性升高(P<0.05)、AE组较RE组呈极显著性升高(P<0.01);Notch2蛋白水平AE组、RE组较C组呈显著性升高(P<0.05),Notch3和Notch4蛋白水平未出现显著性变化。(2)骨骼肌:Notch1蛋白水平AE组、RE组较C组呈显著性升高(P<0.05),Notch2蛋白水平AE组、RE组较C组呈极显著性升高(P<0.01),Notch3和Notch4蛋白水平未出现显著性变化。(3)肾脏与骨骼肌组织比较,各指标均未出现显著性差异变化。研究结论:(1)有氧运动和抗阻运动使肾脏和骨骼肌组织有轻度病理改变,提示为组织重塑与功能提升打下基础;(2)Notch四种受体的细胞内结构域尽管高度相似,但在不同运动模式及不同部位的信号强度均未出现同步变化,即信号强度的不一致是Notch四种受体在不同组织产生功能差异的原因之一。(3)运动干预后,Notch1和Notch2受体在肾脏和骨骼肌中表达增加,其可能性机制是参与了血管内皮细胞和骨骼肌卫星细胞的分化与增生,故在有氧和抗阻运动模式下,可筛选出Notch1和Notch2受体作为Notch信号通路中与配体结合的研究对象。

背景：目前研究证实，灵孢多糖可ZD1839说明书促进神经退行性相关疾病的神经再生。神经退行性疾病的发生与线粒体功能失调密切相关，但灵孢多糖对神经退行性疾病的细胞凋亡及线粒体功能的调控作用尚不明确。目的：探索灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控作用及机制。方法：SH-SY5Y细胞分为3组：对照组，过氧化氢组，灵孢多糖组。对照组细胞正常培养，过氧化氢组细胞用300μmol/L过氧化氢处理24 h，灵孢多糖组先用300μg/μL灵孢多糖干预一两个小时，然后加入300μmol/L过氧化氢干预24 h，干预结束后用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位，TUNEL染色试剂盒检测细胞凋亡情况，丙二醛试剂盒和超氧化物歧化酶试剂盒检测丙二醛和超氧化物歧化酶活性，免疫荧光染色法和Western blot法检测凋亡、线粒体动力学相关蛋白的表达。结果与结论：(1)与对照组相比，过氧化氢组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著降低，细胞凋亡率、丙二醇水平显著增高，差异均有显著性意义(P <0.05)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著增高，细胞凋亡率、丙二醛水平显著下降，差异均有显著性意义(P <0.05)；(2)与对照组相比，过氧化氢组促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达显著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降，差异均有显著性意义(P <0.05)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达显著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著增加，差异均有显著性意义(P <0systemic autoimmune diseases.05selleck)；(3)与对照组相比，过氧化氢组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达均显著增高，线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达均显著降低，差异均有显著性意义(P <0.05)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达显著降低，线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达显著增高，差异均有显著性意义(P <0.05)；(4)以上结果证实，灵孢多糖可通过改善线粒体功能障碍以减轻过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。

目的:岩藻多糖是一种提取自海洋褐藻的硫酸化多糖,具有多种生物活性,本研究拟通过观察岩藻多糖在支气管上皮细胞炎症反应中的作用,探究其涉及的相关分子通路,以期明确岩藻多糖在呼吸道炎症性疾病中的综合效应。方法:实验分组及药物干预:实验分为5组:对照组(无LPS刺激),LPS组(10μg/m L),LPS+岩藻多糖低浓度组(50μg/m L),LPS+岩藻多糖中浓度组(100μg/m L),LPS+岩藻多糖高浓度组(200μg/m L)。先用10μg/m L的LPS刺激细胞16小时建立细胞炎症模型,再依据药物分组选择不同浓度岩藻多糖干预8小时。采用CCK8法观察岩藻多糖对LPS诱导的细胞损伤模型的影响,使用活性氧检测试剂盒检测岩藻多糖和LPS对细胞活性氧产生的影响,ELISA实验检测各组细胞上清液中炎症因子(IL6、IL-1β、TNF-Torin 1 IC50α)的分泌水平,实时荧光定量PCR检测各组细胞炎症因子、TLR4及My D88的转录水平,Western blot检测各组细胞中TLR4、My D88蛋白表达差异,细胞免疫荧光实验观察各组细胞中TLR4的荧光强度差异。使用Graphpad prism 9.0进行作图、分析,应用SPSS25.0统计学软件包进行单因素方差分析,蛋白灰度值分析采用Image J软件。计量资料采用(?)±s。P<0.0点击此处5表示差异有统计学意义。结果:1.细胞在被10μg/m L LPS刺激16小时后活力下降,ROS表达增高,而实验范围浓度内的岩藻多糖不会影响支气管immune suppression上皮细胞活力,给予岩藻多糖干预被LPS刺激的细胞8小时后,细胞活力较对照组明显升高,而ROS表达下降;2.在ELISA和q PCR实验中,LPS组细胞炎症因子(IL6、IL-1β、TNF-α)的转录水平与对照组相比显著升高,经过给予岩藻多糖处理后转录水平下降,且呈浓度依赖性;3.Western blot实验发现,LPS组细胞中TLR4和My D88蛋白表达较对照组显著增多,给予岩藻多糖干预后,细胞TLR4及My D88的表达量均低于LPS组,差异有统计学意义;4.细胞免疫荧光实验中,LPS组细胞TLR4荧光表达增强,显著高于对照组;当给予岩藻多糖干预后细胞TLR4荧光强度明显低于LPS组细胞,差异具有统计学意义。结论:1.当LPS以10μg/m L的实验浓度刺激16HBE细胞16小时可建立细胞炎症和氧化应激模型;2.岩藻多糖可以通过降低LPS刺激细胞产生的高ROS水平来改善细胞损伤情况,可能具备抗氧化应激作用;岩藻多糖可能通过抑制TLR4/My D88通路减轻LPS诱导产生的炎症因子表达水平,降低炎症反应对细胞的损害;3.岩藻多糖具有抗炎、抗氧化作用,也许具有开发成为遏制呼吸道炎症的海洋来源药物的潜力。

目的 探索纳米银薇乔线用于小鼠背部皮内连续缝合线道周selleck AG-221围炎性细胞和炎性蛋白的表达情况,分析其近期抗炎疗效。方法 对4-0普通薇乔线采用化学涂层技术制备纳米银薇乔线。18只10～12周Balb/C小鼠随机分为3组(每组各6只),剃除小鼠背部毛发,纵行切开15 mm皮肤全层切口。分别采用4-0带针普通薇乔线、抗生素薇乔线、纳米银薇乔线行皮内连续缝合。术后5 d,以纵形切口为中心,取材全层皮肤组织。采用免疫组织化学染色方法比较线道周围中性粒细胞、巨噬细胞、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平,并计算平均光密度(mean optical density,MOD)。原位末端转移酶标记(mediated dUTP-biotin nick end labelinAquatic microbiologyg,TUNEL)染色了解线道周围细胞凋亡情况。Masson染色了解线道周围胶原蛋白沉积情况。统计学方法采用单因素方差分析和student’s t检验。结果 免疫组织化学染色显示,普通薇乔线、抗生素薇乔线和纳米银薇乔线的中性粒细胞MOD值为0.523±0.137、0.412±0.122、0.229±0.079;巨噬细胞MOD值为1.125±0.126、0.585±0.142、0.209±0.078;IL-6的MOD值为1.137±0.168、0.652±0.131、0.227±0.086;TNF-α的MOD值为1.219±0.124、0.573±0.109、0.179±0.045,纳米银薇乔DNA Damage/DNA Repair抑制剂线线道周围炎性细胞浸润、IL-6和TNF-α的表达最轻微,普通薇乔线表达最明显,3组间比较差异均有统计学意义(P值均<0.001)。TUNEL染色显示,普通薇乔线、抗生素薇乔线和纳米银薇乔线凋亡细胞的MOD值为0.167±0.035、0.478±0.151、0.125±0.035,纳米银薇乔线线道周围凋亡细胞最少,抗生素薇乔线凋亡细胞最多,3组间比较差异均有统计学意义(P值均<0.001)。Masson染色显示,纳米银薇乔线线道周围胶原蛋白沉积显著,抗生素薇乔线线道周围未见胶原蛋白沉积。结论 在小鼠皮内连续缝合模型上,纳米银薇乔线的近期抗炎疗效优于抗生素薇乔线和普通薇乔线,纳米银薇乔线线道周围细胞毒性弱,但其临床应用价值仍需进一步评估。

多聚磷酸盐激酶(Polyphosphate kinases,PPK)因其底物聚磷酸廉价易得,已参与到许多生物催化反应中,为ATP消耗反应提供能量。在本研究中,为得到更高酶活的PPK酶,对PPK酶进行胞外胞内高通量筛选,结合理性设计突变改造PPK酶。基于该突变酶,构建了ATP再生系统,偶联谷胱甘肽双功能酶Gsh AB生产谷胱甘肽,增强ATP再生能力来提高谷胱甘肽产量,降低催化成本,并对生产体系进行优化,实现高效生产谷胱甘肽。主要结果如下:(1)根据PPK的分类及进化树分析,在大肠杆菌中克隆表达了七种不同来源的多聚磷酸盐激酶,研究底物poly P磷酸盐链的长度和浓度对PPKs的酶活影响。结果表明七种PPK酶对底物六偏磷酸钠poly P_6的催化能力最好,磷酸盐浓度越高,对PPK的酶活抑制作用越强;来源哈氏纤维细菌的Ch PPK比酶活最高,为30.26±2.08 U·mg~(-1),是七种PPK酶利用底物poly P_6再生ATP的最佳生物催化剂。(2)易错PCR构建Ch PPK突变体文库,结合胞外胞内高通量筛选法以及定点突变,最终筛选到双突变体Ch PPK_(D82N-K103E)的相对酶活提高到430.2%,展现最高的催化能力。分子对接发现,关键位点D82和K103残基分别位于底物poly P_6通道和ADP通道的入口,并与底物的磷酸基团形成离子相互作用,突变后,N82和E103仍扩大了底物通道腔来提高Ch PPK的催化活性。通过RMSD和RMSF的分析发现,D82N和K103E的突变提高了分子结Medical service构灵活性,促进了底物(poly P_6和ADP)与活性口袋之间的相互作用。(3)在突变酶Ch PPK_(D82N-K103E)与Gsh AB偶联的EB13全细胞催化体系中,添加5m M ATP,40 h内可将50 m M底物转化产生14.2±1.2 m M的谷胱甘肽,可以达到EB11(表达Gsh AB酶)全细胞催化C59体系(给予100 m M ATP)的91.6%的效果,比未突变的Ch PPK与Gsh AB偶联的催化产量提高了59.6%。对催化体系的缓冲液、菌体量、补料时间和底物浓度优化后,40 h时EB13菌株可以将50 m M底物转化生成34Staurosporine临床试验.1±2.6 m M的谷胱甘肽,底物半胱氨酸转化率为68.2%;而当底物浓度为100 m M时,40 h时谷胱甘肽产量最高,为51.5±1.3 m M,底物半胱氨酸转化率为51.5%。(4)为进一步提高谷胱甘肽生产过程中的转化率,将菌株EB11、EB12、EB13破碎细胞后以无细胞裂解液的形式催化谷胱甘肽的生产。Ch PPK_(D82N-K103E)与Gsh AB偶联,添加5 m M ATP,即可获得高效的ATP再生效率,8 h内可将50 m M底物转化产生27.1±1.9 m M的谷胱甘肽,比未突变的Ch PPK与Gsh AB偶联的催化产量提高了51.4%。对催化体系的缓冲液、菌体量、补料时间和底物浓度优化后,8 h时EB13菌株可以将50 m M底物转化生成46.2±1.4 m M(14.2±0.4 g·L~(-1))的谷胱甘肽,底物半胱氨酸转化率最高,为92.4%;当底物浓度为100 m M时,8 h时谷胱甘肽产量最高,为67.5±1.7 m M(20.7±0.5 g·L~(-1)),底物半胱氨酸转化率为67.5%。