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木姜叶柯[Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun]为壳斗科柯属常绿乔木,主要分布在中国长江以南的山区,印度、泰国也有所分布,其嫩叶可被直接煎煮做成茶汤,长期服用有养生保健功效。木姜叶柯中主要成分为类黄酮和三萜类,根皮苷和三叶苷属于二氢查尔酮类化合物,是木姜叶柯中的主要的活性成分,具有降血糖、降血脂、抗炎和抗肿瘤的生物活性。除此以外,三叶苷还是一种健康的天然甜味剂,其甜度是蔗糖的300倍。但是天然生长的木姜叶柯植株分散,且树形高大,采摘叶片困难,费时费力,不利于有效成分的提取。随着合成生物学技术的发展,基于根皮苷和三叶苷生物合成途径中高效关键酶基因的发现,构建细胞工厂实现相关化合物的异源生产成为一种新的可持续的生产方式。目前,苹果中根皮苷和三叶苷生物合成途径已基本被阐明,多个可以催化根皮素糖苷化的糖基转移酶已经被鉴定,但多存在催化活性低、专一性弱的问题。所以进一步从植物中鉴定催化活性更高、专一性更强的糖基转移酶,是提高根皮苷和三叶苷生物合成产量的重要前提。木姜叶柯中根皮苷和三叶苷的含量丰富,然而目前该植物中尚未有参与根皮苷和三叶苷生物合成途径基因的报道。基于此,本课题对木姜叶柯进行了高通量全长转录组的测序。深入开展了木姜叶柯中根皮苷和三叶苷生物合成途径中关键酶基因的克隆和功能研究,以期发现能够高效催化根皮苷和三叶苷形成的关键酶。主要研究内容如下:1.木姜叶柯不同组织部位根皮苷和三叶苷的含量测定使用UPLC-Q-TOF-MS对木姜叶柯嫩叶、老叶、嫩茎、老茎、根及根茎混合物当中的根皮苷和三叶苷含量进行定量。实验结果表明,根皮苷在木姜叶柯不同组织部位的含量由高到低分别为老叶、嫩茎、根茎混合物、老茎、嫩叶和根,而三叶苷仅在叶中积累,且嫩叶中的积累量是老叶的两倍之多。木姜叶柯中根皮苷和三叶苷的积累为根皮苷和三叶苷合成途径基因的筛选提供了稳定可靠的实验材料,其积累规律为制定转录组测序策略提供了参考。2.木姜叶柯不同组织部位的转录组测序及基因注释结果基于化合物含量检测的结果,采用高通量测序技术对木姜叶柯的根、茎、老叶和嫩叶进行了转录组测序,原始数据经过组装、拼接、去冗余后,共得到34,215个PF-02341066 molecular weightUnigene。比对到NR、Swiss Prot、KEGG、KOG、GO、NT、Pfam等数据库中共注释得到33,669个基因。根据注释信息,从转录组中共筛选到3条PAL基因、15条4CL基因、35条DBR基因、2条CHS基因以及135条UGT基因参与根皮苷和三叶苷生物合成的关键酶基因,为后续基因的全长克隆提供了基础。3.双键还原酶的克隆及生物信息学分析从转录组中筛选到12条候选双键还原酶基因,分别命名为Ll DBR1～Ll DBR12。设计特异性扩增引物,通过PCR技术克隆到12条全长序列。构建p ET28a-HIS-MBP原核表达载体,进行测序分析后获得14条DBR基因序列,其中Ll DBR9测序获得了4条基因序列,Ll DBR11测序获得了2条基因序列。对14条序列进行了生物信息学分析,Ll DBR1～Ll DBR12Hepatic angiosarcoma的ORF区长度在1000～1070 bp之间,编码氨基酸数量在340～360之间。亚细胞定位显示,14个蛋白主要定位在细胞质。多序列比对分析结果表明,14个蛋白均具有保守的GXXS区域和甘氨酸富集区域(AXXGXXG或GXXGXXG)。系统发育树表明,14个蛋白均与已报道功能的蛋白聚在一起,且序列一致性较高。为后期基因的功能鉴定提供了理论依据。4.糖基转移酶的克隆、功能验证和生化特性分析从转录组中筛选到24条候选糖基转移酶基因,分别命名为Ll UGT1～Ll UGT24。设计特异性引物,利用PCR技术克隆得到了20条全长序列。构建p ET28a-HIS-MBP原核表达载体,最终得到21条候选UGT基因,其中Ll UGT9测序获得了3条基因序列。异源表达及体外酶促反应表明,Ll UGT4、Ll UGT7、Ll UGT8、Ll UGT9-1、Ll UGT9-2、Ll UGT9-3、Ll UGT15均能催化根皮素生成糖苷化产物。对这7个蛋白进行了相应的生物信息学分析,选择可以在体外高效催化根皮素生成根皮苷和三叶苷的Ll UGT8和Ll UGT9-3进行酶促反应动力学分析(载体更换为p ET28a)。结果表明,Ll UGT8最佳反应时间为8 h,最适温度在50℃,最佳p H值为8.8的Na_2CO_3-Na HCO_3缓冲体系。Ll UGT9-3最佳反应时间为8 h,PUN30119作用最适温度为40℃,最佳p H值为8.8的Na_2CO_3-Na HCO_3缓冲体系。Ll UGT8的k_m值47.54μM,k_(cat)为0.02 s~(-1),k_(cat)·k_m~(-1)为365.97 mol~(-1)·s~(-1)。Ll UGT9-3的k_m值79.92μM,k_(cat)为0.04 s~(-1),k_(cat)·k_m~(-1)为441.06 mol~(-1)·s~(-1)。底物谱筛选结果表明,Ll UGT8以UDP-Glc为糖基供体,可以催化6种不同结构类型的黄酮类化合物发生糖基化反应,而Ll UGT9-3以UDP-Glc为糖基供体,可以催化15种不同结构类型的黄酮类化合物发生糖基化反应,这表明Ll UGT9-3比Ll UGT8具有更高的底物杂泛性。糖基转移酶生化特性的全面解析为酶的改造提供了理论基础,也为后续在木姜叶柯植物体内的功能研究奠定了基础。本研究基于木姜叶柯转录组数据分析,克隆了可能参与根皮苷和三叶苷生物合成途径的12条DBR基因和24条UGT基因。体外酶促反应发现了7条可以催化根皮素糖基化的糖基转移酶,其中2条可以在体外高效催化根皮素生成根皮苷和三叶苷。同时也对这两个糖基转移酶进行了深入的生化特性研究。本研究为实现根皮苷和三叶苷的合成生物学生产奠定了基础。

3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯简称3-氯丙醇酯(3-MCPD酯)是3-MCPD与脂肪酸结合而形成的产物。3-MCPD酯是油脂加工的过程中产生的食品危害物,其危害性目前已被证明。然而,由于目前尚没有合适的方法来减少油脂加工过程中3-MCPD酯的产生,进而减少膳食中3-MCPD酯的摄入,因此营养干预是目前缓解或抑制3-MCPD酯对机体危害的最佳选择之一。本课题基于SD大鼠并结合脂质组学及蛋白质组学技术,探究了抗坏血酸对3-MCPD酯致肾脏损伤的保护作用,具体实验结果如下:(1)以SD大鼠为研究对象建立为期28天的体内实验,分别设立对照组,抗坏血酸组,毒性组以及治疗组,研究不同剂量的抗坏血酸对3-MCPD酯致肾脏毒性的干预效果。研究发现抗坏血酸可以干预由3-MCPD酯摄入引起的肾脏脏器指数升高,可以抑制有3-MCPD酯摄入引起的血清肌酐及尿素氮含量的升高。组织病理学结果显示抗坏血酸可改善由3-MCPD酯诱导的肾小球结构损伤,肾selleckchem Cobimetinib脏炎症等症状。对大鼠肾脏的氧化应激指标进行检测时发现,与毒性组相比抗坏血酸摄入后大鼠肾脏的MDA、GSH水平降低,T-AOC水平升高,且均呈剂量依赖性改变。以上结果表明,抗坏血酸的摄入能改善大鼠肾脏的氧化/抗氧化平衡,降低肾脏的炎症,恢复肾脏功能。(2)基于UPLC-Q-Exactive技术对大鼠肾脏样本进行非靶标脂质组学分析。结果显示,3-MCPD酯摄入后共有183个脂质发生了显著改变,而在抗坏血酸的干预下46个脂质发生了显著改变。进一步分析显示3-MCPD酯的摄入主要干扰了肾脏的甘油磷脂代谢和鞘脂;抗坏血酸主要通过干预大鼠肾脏的甘油磷脂代谢来缓解3-MCPD酯摄入引起的肾脏损伤。经ROC分析筛选后38种脂质被定义为3-MCPD酯诱导肾脏损伤的脂质生物标志物,包括16种TG、14种PC、2种LPC、2种Me PC、1种GM3、1种CER、1种MGDG和1种Zy E;MGDG(20:3＿22:4)、SM(d18:1＿23:1)及TG(16:0＿22:6＿24:0)被确定为抗坏血酸干Immune mechanism预3-MCPD酯诱导肾脏损伤的关键脂质。(3)基于UPLC-Q-Exactive技术并结合TMT定量蛋白质组学技术对大鼠肾脏样本进行分析。结果显示,共有807个蛋白质的表达在3-MCPD酯的摄入后发生了显著变化,在抗坏血酸的干预下共有41个蛋白质的表达发生了显著变化。GO功能富集分析的结果显示,3-MCPD酯的摄入主要影响了肾脏的生物过程是氧化还原过程,分子功能是氧化还原酶活性,主要影响了线粒体的分子构成,抗坏血酸的摄入主要干预了肾脏细胞的生物SB431542溶解度过程是胆固醇运输,分子功能是赖氨酸转运,主要干预了高密度脂蛋白颗粒的分子构成。KEGG通路富集分析的结果显示缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解,药物代谢-P450,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢,细胞色素P450对外源性物质的代谢作用及氧化磷酸化等生物过程随着3-MCPD酯的摄入而发生了改变;胆固醇代谢等通路在抗坏血酸的干预下发生了改变。蛋白质互作分析结果显示Ndufa13、Ndufb10、Ndufa9、Ndufa15、Uqcrb、Cat、Acox3、Dao、Ehhadh及Cox5a等蛋白质的连接度较高,可能在3-MCPD酯诱导肾脏损伤的关键蛋白质;而Apoa1、Bccip、Commd9、Snrpd1、Snrpd3、Snrpb2、Snrpc及Prpf19等可能是抗坏血酸干预的关键蛋白质。(4)开发了一种利用干酪乳杆菌发酵维生素C的诺丽果饮料。采用干酪乳杆菌发酵诺丽果,并对饮料的相关指标进行检测。结果显示,发酵能明显改善诺丽果饮料的口感,对诺丽果饮料的组织状态、口感、气味及总体可接受度上均有明显提升,但是对色泽得分无明显改变。发酵会降低饮料的p H值及可溶性固形物含量,且与发酵时间成正比关系。对色泽指标进行检测后发现,发酵对诺丽果饮料的色度值无显著影响,但是会显著降低其色调值。此外,饮料中的维生素C含量不随干酪乳杆菌的发酵而改变,该工艺制备的发酵诺丽果饮料中维生素C的含量约为12.5 mg/100g。

恶性肿瘤是一个国际性的健康挑战,它对人类健康造成了重大威胁。化疗是一种有效的治疗癌症的方法,但化学药物会对正常细胞产生一定毒性。因此,开发一种更加安全、更加高效的肿瘤诊断治疗纳米平台,将为癌症患者带来福音。其中,光学治疗具备损伤小、危害性低和副反应少等优点,其治疗原理是在特定的光照下,产生单线态氧(~1O_2)或产生高温,杀死肿瘤细胞。同时,在二维纳米材料家族中,黑磷(Black phosphorus,BP)具有出色的生物降解性和生物安全性,可以有效地减少对生物体的危害,从而为患者提供更加安全、更加有效的治疗方法。遗憾的是,目前关于BP在肿瘤微环境荧光成像的研究仍然相对较少,荧光成像能够对细胞加以标记,记www.selleck.cn/products/CP-690550录细胞的变化。基于此,本文在溶剂热法制备蓝色荧光黑磷纳米片(BPNs)的基础上,通过不同含量氮元素掺杂黑磷纳米片制备出多色荧光黑磷纳米片(N/BPNs),然后利用光动力-光Cell Biology热疗法原理协同660 nm激光诱导抑制肿瘤生长。首先,借助透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)表征所制备材料的横向尺寸大小、厚度以及形貌。荧光分光光度计(FL)分析多色荧光黑磷纳米片的图谱与365 nm紫外灯和405 nm激光器照射下的荧光现象相符合,紫外吸收光谱在218 nm处的吸收峰证明掺杂后对黑磷自身未造成不利影响。傅里叶变换红外(FLBH589T-IR)谱图与X射线光电子能谱(XPS)均证明不同含量氮掺杂造成黑磷表面不同程度氧化是其荧光出现红移的重要原因。同时,BPNs和N/BPNs在不同p H值环境下的荧光稳定性,1,3-二苯基异苯并吠喃(DPBF)降解实验和电子自旋共振(ESR)结果表明制备的多色黑磷纳米片不仅稳定性好,在可见光下还可以生成~1O_2且生成速率随波长梯度递增,具有优异的光动力特性。接下来,探究材料的生物安全性,细胞成像示踪效果,以及在无激光照射下和有激光照射下不同材料处理后肿瘤的治疗效果。首先从细胞毒性层面和小鼠尾静脉注射后生理指标正常,证实了材料的生物安全性。然后用相同浓度的BPNs和N/BPNs分别处理肝癌细胞,细胞中分别出现明显的蓝色荧光,绿色荧光,黄色荧光,橙色荧光以及红色荧光,达到了示踪标记细胞的效果。最后,构建小鼠肿瘤模型,经过14天的治疗周期后,材料组小鼠均表现出一定抑制肿瘤的效果。加入激光后,材料组均表现出更明显的抑制效果,其中R-N/BPNs的治疗效果最好。综上所述,所制备的BPNs和N/BPNs不仅具有优异的光学性能,在肿瘤的治疗过程中也表现出极大的应用潜力。

新烟碱类杀虫剂(Neonicotinoid insecticides,简称NNIs)是一类作用于昆虫乙酰胆碱受体(nAChR)的广谱性杀虫剂,因其高效、低毒等优势目前已成为全球杀虫剂市场的重要组成部分。NNIs在农田生态系统中主要被应用于叶面喷雾、作物种植时的土壤和种子处理,其对多种重要的经济作物害虫,如蚜虫、粉虱、叶蝉等均具有高致死效应。然而,NNIs在农作物种植期间被盲目加大用药量以期提高防治效果,该举措同时加剧了靶标生物抗药性与非靶标生物毒性问题,如诱导鱼类的神经毒性、蜜蜂的免疫损伤等。此外,NNIs因分子量小、水溶性高等特点极易在水体和土壤等环境介质中富集,且约有2%～20%的有效成分被植物吸收后遍布根、茎、叶、花、果实等各部位,最终以“水—土壤一植物”系统污染食物链进入人体组织并对人体健康构成威胁。已有流行病学Q-VD-Oph浓度研究指出,NNIs与人体的致癌作用、发育障碍、致畸作用等均具有一定的相关性。尽管人们已经意识到了 NNIs的生态环境问题,并据此开展了风险评估及新型替代品研发等工作,但NNIs对靶标生物的抗药性与非靶标生物的毒性问题尚未得到根本性解决,且评估结果显示最新登记使用的NNIs也不具备最优的毒理学特征。因此,构建NNIs暴露下靶标生物抗药性、非靶标生物毒性以及人体健康风险的全方位立体型评估与管控体系,开展符合药物研究开发标准的新型绿色农药替代品是农药管理和研发过程中需要考虑的重要课题。本论文借助估计程序接口(Estimation Programs Interface,简称EPI)、生态结构活动关系(Ecological Structure Activity Relationships,简称 ECOSAR)、农药属性(Pesticides Properties DataBase,简称PPDB)数据库,利用分子对接法、分子动力学法、毒代动力学法、急性与慢性参考剂量评估法、毒性单位法、危害指数法构建了 NNIs暴露下的生态环境风险评估与管控体系,提出了针对不同地区、不同作物的NNIs管控与施用建议。此外,采用毒性回归方程、模糊综合评价法、综合集成赋权法修正了 NNIs集成风险的三维定量构效关系(3D quantitative structure-activity relationship,简称3D-QSAR)模型,设计了双向生物毒性选择性与人体健康风险友好性的NNIs替代物分子。最后,通过Gaussian 09、PaDEL-Descriptor、Chembiodraw等软件,借助密度泛函与含时密度泛函理论,利用归一化法、皮尔逊相关系数法、随机森林(Randomforest,RF)与决策树(Decision tree,DT)辅助的机器学习方法开展了 NNIs替代物分子可合成性预测研究,填补了 NNIs替代物分子可合成性预测领域的空白。NNIs暴露下生态环境风险评估与阻控方面,以农田靶标与非靶标生物、全国性生活饮用水水源为例,分别构建了农田生态系统NNIs暴露下靶标生物抗药性与交互抗性、非靶标生物毒性与联合毒性双向选择性风险识别与管控体系、全国性生活饮用水中NNIs及其转化产物暴露下联合毒性及经口摄入毒性暴露风险评价体系;制定了可有效抑制交互抗性与联合毒性的增效剂阻控方案,理想方案下的调控效果分别高达50%和200%以上;确定了粮食作物和蔬菜作物中NNIs施用优先控制名单;提出了可减弱NNIs及其转化产物在饮用水中潜在生态环境风险的管控与selleck化学施用建议。NNIs绿色替代品设计与筛选方面,以种植区域农田生态系统、种植区域medical marijuana附近敏感人群为例,源头预防角度,基于动物、植物、微生物选择性总指标及致癌性、致突变性、皮肤致敏性、皮肤刺激性集成评价指标,分别构建了双向生物毒性选择性与人体健康风险友好性3D-QSAR模型,设计了1种靶标生物毒性提升(提升程度约为13.69%)与非靶标生物毒性降低(降低程度约为70.20%)、2种多毒性(致癌性、致突变性、皮肤致敏性、皮肤刺激性)单效应及集成效应评价等级均为低风险的NNIs替代物分子;过程控制角度,提出了多情景下具有双向生物毒性选择性的靶标突变体改造方案,配体修饰-受体改造的联合改善效果最高可达30%以上,制定了可降低NNIs残留所导致叶片氧化损伤以及促进不同土壤类型下(偏酸性、中性、偏碱性)微生物降解NNIs的外部环境因素调控方案(降解效率分别提升61.90%、45.50%、26.82%);末端治理角度,基于NNIs及其替代物分子与人类乙酰胆碱受体α4β2亚型的作用机理,提出了可有效缓解NNIs暴露下人体发生致癌与致突变风险的合理饮食建议,该建议下人体健康风险的理想改善效果最高约为300%。NNIs绿色替代品可合成性预测方面,以理论设计NNIs替代品为例,构建了基于bagging-RF/DT算法的NNIs替代物分子可合成性正向与未标注(Positive andunlabeled,PU)机器学习预测与验证模型,筛选出三种标记为“正向”样本的NNIs替代物分子(UN-1、UN-2、UN-3),实现了将“未标记”样本数量缩减95.89%的目标,突破了顺式NNIs在合成开发方面的瓶颈,填补了将机器学习方法应用于预测NNIs替代物分子可合成性领域的空白。本论文旨在创新性的开发靶标生物抗药性、非靶标生物毒性、人体健康风险全方位立体型风险评估与管控体系,切实提出NNIs绿色农药替代品修饰与可合成性预测耦合方案,以期形成“源头预防一过程控制一末端治理”的农业源污染防治成套技术模式,为实现我国农业绿色发展提供新思路。

日本白姑鱼(Argyrosomus japonicus)、赤鯥(Doederleinia berycoides)和横带髭鲷(Hapalogenys analis)均属于鲈形目(Perciformes),三种为我国重要的海洋经济鱼类,具有较高的经济价值和生态价值。近年来,由于过度捕捞、人类活动和环境变化的影响,其资源量急剧衰退,亟需开展人工增养殖研究。为了更好地开展三种海洋鱼类的增养殖研究,探究其种质资源情况以及群体的遗传结构和遗传多样性尤为重要。微卫星分子标记在研究物种种质情况及遗传信息方面有很大优势。本研究对三种鱼类进行了基因组survey测序并开发微卫星位点。主要研究结果如下:1.日本白姑鱼经基因组survey分析共获得84.27 Gb的测序数据量。基因组survey测序结果表明,日本白姑鱼基因组大小约为675 Mb,其杂合率与重复率分别为0.21%和35.47%。对日本白姑鱼基因组survey数据进行微卫星位点检测,得到316,357个完美型微卫星位点。其中二核苷酸重复为最丰富的微卫星类型,占比43.06%;六核苷酸重复最少,占比0.10%。在重复单元中,A/T数量最多,占微卫星总量的38.72%,含GC的重复单元数量很少;6次重复和10次重复的微卫星位点数量最多。2.赤鯥经基因组survey分析共获得85.62 Gb的测序数据量。基因组survey测序结果表明,赤鯥基因组大小约696 Mb,其杂合率与重复率分别为0.37%和31.62%。基于赤鯥基因组survey数据共检测到462,395个完美型微卫星位点。其中二核苷酸重复数量最多,占比58.49%;六核苷酸重复占比最少,仅0.13%。在重复单元中,A/T为优势重复单元,占比24.95%,含GC的重复单元数量很少;6次重复和10次重复的微卫星位点数量最多。3.横带髭鲷经基因组survhepatitis C virus infectioney分析共获得83.02 Gb的测序数据量。基因组survey测序结果表明,横带髭鲷基因组大小约为543 Mb,其杂合率与重复率分别为0.45%和26.78%。在横带髭鲷survey数据中共检测到280,378个完美型微卫星位点。其中二核苷酸重复占比高达56.05%,六核苷酸重复占比仅0.45%。在重复单元中,A/T为优势重复单元,占比22.37%,含GC的重复单元数量很少;6次重复和10次重复的微卫星位点数量最多。4.利用横带髭鲷survey测序结果筛选出的20个多态性微卫星位点对一个供试群体进行群体遗传学检测。结果表明,各位点等位基因数(Na)从5到13不等,均值GPCR & G Protein抑制剂为8.75个;观测杂合度(Ho)均值为0.808,期望杂合度(He)均值为0.863;平均多态信息含量(PIC)为0.826,且均大于0.5。经Bonferroni校正后有5个位点显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.001);有4个位点存在无效等位基因。所开发的微卫星位点可用于今后横带髭鲷遗传育种和群体遗传学的研究。利用8个微卫星位点对3个横带髭鲷群体进行遗传结构研究。结果显示,横带髭鲷3个群体的等位基因丰富度(AR)、Ho、HeAZD2281和PIC较高,表明群体遗传多样性水平较高;遗传分化指数(Fst)显示2022年的养殖群体与2020年的养殖群体有明显的遗传分化,2021年的野生群体与其他两个群体有较小的遗传分化;UPGMA树和3D-FCA得分析结果与Fst值所分析的结果保持一致。

该研究旨在探究十二烷基硫酸钠(sodiuMedia degenerative changesm lauryl sulfate, SLS)胁迫对益生菌外用功效的影响。通过比较自由基清除率和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性筛选具有高抗氧化活性的益生菌，将筛选出的黏膜乳杆菌用1 mmol/L SLS胁迫培养，代谢组学分析差异代谢物判断潜在功效并在细胞内进行进一步功效验证及体外毒理学安全性评估。通过代谢组学分析，鉴定出192种差异代谢物，并发现包括泛酸、甲基补骨脂黄酮等抗氧化应激相关产物在SLS胁迫的黏膜乳杆菌XWL溶胞物(LM+)中含量明显大于未胁迫样品(LPEG300M)(BAY 73-4506P<0.001)。且证实了LM+对HaCaT细胞毒性和对SLS诱导产生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)清除效果优于LM。鸡胚绒毛尿囊膜试验与Ames试验证明两种溶胞物在体积分数40%以下无刺激性和致突变性。综上，黏膜乳杆菌XWL在SLS胁迫下会分泌更多益生物质来应对胁迫环境，从而加强对SLS导致的HaCaT细胞损伤的针对性保护作用，该研究为益生菌的功效提升提供思路。

急性肾损伤(AKI)通常表现为数小时至数天内血清肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)突然升高、尿量减少和肾小球滤过率(GFR)下降,AKI通常伴有多种并发症,如高钾血症、代谢性酸中毒、容量超负荷和GFR降低导致的尿毒症症状。AKI是一种复杂疾病,手术、脓毒症、创伤和对药物的毒性反应都可能诱发AKI。在AKI的发生发展过程中,活性氧(ROS)在肾功能的稳态中起着至关重要的作用。当ROS生成和消除之间的平衡被打破时,肾脏浸润和内源性细胞产生的过量ROS会通过线粒体肿胀和功能障碍诱导细胞凋亡。不幸的是,目前只有温和的治疗方法,如补液、肾透析和其他一些支持性治疗。因此,开发有效的治疗AKI的药物迫在眉睫。鉴于ROS在AKI的发生和发展中的重要作用,消除ROS似乎是预防和治疗AKI的一种有希望的策略。随着纳米技术的出现并迅速发展,具有抗炎抗氧化治疗效果的纳米药物成为包括AKI在内的各种ROS相关疾病的有效治疗药物,预计将对人类健康产生深远影响。其中,纳米酶因其既有天然酶的高催化活性,又有模拟酶稳定而经济的特点,在众多药物中脱颖而出。纳米酶克服了天然酶只能在温和条件下才能发挥催化作用的局限性,并且具有模拟过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等天然酶活性,对ROS表现出广谱的清除能力。硫化氢(H2S)是一种无处不在的气态信号分子,是三种内源性气体递质之一,在许多生理过程中起着重要作用,如神经调控、血管张力调节、细胞保护、氧感应、炎症调节和细胞生长。多硫化氢(H2Sn)已被发现可以由3-巯基丙酮酸硫转移酶(3MST)产生,并能够调节离子通道、肿瘤抑制因子和蛋白激酶的活性。蛋白质的半胱氨酸残基过硫化被认为是H2S作用的一种方式,H2S将硫原子添加到目标蛋白的半胱氨酸残基上,从而发挥作用。由于H2S与半胱氨酸残基中硫的氧化态相同,H2S不易对半胱氨酸残基硫化。相反,氧化态为0或-1的H2Sn很容易硫化半胱氨酸残基的硫醇。肿瘤抑制蛋白磷酸和紧张素同源物(PTEN)、蛋白激酶G1α和糖酵解酶甘油-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等蛋白都是H2Sn的靶蛋白。中药是以中国传统医药理论指导采集、炮制、制剂,说明作用机理,指导临床应用的药物。中药主要来源于天然药及其加工品,包括植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物。除了纳米药物具有清除ROS抗氧化的能力以外,中药多酚也可以与ROS相互作用,从而在细胞活力受到严重影响之前终止链式反应。中药多酚是存在于植物中的天然化合物,具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种生物活性。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)是绿茶的主要多酚成分,是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂,可用于治疗多种疾病。EGCG已被证明具有抗炎、抗关节炎、抗菌、抗血管生成、抗衰老、抗病毒和神经保护作用,这些作用可能在治疗许多疾病中具有治疗应用,包括动脉粥样硬化和心血管和代谢疾病。EGCG可以通过清除自由基来达到抗氧化的目的,与铁螯合是清除自由基的一种重要方式。此外,EGCG在体内外都能增加与氧化应激相关的抗氧化酶的水平,包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)和血红素加氧酶-1(HO-1)等。在多种不同的儿茶素成分中,EGCG是诱导HO-1表达的最有效的诱导剂。硫化铁纳米酶具有较好的自由基清除活性,也含有丰富的亚铁离子,基于此,我们将EGCG与硫化铁纳米酶结合,利用EGCG与铁的螯合作用,发挥更强的清除自由基和细胞保护能力,对AKI也有较好的治疗效果。本论文共分为两个部分,就单独GFeSNs清除ROS治疗AKI和EGCG-GFeSNs清除ROS治疗AKI两个方面展开研究,以下为主要内容:1.GFeSNs作为活性氧清除剂缓解急性肾损伤在AKI进展过程中,过量产生ROS与细胞和组织发生反应,导致不可逆和永久的细胞和组织损伤。因此,清除ROS是治疗AKI的关键。在本章,我们采用溶剂热合成法制备得到了四种硫化铁纳米酶(CFeSNs、DFeSNs、GFeSNs和TFeSNs),通过扫描电子显微镜、多硫化氢释放和超氧自由基(O2·-)的清除效率等实验筛选出了具有小尺寸片层结构的硫化铁纳米酶GFeSNs,实验结果表明,与CFeSNs、DFeSNs和TFeSNs相比,GFeSNs具有最高的多硫化氢释放能力和O2·-清除能力,因此我们选用GFeSNs进行后续实验。高倍透射电镜和元素映射图谱显示,GFeSNs为大小约为200nm的均匀片层结构,主要由Fe和S两种元素组成,与EDS图谱的元素分析一致。X射线衍射图谱和X射线光电子能谱图显示GFeSNs主要由FeS组成。接着,我们进一步详细检测了 GFeSNs的多硫化氢释放能力和各种自由基清除能力,结果表明,GFeSNs对·OH、O2·-、ABTS·+、H2O2和DPPH等自由基有很强的清除能力。细胞实验表明,GFeSNs在浓度为2.5至20 μg/mL的范围内对NRK-52E细胞和HEK293细胞均无毒,并且具有促进细胞增殖的作用。SSP4细胞染色结果显示,GFeSNs产生了大量的多硫化氢并进入细胞。随后,我们评估了 GFeSNs清除ROS保护细胞的能力。结果显示,10 μg/mL的GFeSNs可以使被300 μmol/L H2O2损伤的细胞活力恢复至92%,约84%的细胞能在500 μmol/L的H2O2存在下存活。DCFH-DA染色、线粒体膜电位染色和细胞活死染色实验结果也表明了 GFeSNs清除ROS保护细胞的能力。细胞内炎症因子水平和抗氧化水平检测显示,经过GFeSNs的处理,细胞内TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子水平显著下降,细胞内MDA和GSH也恢复至正常水平。这些结果强烈表明GFeSNs可以在抗炎和清除ROS方面发挥协同作用,以恢复细胞内抗氧化能力,起到保护细胞的作用。随后,我们利用Balb/c小鼠构建AKI小鼠模型探究了 GFeSNs对AKI小鼠的治疗效果。结果显示,GFeSNs可以显著降低AKI小鼠体内CRE和BUN水平,使AKI小鼠体重在短暂降低后持续恢复至正常水平,并且显著延长了 AKI小鼠的存活时间。接着,我们对各组小鼠进行组织水平因子检测,结果显示,通过GFeSNs的治疗,降低了 AKI小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子的释放。与AKI小鼠相比,GFeSNs处理的AKI小鼠中的KIM-1和HO-1水平显著降低。同时,组织水平SOD、MDA、LDH、H2O2和GSH含量也恢复至正常小鼠的水平。我们对小鼠肾脏组织进行病理切片,随后分别进行H&E、DHE和TUNEL染色,发现经过GFeSNs治疗的小鼠肾小管损伤程度减轻,肾组织细胞凋亡和细胞内超氧化物水平减少,与正常小鼠接近。血常规生化分析和主要器官H&E病理切片染色显示,GFeSNs对主要器官无明显毒性,有较高的生物相容性。此外,我们通过WB分析AKI相关蛋白表达发现,经过GFeSNs治疗的小鼠Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达量减少,而Bcl-2蛋白表达量增多,表明细胞凋亡减少;Nrf-2表达量增多,Keap-1表达量减少,表明细胞内抗氧化水平恢复。总之,这些结果清楚地证明了 GFeSNs对AKI的杰出治疗性能,使其成为AKI以及ROS相关疾病的潜在候选者。2.EGCG-GFeSNs缓解急性肾损伤的研究抗氧化剂对AKI导致的炎症和氧化应激具有保护作用,而EGCG是儿茶素中最强的抗氧化成分。在第一章,我们已经证明GFeSNs具有优异的清除自由基能力和细胞保护作用,对AKI也有显著的治疗作用。在本章,我们将EGCG与GFeSNs结合,扫描电子显微镜显示EGCG与GFeSNs结合后,EGCG-GFeSNs的大小形貌并未发生明显变化,仍为200 nm的片层结构。红外光谱显示EGCG与GFeSNs成功结合。细胞实验表明,EGCG-GFeSNs在浓度为2.5至20 μg/mL的范围内对NRK-52E细胞无毒。随后,我们评估了 EGCG-GFeSNs清除ROS保护细胞的能力。结果显示,2.5μg/mL的EGCG-GFeSNs就能使被30stent graft infection0 μmol/L H2O2损伤的细胞活力恢复80%以上,5μg/mL的EGCG-GFeSNs能使被300 μmol/L H2O2损伤的细胞活力恢复90%以上。DCFH-DA染色此网站、线粒体膜电位染色和Calcein AM/PI染色也表明了 EGCG-GFeSNs比GFeSNs具有更优异的清除ROS保护细胞的能力。溶血实验结果显示80μg/mL EGCG-GFeSNs溶血率低于5%,表明EGCG-GFeSNs有较高的生物相容性。这些结果均表明EGCG-GFeSNs比GFeSNs拥有更优异的清除ROS能力,保护细胞作用更强。接着,我们探究EGCG-GFeSNs对甘油致AKI小鼠的体内治疗效果。结果显示,250μg/kg EGCG-GFeSNs可以显著降低AKI小鼠体内CRE和BUN水平,AKI小鼠的体重在第4天开始上升,并持续恢复至正常水平,AKI小鼠的存活时间也显著延长。而用250μg/kg GFeSNs治疗后,AKI小鼠体内CRE和BUN仍处于较高水平,并且有AKI小鼠死亡。接着,我们对各组小鼠进行组织水平因子检测,结果显示,通过EGCG-GFeSNs的治疗,AKI小鼠体内IL-6和IL-1β等促炎因子的释放减少,肾损伤标志物KIM-1和HO-1水平显著降低。同时,组织水平SOD和GSH含量也恢复至正常小鼠的水平MS-275小鼠。而GFeSNs治疗组的肾组织因子含量仍处于较高水平。我们对小鼠进行H&E、DHE和TUNEL染色发现,经过EGCG-GFeSNs治疗的小鼠肾组织损伤减少,肾组织细胞凋亡和细胞内超氧化物水平减少,与正常小鼠接近。主要器官H&E染色显示,EGCG-GFeSNs对主要器官无明显毒性,有较高的生物相容性。这些结果表明,将EGCG与GFeSNs结合后清除ROS能力显著提高,对AKI也表现出更好的治疗效果。

甘蔗是我国RepSox分子量最重要的糖料作物,在保障我国食糖供给稳定中起Air medical transport着至关重要的作用。当前甘蔗生产过程中氮肥过量施用现象仍普遍存在,严重制约我国甘蔗产业可持续发展。以生物炭为载体的生物炭基肥可作为土壤改良剂,具备一定减肥增效潜力。本试验设置减氮配施生物炭基肥处理组(N1BF1、N1BF2、N1BF3)和常规施肥(N1)处理,探讨在同一氮磷钾水平下,减氮配施生物炭基肥对甘蔗根区土壤理化性质、酶活性、微生物群落及甘蔗农艺性状的改良效果。为蔗田减氮增效,优化施肥方案提供参考依据。研究主要结果如下:1、减氮配施生物炭基肥能改良土壤理化性质。与纯施氮肥N1相比,生物炭基肥处理组土壤容重降低,土壤p H、孔隙度、含水量、最大持水量升高;土壤有机质(SOM)、全碳(TC)、碳氮比(C/N)、速效磷(AP)、速效钾(AK)、铵态氮(NH_4~+-N)、可溶性有机碳(DOC)、可溶性总氮(TSN)含量,在生物炭基肥处理下均有不同程度提升。2、减氮配施生物炭基肥能调节土壤氮转化相关酶活性,提高氮素利用率。与N1相比,生物炭基肥处理组均显著提高甘蔗根区土壤脲酶(S-UE)、羟胺还原酶(S-HR)、亚硝酸还原酶(S-NiNSC 125973价格 R)活性,降低了硝酸还原酶(S-NR)活性。N1BF2处理脲酶(S-UE)和羟胺还原酶(S-HR)活性最高,N1处理硝酸还原酶(S-NR)活性最高。3、减氮配施生物炭基肥处理能调节甘蔗地上部和地下部生长。与N1处理相比,生物炭基肥处理组促进地下部生长主要表现为根长、根表面积、根系生物量增加;促进地上部生长表现为增加甘蔗﹢1叶叶绿素含量、氮平衡指数提高;甘蔗株高、茎径、锤度等农艺性状均不同程度提升。其中N1BF2处理对甘蔗地上部和地下部生长促进效果最优。4、减氮配施生物炭基肥对土壤细菌丰富度和多样性具有调节作用,并与生物炭基肥用量密切相关。放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、粘球菌门(Myxococcota)是细菌群落组成中的优势菌门。生物炭基肥处理组降低了放线菌门(Actinobacteria)群落丰度,增加了变形菌门(Proteobacteria)相对丰度。5、甘蔗根区土壤细菌群落、固氮菌群落变化主要驱动力为速效磷(AP)、速效钾(AK)、全氮(TN)。甘蔗株高、茎径、锤度、生物量等农艺性状与有机质(SOM)、可溶性有机碳(DOC)、酸碱度(p H)、速效钾(AK)、碱解氮(AN)、可溶性总氮(TSN)、全碳(TC)、碳氮比(C/N)、全氮(TN)、全钾(TK)、硝态氮(NO_3~–N)、铵态氮(NH_4~+-N)显著相关(P<0.01)。主要结论:减氮配施生物炭基肥能调节土壤容重、孔隙度、含水率等物理性状,增加土壤养分,调节土壤酶活性,提高氮素利用率。调节甘蔗根区土壤细菌、固氮菌群落丰度和多样性,调节甘蔗根系和地上部生长。本研究有助于优化甘蔗施肥,也为生物炭基肥作为减氮增效土壤改良剂提供参考施用范围。

H6亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)于1965年首次分离于美国以来,已经在家禽和野生鸟类中呈现地方流行性以及遗传多样性。更值得注意的是,H6 AIV在不断与不同亚型的禽流感病毒进行重组,还出现跨宿主传播人和猪的报道。这都提示我们H6 AIV对于公共卫生存在重大安全隐患。血凝素(HA)是禽流感病毒表面最丰富的糖蛋白,其主要负责与唾液酸受体结合,并促进病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合。同时HA还是流感病毒主要保护性抗原,目前已经鉴定了数个HA亚型的抗原表位,但是H6 AIV的HA抗原表位研究存在空缺,同时市面缺少检测H6 AIV的ELISA试剂盒。1.H6亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备本研究通过用分离于野鸟并在BALB/c小鼠上适应的H6N2 AIV毒株(A/Eurasianteal/Jiangxi/2018WB0417(H6N2))(MAE-Teal/417)免疫 BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,通过间接免疫荧光技术(IFA)对杂交瘤细胞进行筛选,通过两次亚克隆共获得15株H6 AIV的HA单克隆抗体,命名为1A5、1D4、2C5、3B9、3D7、4A7、4B4、4B8、4C2、4G2、5E9、5G2、6D2、6D11以及6E3。为进一步确定这些selleck化学单克隆抗体的特性,对这15株单克隆抗体进行了亚类鉴定、血凝抑制(HI)试验、蛋白免疫印记试验(Western Blot,WB)和ELISA试验。亚类鉴定结果显示15株单克隆抗体均为IgG亚类,其中1D4、3B9、4A7、4G2、5E9、6D11 为 IgG1 亚类,2C5、3D7、6D2 为 IgG2a 亚类,1A5、4B4、4B8、4C2、5G2、6E3为IgG2b亚类;HI试验结果表明,其中 1A5、2C5、3B9、3D7、4B4、4B8、4C2、5G2、6D2、6D11 以及 6E3 等 11 株单克隆抗体具有HI效价,效价为25-213;其他4株单克隆抗体——1D4、4G2、4A7、5E9没有HI效价;WB结果显示,只有6D11没有反应性,其余14株单克隆抗体均能有效结合pDP2002-HA转染的293T细胞中的HA蛋白。ELISA结果显示,15株单克隆抗体均对MA E-Teal/417具有较强的结合能力。为了进一步鉴定这些单克隆抗体的反应谱,我们检测了这15株单克隆抗体与两株和E-Teal/417不同进化谱系的H6 AIV的反应性,ELISA结果显示所有单克隆抗体均能与这两株H6 AIV结合,HI结果显示1 1株具有HI特性的单克隆抗体也均能与这两株H6 AIV有效结合,但结合能力具有较大差异,其中1A5、4C2、5E9和6E3这4株单克隆抗体与所检测的3株H6 AIV反应良好。以上单克隆抗体的研制为下一步鉴定H6抗原表位提供了必要材料。同时筛选到的4株与H6 AIV反应良好的单克隆抗体为后续建立检测H6 AIV双夹心ELISA方法提供了材料基础。2.抗体压力下H6 AIV的HA蛋白抗原位点氨基酸变异分析为鉴定H6禽流感病毒HA抗原表位,我们用具有HI效价的11株单克隆抗体制备MA E-Teal/417病毒抗体逃逸株。结果11株单克隆抗体共制备15株抗体逃逸株,通过对逃逸株HA序列进行测序分析,共发现9个氨基酸位点发生变异,分别Biodegradation characteristics是69、89、120、124、139、140、149、221、246 位点。通过对 NCBI 上公布的 2270株H6 AIV HA全序列分析发现,田间野生的H6 AIV在这9个位点上氨基酸都有不同程度的突变。鉴于4C2和6E3单克隆抗体靶的结合位点在相对保守的140和89位氨基酸,我们以BALB/c小鼠为模型,检测了这两株单克隆抗体对病毒的保护性,结果显示这两株单克隆抗体对于小鼠具有很好的预防效果,同时也具有相对良好的治疗效果。3.双抗体夹心ELISA方法的建立鉴于目前市面缺少检测H6AIV的ELISA试剂盒,我们用筛选出的4株(1A5、4C2、5E9、6E3)与所检测的H6 AIV反应性均较好的单克隆抗体建立检测H6 AIV抗原的双夹心ELISA方法。首先我们对这4株单克隆抗体进行过氧化酶标记,并用未酶标的单克隆抗体与酶标后的单克隆抗体交叉组合进行双抗体夹心ELISA试验;结果确定5E9株单克隆抗体作为捕获抗体,酶标6E3单克隆抗体作为检测抗体具有良好的检测效果。我们进一步对建立的ELISA方法进行优化,确定捕获抗体的浓度为4μg/mL,用2%BSA封闭液37℃封闭60 min,被检测的抗原37℃下作用时间为90 min,用1%脱脂乳将HRP标记6E3抗体稀selleck激酶抑制剂释成0.76μg/mL,37℃下反应60 min,TMB显色15 min为效果最好。同时对此ELISA方法的灵敏度、特异性及稳定性进行检测。结果显示此ELISA方法最低检测病毒低度为2.32 × 103 TCID50/mL,与 AIV-H1、AIV-H3、AIV-H4、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、AIV-HI0、AIV-H12 及FAdV-4、DAdV-3、IBV、NDV、GAstV、GPV、ALV、FAdV-8、IBDV 病毒不能反应,显示其有很好的特异性;批内重复实验的变异系数为1.55%-6.26%,批间重复性实验的变异系数为1.97%-7.13%,这表明该方法具有较好的稳定性。

目的 探讨两性霉素B胆固醇硫酸酯复合物（ABCD）治疗恶性血液病合并侵袭性真菌病（IFD）的疗效及安全性。方法 回顾性分析2021年postprandial tissue biopsies6月至2022年7月就诊于南方医科大学南方医院血液科的34例恶性血液病合并IFD患者应用ABCD的疗效及不良反应。结果 34例恶性血液病患者，白血病28例（82.4%），骨髓增生异常综合征4例（11.8%），淋巴瘤2例（5.9%）；其中异基因造血干细胞移植13例。31例诊断肺部真菌感染，6例合并其他部位真菌感染。8例采用高通量测序技术（NGS）检测到真菌病原体，其中仅3例血培养Liraglutide显示阳性，提示NGS在诊断中具有较好的灵敏度和特异度。随访时间97.5(6.0～121.0)d，疗效评判有效22例，无效12例，总有效率64.7%，有效组与无效组对比，患者的原发病缓解情况差异具有统计学意义（P=0.001），患者是否接受移植、粒细胞缺乏程度、持续时间等差异无统计学ABT-263作用意义（P>0.05）。30 d、100 d累积生存率分别为79%、71%。31例（91.2%）出现输液相关反应（IRRs），最常见为发热（93.5%）和寒战（35.5%）。7例（20.6%）发生肾功能损害，减停药物后好转。18例（52.9%）发生低钾血症，血钾水平2.95(2.34～3.38)mmol/L。结论 ABCD在治疗恶性血液病合并侵袭性真菌病中有较好的疗效，且毒副反应小，早期应用患者获益可能更大。