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研究目的:既往的大型长期随访队列研究观察到抑郁症状和患阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的风险升高有关,但它们两者之间的关系仍epigenetics (MeSH)未完全阐明。有研究表明,小胶质细胞激活代表的神经炎症不管是在抑郁症还是在AD的病因中都扮演着重要角色,而与小胶质细胞激活密切相关的脑脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)可溶性 TREM2(Soluble triggering receptor expressed on myeloid cell 2,sTREM2)蛋白已被证明在AD不同阶段中随着AD病理的变化而变化,但它与轻度抑郁症状(Minimal depressive symptom,MDS)的关系,一种出现抑郁症状但还未达到抑郁诊断标准的临床表现,以及它与MDS和AD病理中的关系尚不清楚。本研究旨在探讨它们三者之间的关系。探究方法:本研究从中国人阿尔茨海默病生物标志物和生活方式(Chinese Alzheimer’s Biomarkerand Lifestyle,CABLE)研究中招募了 796 名认知正常的参与者。通过汉密顿抑郁量表(Hamilton Depression Rating Scale,HDRS)评估参与者的抑郁症状水平。CSF sTREM2、Aβ(Amyloid β)42、Ptau(Phosphorylatedtau)和 TaMLN4924分子量u(Total tau)的水平则使用酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)实验测定。根据HDRS得分将参与者分为MDS(≥1且≤7)和正常(=0)组(Normal group,NG)。首先,我们使用 DABEST(Data Analyses with Bootstrap-coupled ESTimation)评估了 MDS和NG中脑脊液sTREM2水平的差异。其次,我们用多元线性回归分析检测了 MDS和sTREM2、AD病理(CSF Aβ42、CSF Ptau和CSF Tau以及它们之间的比值)以及认知之间的关系,校正了年龄、性别、教育年限和载脂蛋白(Apolipoprotein E,APOE)ε4携带者状态。最后,我们用因果中介分析来探究sTREM2是否可以调节MDS和AD病理之间的关系。此外,我们在按性别、年龄和APOEε4携带者状态分层的亚组中也进行了上述同样的统计分析。研究结果:在总人群以及各亚组中,MDS参与者相较于NG参与者呈现出较低的CSF sTREM2水平。多元线性回归结果提示MDS与较低的sTREM2(p<0.0001)、CSF Aβ42(p<0.0001)以及较差的认知表现(Mini-Mental State Examination,MMSE,p=0.0014)相关,但是与tau相关病理(CSFPtau和CSF Tau)并无明显相关性。基于中介模型的结果提示,sTREM2部分介导了 MDS和CSF AD病理之间的关系(p<0.0001),介导比例从2.91%到32.58%不等。此外,我们还发现sTREM2和淀粉样蛋白共同介导了 MDS对认知的影响。值得注意的是,在亚组分析中表明,sTREM2在上述统计模型中的结果在APOE ε4未携带者NSC 125973体内实验剂量组中最为显著。结论及意义:总而言之,我们的研究结果表明早期抑郁症状和小胶质细胞激活密切相关,并且这一表现没有年龄和性别上的差异。此外,我们还发现早期抑郁症状和AD淀粉样病理也有着密切联系。而且,小胶质细胞的激活代表着神经炎症在早期抑郁症状和AD病理之间扮演着重要调节作用。这三者之间的关系尤其在APOEε4风险基因未携带的人群中更为显著。这为AD早期阶段患有抑郁症状的病人提供了治疗手段,因为靶向sTREM2可能会减少淀粉样蛋白沉积并改善认知功能。

基因治疗是一种将外源基因导入人体的治疗方法,旨在修复或替换人体内的异常基因,达到治疗疾病的目的。尤其在肿瘤治疗方面,基因治疗被认为是彻底、安全治疗恶性肿瘤的希望所在,可通过基因免疫疗法、基因敲除治疗、基因修饰治疗、基因增补治疗等方式实现对恶性肿瘤的治疗。然而无论是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术还是外源基因片段(DNA或RNA)导入的基因治疗策略中,安全高效基因载体的缺乏一直是限制其临床应用的主要瓶颈之一。与病毒型基因载体相比,非病毒基因载体因其更低的免疫原性、较低的生产成本和更大的基因负载能力等优点逐渐受到关注。在非病毒基因载体中,阳离子脂质体、阳离子聚合物Metal bioremediation和纳米粒子等被用于基因递送载体的研究。其中阳离子聚合物聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)因其强大的DNA凝聚能力和优良的质子海绵效应成为该领域的研究热点。然而,PEI与DNA、RNA等基因物质构建而成的“载体/基因”递送系统的稳定性较差,体循环过程中易与其他生物大分子结合产生阳离子细胞毒性,且该体系属外来物质极易被人体免疫系统捕获,清除,体循环时间较短,从而导致基因递送效率低下。天然细胞膜因具有高生物安全性和低免疫原性等优点已被广泛应用于药物递送系统的研究。细胞膜表面蛋白的多种生物学作用可赋予纳米颗粒免疫逃逸、长循环时间、靶向传递等功能。因此本课题结合天然细胞膜与PEI两者的功能优势构建并评价了基于细胞膜包衣的肿瘤靶向基因递送系统,具体情况如下。1.基于细胞膜包封PEI/DNA复合物的基因载体构建与评价。首先采用挤压法将红细胞膜(RBCm)和小鼠单核巨噬细胞膜(RAWm)与PEI30k/DNA、PEI70k/DNA复合物按照不同质量比挤压得到一系列质量比梯度的RBCm/PEI30k/DNA、RBCm/PEI70k/DNA(简称RBCm-P30Dc、RBCmP70Dc)RAWm/PEI30k/DNA、RAWm/PEI70k/DNA(简称RAWm-P30Dc、RAWm-P70Dc)复合物,然后对其进行表征。结果显示RBCm-P30Dc、RBCmP70Dc、RAWm-P30Dc、RAWm-P70Dc四种复合物均表现为粒径200～300 nm之间的球状结构,并且与挤压之前的细胞膜相比膜蛋白条带未见明显减少,证明复合物成功合成。两种细胞膜对PEI/DNA复合物的包封效率均高于70%,其中RBCm-P70Dc复合的最大包封效率可达80.31%。在对DNA的结合保护及释放实验中成功证明复合物可以保护DNA免受核酸酶的降解,并在一定条件下可成功释放DNA。在p H=7.4的PBS缓冲液中存放14天粒径电位未发生明显变化,与对应分子量PEI相比,其对蛋白质的吸附性较低,表现出较强的C59配制稳定性。由安全性结果显示,相较于PEI/DNA复合物,使用细胞膜包封后的RBCm-P30Dc、RBCm-P70Dc、RAWm-P30Dc、RAWm-P70Dc复合物在293T及Hela细胞中的存活率均提高了20%左右。由细胞摄入实验可知,使用细胞膜包封之后的复合物在两种细胞中的摄入效率均有提升,其中在293T细胞中提升最为明显,四种复合物的最大摄入效率较未包封之前均提高了10%～15%。由体外转染实验可知,使用细胞膜包封后的复合物在293T与Hela细胞中的转染效率均有明显提高,其中RBCm-P70Dc复合物表现出最高的转染效率,在293T与Hela细胞中的最大转染效率分别为64.36%和15.91%,分别比PEI70k/DNA复合物高11.21%和6.54%。以上结果证明所制备的复合物安全、稳定、高效。2.谷胱甘肽响应的基因载体构建与评价。首先通过巯基丙酸分子中的-COOH与PEI分子中的-NH2缩合使PEI带有巯基,然后在温和条件下与细胞膜表面广泛存在的巯基氧化形成二硫键,将所得产物与DNA共孵育后使用脂质体挤出仪挤压制备得到一系列质量比梯度的RMP30k/DNA与RMP70k/DNA复合物,对其进行表征。结果显示RMP30k/DNA与RMP70k/DNA复合物表现为粒径200～300 nm之间的的球形结构。对DNA的包封效率可达90%以上,可保护DNA不受核酸酶的降解,并且在还原型谷胱甘肽获悉更多(GSH)存在的情况下,对DNA的释放速度及释放效率均有显著提高,表现出强烈的谷胱甘肽响应性。在p H=7.4的PBS缓冲液中存放14天粒径电位未发生明显变化,与对应分子量PEI相比,其对蛋白质的吸附性较低,表现出较强的稳定性。由安全性实验结果可知,RMP30k和RMP70k复合物对293T及Hela细胞的毒性明显低于对应分子量的PEI。由细胞摄入结果可知,293T细胞中RMP30k/DNA与RMP70k/DNA复合物的最大摄入效率分别为64.49%和73.42%,在Hela细胞中分别为51.65%和82.74%,与上一部分样品相比较,复合物在293T细胞中摄入效率没有特别明显的变化,但在Hela细胞中的摄入效率明显提高,其最大摄入效率提高8.32%。由转染实验可知,上一部分样品相比较,引入二硫键的复合物在293T细胞中的转染效率未有明显变化,但在Hela细胞中的最大转染效率提高了4.22%。以上结果证明所制备的复合物具有安全、稳定、高效且靶向释药的特点。3.肿瘤靶向的基因载体构建与评价。利用叶酸(Folic acid,FA)对RMPs/DNA复合物进一步修饰,实现基因的靶向递送。结果显示,FARMP70k/DNA复合物表现为粒径232.63 nm的球形结构,与RBCm相比FARMP70k/DNA复合物大部分膜蛋白得以保留,可以保证FA-RMP70k/DNA复合物中细胞膜的原有性质不会发生较大改变。由安全性实验可知,与RMP70k/DNA复合物相比,FA-RMP70k/DNA复合物对293T和Hela细胞的毒性没有明显变化。由细胞摄入实验可知,与RMP70k/DNA复合物相比,FARMP70k/DNA复合物的摄入效率显著提高,在293T与Hela细胞中的最大摄入效率分别为88.36%和96.08%。由细胞转染实验可知,FA-RMP70k/DNA复合物在293T与Hela细胞中的最大转染效率分别为79.58%和35.09%,与RMP70k/DNA复合物相比较最大转染效率分别提高9.65%和14.96%。以上结果证明引入FA分子可进一步提高复合物的靶向性。综上所述,本课题构建了一种肿瘤靶向谷胱甘肽响应的仿生基因载体,研究表明该体系具有较好的生物相容性、稳定性及靶向性,可显著降低PEI/DNA复合物的细胞毒性提高转染效率。

目的 研究冠心宁片（GuanxMDV3100分子式inning，GXN）对扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）的保护作用，并从NLRP3/ASC/Caspase-1通路深入探讨其对心肌细胞焦亡的作用机制。方法 随机将大鼠分为GXN低剂量组、GXN高剂量组、地高辛组、模型对照组和正常对照组，通过阿霉素（doxorubicin，DOX）累积注射17.5mg/kg诱导大鼠DCM模型，同时连续给药10周。超声心动图检测心功能指标，ELISA检测血清IL-1β和IL-18水平，RT-PCR法检测心肌组织NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB、TXNIP、IL-1β和IL-18的mRNA表达，免疫组化、免疫荧光染色和WesternBlot检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD、GSDMD-NT的蛋白表达及TUNEL染色结果，透射电镜观察心肌细胞显微结构的变化。结果 与正常对照组比，模型对照组的IVSs、IVSd、LVPWs、FS、SV、EF和HR显著降低，LVIDs、ESV及血清IL-1β、IL-18显著增加，NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB、TXNIP、IL-1β和IL-18的mRNA表达均显著增加，NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-NT的蛋白表达及TUNEL染色面积明显增加，显微结构明显改变。与模型对照组相比，冠心宁片可显著增加IVSs、SV、FS、EF和HR，显著降低LVIDs、ESV和血清IL-1β、IL-18水平，降低心衰大鼠的NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB、TXNIP、IL-1β、IL-1plasma medicine8的mRNA和NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-NT的蛋白水平及TUNEL染色面积，显微结构明显改善。结论 冠心宁片可以有效改善阿霉素诱导的扩张型心肌病，可能是通过抑制NLRP3/ASKD025使用方法C/Caspase-1通路改善扩张型心肌病大鼠的心肌细胞焦亡实现的。

贵金属纳米粒子在有机污染物催化降解、生物传感器和抗肿瘤药物研发等方面表现出较好的应用前景。贵金属infections in IBD纳米粒子能够催化降解水中的4-硝基苯酚(4-NP)类污染物;催化显色底物检测生物质分子和递送小分子化疗药物。贵金属纳米粒子的性能与其粒径和MRTX1133水溶液稳定性密切相关。如何制备出合适粒径并具有高稳定性的贵金属纳米粒子成为亟需解决的问题。榆荚是榆科植物榆树的果实。榆荚具有健脾安神、清热利水、消肿杀虫等功能。榆荚多糖是榆荚中的还原性的水溶性生物大分子。本文以首次提取的榆荚多糖为模板制备具有高稳定性和特殊形貌的银纳米粒子(EPP-Ag_n NPs n=10,25,40)、银钯双金属纳米粒子(EPP-Ag Pd_(1.5) NPs)和负载甲氨蝶呤(MTX)的银钯双金属纳米药物(EPP-Ag Pd_(1.5)-MTX),研究它们的制备条件、稳定性、降解有机污染物性能、比色检测性能、光热转换性能以及抗肿瘤性能等。主要内容如下:(1)首次提取得到榆荚多糖,利用榆荚多糖的水溶性和弱还原性成功制备了榆荚多糖负载银纳米粒子(EPP-Ag_n NPs n=10,25,40)。EPP-Ag_n NPs具有良好的分散性、稳定性。银纳米粒子的粒径范围在22.5-30.0 nm,具有很高的催化降解活性、光热转换性能和抑菌作用。EPP-Ag_n NPs对有机污染物4-NP的降解率高达94%,光热转换效率达到22%,在光热转换效应下对大肠杆菌的抑制率高达71%。(2)借助已经制备得到的EPP-Ag_n NPs负载钯得到近球形的EPP-Ag Pd_(1.5) NPs。EPP-Ag Pd_(1.5) NPs的粒径为33.6±5.5 nm。EPP-Ag Pd_(1.5) NPs能够催化氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)生成氧化TMB,具有类过氧化物酶活性。机理检测证明EPP-Ag Pd_(1.5) NPs催化H_2O_2生成羟基自由基来催化TMB。以EPP-Ag Pd_(1.5) NPs的类过氧化物酶活性为基础,建立了检测葡萄糖浓度的方法,检测限和检测范围分别为3.5μM和5-1000μM。此外,EPP-Ag Pd_(1.5) NPs的光热转换效率可达到39.7%,对Heselleck激酶抑制剂 La细胞的抑制率达到69.9%。(3)利用EPP-Ag Pd_(1.5) NPs负载MTX制备得到稳定了有抗肿瘤性能的新型纳米药物EPP-Ag Pd_(1.5)-MTX。EPP-Ag Pd_(1.5)-MTX的水动力学粒径为50.2 nm,在808nm近红外激光照射下光热转换效率为32.5%。EPP-Ag Pd_(1.5)-MTX在p H=7.4和5.5的条件下MTX释放量分别达到83.4%和87.5%。通过结合光热治疗和化疗取得了良好的抗肿瘤效果,对He La细胞的抑制率达到78.17%,对小鼠实体瘤的抑瘤率为97.8%,EPP-Ag Pd_(1.5)-MTX对于肿瘤的抑制作用大大增加,这表明我们成功探索出一种稳定的抗肿瘤纳米药物的制备方法。

为了解2021年我国猪圆环病毒2型(PCV2)流行情况，本试验于7个地区16个省采集1 685份组织样品，采用实时荧光定量PCR检测方法检测PCV2,对其中45份阳性样品进行全基因组序列扩增和遗传演化分析。结果显示，被检样品PCV2总阳性率为9.85%(166/1 685),场总阳性率为32.71%(35/107);各CL 318952说明书地区样品阳性率介于4.29%～19.00%,东北地区样品阳性率最高；各地区场阳性率介于structure-switching biosensors6.90%～60.00%,华中地区场阳性率最高。PCV2a、PCV2b和PCV2d亚型分离毒株占比分别为31.11%、4.44%和64.44%,其中PCV2d亚型为优势流行株，未发现PCV2e和PCV2c亚型。有24株PCV2分离毒株的Cap蛋白在C末端有1个赖氨酸(K)延伸，另有1株PCV2分离毒株的Cap蛋白在C末端有1个蛋氨酸(M)延伸。结果表明，2021年我国PCV2感染范围广，污染程度高，且正在不断发生遗传变异，需要持续跟踪监测PCV2的流行情况，以便及时制定有效的更多防控措施。

目的:通过观测血清转氨酶活力、氧化应激状态、病理切片及二价金属离子转运蛋白1(DMT 1)、转铁蛋白受体1(TfR 1)的基因表达量,研究赶黄草总黄酮对铁超载大鼠肝损伤的影响。方法:以含水乙醇加热回流提取赶黄草,并利用聚酰胺柱色谱纯化制备赶黄草总黄Telaglenastat配制酮。选择八周龄SPF级雄性SD大鼠40只,适应性喂养一周后随机均分为正常对照组、铁超载模型组、赶黄草总黄酮低、中、高剂量干预组(赶黄草总黄酮剂量分别为25、50、100 mg/kg·d)。除正常对照组腹腔注射等体积生理盐水外,其他实验组前两周按照50 mg/kg·bw、后两周按照100mg/kg·bw的剂量隔天腹腔注射右旋糖酐铁,同时赶黄草总黄酮低、中、高剂量干预组灌胃相应赶黄草总黄酮水混悬液,正常对照组灌胃等体积生理盐水。实验过程中,观察大鼠生长状况,连续给药4周后处死,取大鼠血清及肝脏,肝脏进行普鲁士蓝染色观察大鼠肝脏组织病理结构变化,血清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性水平以及丙二醛(MDA)含量。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测大鼠肝脏组织DMT 1、TfR 1mRNA表达水平。结果:(1)普鲁士蓝染色显示:与对照组相比,铁超载模型组肝细胞结构色素沉积严重,赶黄草总黄酮低、中、高剂量干预组肝细胞结构色素沉积也比较严重,但程度较模型组轻。(2)血清生化指标检测结果显示:与对照组相比,模型组血清SOD、GSH-PX活性显著降低(P<0.01),ALT活性、MDA含量显著升高(P<0.05),AST活性略升高但差异无统计学意义;与模型组相比,赶黄草总黄酮干预组血清SOD、GSH-PX活性均显著升高(P<0.05),且呈更多现一定剂量反应关系,高剂量组血清ALT活性、MDA含量显著降低(P<0.05),低、中剂量组略降低,但差异无统计学意义,干预组血清AST无明显变化。(3)RT-PCR结果显示:与对照组相比,模型组DMT 1、Tf R 1基因表达量均显著infectious period下调(P<0.05);与模型组相比,赶黄草总黄酮干预组DMT 1、TfR 1基因表达量均显著上调(P<0.05),且呈现一定剂量反应关系。结论:赶黄草总黄酮能够改善铁超载引起的大鼠肝脏铁沉积,降低血清转氨酶活力,改善氧化应激状态,抑制机体铁吸收的能力,从而对铁超载导致的肝脏损伤起到保护作用,其作用机制之一可能是:在机体铁超载时,赶黄草总黄酮通过抑制二价金属离子转运蛋白1和转铁蛋白受体1的表达,减弱转铁蛋白-转铁蛋白受体摄铁途径的铁摄取,进而减少铁的吸收,抑制过量的铁向胞内转运,减轻由铁超载导致的肝脏损伤。

目的:通过观测血清转氨酶活力、氧化应激状态、病理切片及二价金属离子转运蛋白1(DMT 1)、转铁蛋白受体1(TfR 1)的基因表达量,研究赶黄草总黄酮对铁超载大鼠肝损伤的影响。方法:以含水乙醇加热回流提取赶黄草,并利用聚酰胺柱色谱纯化制备赶黄草总黄Telaglenastat配制酮。选择八周龄SPF级雄性SD大鼠40只,适应性喂养一周后随机均分为正常对照组、铁超载模型组、赶黄草总黄酮低、中、高剂量干预组(赶黄草总黄酮剂量分别为25、50、100 mg/kg·d)。除正常对照组腹腔注射等体积生理盐水外,其他实验组前两周按照50 mg/kg·bw、后两周按照100mg/kg·bw的剂量隔天腹腔注射右旋糖酐铁,同时赶黄草总黄酮低、中、高剂量干预组灌胃相应赶黄草总黄酮水混悬液,正常对照组灌胃等体积生理盐水。实验过程中,观察大鼠生长状况,连续给药4周后处死,取大鼠血清及肝脏,肝脏进行普鲁士蓝染色观察大鼠肝脏组织病理结构变化,血清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性水平以及丙二醛(MDA)含量。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测大鼠肝脏组织DMT 1、TfR 1mRNA表达水平。结果:(1)普鲁士蓝染色显示:与对照组相比,铁超载模型组肝细胞结构色素沉积严重,赶黄草总黄酮低、中、高剂量干预组肝细胞结构色素沉积也比较严重,但程度较模型组轻。(2)血清生化指标检测结果显示:与对照组相比,模型组血清SOD、GSH-PX活性显著降低(P<0.01),ALT活性、MDA含量显著升高(P<0.05),AST活性略升高但差异无统计学意义;与模型组相比,赶黄草总黄酮干预组血清SOD、GSH-PX活性均显著升高(P<0.05),且呈更多现一定剂量反应关系,高剂量组血清ALT活性、MDA含量显著降低(P<0.05),低、中剂量组略降低,但差异无统计学意义,干预组血清AST无明显变化。(3)RT-PCR结果显示:与对照组相比,模型组DMT 1、Tf R 1基因表达量均显著infectious period下调(P<0.05);与模型组相比,赶黄草总黄酮干预组DMT 1、TfR 1基因表达量均显著上调(P<0.05),且呈现一定剂量反应关系。结论:赶黄草总黄酮能够改善铁超载引起的大鼠肝脏铁沉积,降低血清转氨酶活力,改善氧化应激状态,抑制机体铁吸收的能力,从而对铁超载导致的肝脏损伤起到保护作用,其作用机制之一可能是:在机体铁超载时,赶黄草总黄酮通过抑制二价金属离子转运蛋白1和转铁蛋白受体1的表达,减弱转铁蛋白-转铁蛋白受体摄铁途径的铁摄取,进而减少铁的吸收,抑制过量的铁向胞内转运,减轻由铁超载导致的肝脏损伤。

目的:为了充分利用三文鱼皮资源,制备性能优良、生物相容性良好的可降解胶原膜材料,为后期开发医疗器械产品做准备,探究三文鱼胶原膜(Salmon Collagen Membrane,SCM)在骨组织修复的效果。方法:首先,以三文鱼皮为原料,通过不同浓度的Na OH和H_2O_2溶液在不同时间处理三文鱼皮,选择最佳预处理条件,达到脱色、脱杂蛋白的目的;并通过对体外降解率、机械性能、变性温度、交联度以及微观结构的检测,比较戊二醛、京尼平以及碳化二亚胺(EDC)三种交联剂对SCM的影响,最终确立SCM的最佳工艺条件。其次对最终制备得到的SCM的理化性能进行研究,验证其是否满足医疗器械的基本要求,主要包括缝合线撕裂力、酸碱度、水分、总蛋白、羟脯氨酸、脂肪、灰分、重金属以及外源性DNA残留。最后根据《GB/T 1Cobimetinib半抑制浓度6886生物学评价试验》系列标准,通过细胞毒性试验、细胞增殖试验、细胞粘附试验、热原试验、溶血试验、小鼠全身急性毒性试验、局部植入试验、皮肤致敏实验、亚慢性全身毒性试验以及皮内反应试验验证SCM的生物安全性。并建立SD大鼠颅骨缺损的模型,通过显微X射线断层扫描观察大鼠的骨修复情况,计算大鼠颅骨愈合率,对SCM的有效性进行初步的研究。结果:通过对三文鱼皮的genetic privacy脱色脱杂工艺研究,确定最佳脱色脱杂方式是在0.1mol/L Na OH、4%H_2O_2条件下处理鱼皮6 h。不同组别的SCM检测结果表明10mmol/L EDC交联得到的SCM具有良好的体外降解率,机械性能、变性温度、交联度以及微观结构,基本符合要求。具体理化性质如下:缝合线撕裂力为3.33±0.4 N,酸碱度为7.39±0.03,水分含量为10.22±0.04%,总蛋白含量为90.69±0.02%,羟脯氨酸含量为8.90±0.98%,脂肪含量为0.96±0.PF-02341066临床试验60%,灰分为0.95±0.33%,重金属含量低,DNA残留量为38.96 ng/mg,结果表明SCM符合在医学中的行业标准。SCM的生物相容性的研究结果如下:细胞毒性试验表明SCM不存在细胞毒性;细胞增殖和细胞粘附试验表明MC-3T3E1小鼠前成骨细胞可在SCM上粘附与增殖。热原试验和溶血试验结果表明SCM不具有致热性和溶血性;急性全身毒性试验和亚慢性全身毒性试验表明SCM不具有急性全身毒性和亚慢性全身毒性。局部植入试验、皮内反应试验以及致敏试验同样表明SCM具有良好的了生物相容性和安全性,基本满足修复材料的需求。大鼠颅骨修复试验研究结果初步发现试验组与阴性对照组、阳性对照组相比有较好的骨修复现象,说明以三文鱼皮为原料所制备的可降解胶原膜具有优益的骨修复作用。

目的:晶体在肾小管上皮细胞的黏附聚集是肾结石形成的重要步骤,细胞损伤和晶体聚集可能是影响晶体在细胞表面黏附沉积的关键。SIRT3在清除组织活性氧和减弱氧化应激损伤中起重要作用,调节细胞坏死性凋亡可能是SIRT3发挥作用的重要途径,而聚乙二醇具有分散剂的特性以及修复细胞的作用,对晶体聚集可能有抑制作用。因此本课题拟探究SIRT3调节坏死性凋亡在草酸钙肾结石形成中的作用及探索聚乙二醇对晶体黏附聚集的干预研究。方法:第一部分采用SIRT3过表达、SIRT3敲除及野生型C57BL/6雄性小鼠,通过乙醛酸bioartificial organs腹腔注射构建小鼠草酸钙肾结晶模型,肾脏标本HE染色,SIRT3免疫组化,Von Kossa染色以及蛋白免疫电泳检测SIRT3、p-MLKL表达水平。第二部分以小鼠肾小管上皮细胞TCMK-1为研究对象,构建一水草酸钙刺激细胞为模型组,预使用RIPK3抑制剂GSK872后加入一水草酸钙刺激作为抑制剂组,以及加入等量PBS的对照组。观察表面晶体黏附情况,检测细胞活力、细胞毒性、氧化应激水平,以及蛋白质免疫印迹检测RIPK1,RIPK3,p-MLKL表达水平。第三部分以活性氧刺激剂、PEG4000及一水草酸钙多种组合CB-839临床试验刺激TCMK-1,检测细胞活力、细胞毒性及活性氧水平,观测细胞状态及晶体黏附情况。结果:(1)小鼠肾草酸钙晶体沉积诱发肾小管上皮细胞坏死性凋亡明显增加,SIRT3过表达可以调节坏死性凋亡,减轻晶体性肾损伤,并减少肾脏晶体沉积。(2)体外研究表明,当一水草酸钙晶体浓度在低水平(6cm培养皿400ug/ml以下)时,抑制细胞坏死性凋亡可以一定程度地减轻细胞损伤并减少细胞表面晶体黏附沉积。当一水草酸钙晶体浓度超过800ug/ml时,细胞表面晶体聚集形成不定型沉淀,减轻细胞坏死性凋亡细胞损伤不能减少晶体黏附沉积总量。(3)预使用聚合物PEG4000能够使悬液体系中晶体颗粒保持悬浮稳定状态,并能够减轻细胞氧化应激损伤,显著减少细胞表面晶体黏附沉积。结论:肾脏草酸钙晶体沉积涉及RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡,SIRT3通过调节坏死性凋亡能够减轻晶体性肾损伤。体外研究表明减轻肾小管上皮细胞坏死性凋亡可以一定程度减少晶体黏附,但较高的晶体负荷可在细胞表面黏附聚集形成不定型沉淀,LY-188011半抑制浓度预使用聚合物PEG4000能够保持晶体颗粒悬浮稳定,减轻细胞氧化应激损伤,减少细胞晶体黏附。

L-抗坏血酸(L-Ascorbic Acid,L-AA)又被称作维生素C(Vitamin C,VC),是一种人体自身无法合成的营养元素,具有高抗氧化性,在人体的生长发育以及各种生理活动中都有着及其重要的作用。由于VC本身的结构极不稳定KD025配制,在一些光、热以及金属离子环境中极易分解,这极大地限制了VC的应用范围。为了增强VC的稳定性,合成了一些VC的衍生物,在这些衍生物中,2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)由于具有较高的稳定性,并且可被人体内α-葡萄糖苷酶重新分解成L-抗坏血酸与葡萄糖,进而发挥出L-抗坏血酸的生理作用,故被认为是L-抗坏血酸的极佳替代品,在食品、医疗、饲料以及化妆品等行业都有着广泛的应用。目前AA-2G主要通过生物法合成,常用的催化酶为环糊精葡萄糖基转移酶简称(CGTase,EC 2.4.1.19),CGTase不仅具有较强的产物特异性而且也具有较高的AA-2G产量,故在目前能催化合成AA-2G的酶中属于应用最广并且研究最多的一种酶。研究发现以环糊精为底物时,CGTase制备AA-2G的产量较高,但是环糊精的成本较高不利于工业化生产,以价格低廉并且易溶于水的麦芽糊精制备AA-2G可以大大降低成本。由于CGTase对麦芽糊精的亲和力较低,故制备AA-2G的产量也较低,可通过对CGTase进行分子改造以提高其对麦芽糊精的亲和力,从而降低成本与更高效地制备AA-2G。本论文以实验室先前构建的编码环糊精葡萄糖基转移酶my20的基因工程菌为研究对象,通过饱和突变对其进行定向改造,提高了其以麦芽糊精和L-AA为底物制备AA-2G的转化率,主要研究内容如下:以实验室先前保藏的重组质粒p ET24a/my20为模板,通过三维结构模拟与序列比对分析确定了突变位点Y260与A236,随后对其进行饱和突变,将表达后的突变体发酵制取粗酶液,并通过镍柱亲和层析的方法进行纯化。以麦芽糊精与L-抗坏血酸为底物制备AA-2G,最终筛选出了两株AA-2G产量提高的菌株:Y260F与A236P,随后又构建了双突变体Y260F/A236P。对MY20以及Y260F/A236P的酶学性质进行测定,MY20的最适反应温度为80℃,Y260F/A236P则在60℃有最大活性,两者的最适反应pH均为7。野生型以及突变体均有良好的热稳定性与pH稳定性,在20℃-80℃的条件下放置2 h后,MY20与Y260F/A236P均能保持90%以上的活性,pH 4-10范围内4℃保温12 h,MY20与Y260F/A236P的环化活力仍能保持在80%以上。Ca~(2+)可以增强MY20与Y260F/A236P的环化活性,而Cu~(2+)则会抑制两者的活性。对野生型以及突变体制备AA-2G的反应温度、pH、酶浓度、底物配比以及反应时间进行优化,MY20、Y260F以及Y260F/A236P的最适反应温度为30℃,A236P的最适温度为40℃,与野生型相比,A236selleck化学P具有更高的反应温度,这可能有助于底物的溶解。MY20以及突变的最适反应pH都为4,最适加酶量都为120 U/g麦芽糊精,最适底物配比为麦芽糊精/L-抗坏血酸=1/3,都在反应24 h获得最大产量。双突变体Y260F/A236P在最优条件下合成AA-2G的产量为30.19 g/L,比野生型CGTase提高了11.85%。对野生型以及突变体进行动力学研究,发现突变体Y260F、A236P、Y260F/A236P的L-抗坏血酸K_m值分别比野生型降低了15.02%、9.36%、28.56%,K_(cat)/K_m分别比野生型提高了43.66%、30.51%、85.91%。结果表明,这些突变体对L-AA的亲和性和催化效率都有所提高。最后,通过同源建模以及分子对接对实验结果进行机理分析。以可溶性淀粉为底物探究MY20与Y260F/A236P的底物特异性,并对底物浓度、加酶量以及反应时间进行优化,最终在加酶量5 U/g淀粉、5%底物浓度下反应24 h后,MY20与Y260F/A236P制备medical-legal issues in pain management环糊精的转化率均达到最高,分别为49.78%与47.46%。结果表明,突变体Y260F/A236P相对于MY20不仅合成AA-2G的产量有所提高,也具有较好的温度稳定性与pH稳定性,在工业化生产中具有较大优势。