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基于铁死亡介导的氧化应激探讨慢性心力衰竭的发病机制，及参附注射液对慢性心力衰竭的具体作用靶点。采用异丙肾上腺素诱导法制备慢性心力衰竭大鼠模型，将成模大鼠按随机数字表法分为3组：模型组、参附注射液组、ferrostatin-1(铁死亡抑制剂)组，另设正常组，给药15 d后，检测各组大鼠心脏质量指数及左心室质量指数；超声心动图评价心脏功能；苏木素-伊红(HE)、Masson染色观察心脏组织病理形态及纤维化情况；普鲁士蓝染色法检测心肌组织铁离子的聚集情况；透射电镜观察心肌组织线粒体超微结构变化；比色法检测铁代谢、脂质过氧化、抗氧化指标水平；流式细胞仪检测脂质活性氧(lipid-ROS)含量和活性氧(ROS)荧光强度；Western blot法、RT-qPCR法检测心肌组织铁死亡相关因子蛋白及mRNA表达。研究结果表示，模型组大鼠心功能降低，总铁、Fe~(2+)水平上升，GSH水平下降；MDA水平上升，SOD、GSH-Px水平下降；ROS、lipid-ROVP-16试剂S水平上升；出现明显纤维组织增生伴炎症细in vivo infection胞浸润，心肌纤维化明显；可见铁离子聚集；出现铁死亡特异性线粒体特征性改变；心肌此网站组织中p53、COX2蛋白及mRNA表达上升，GPX4、FTH1、SLC7A11、Nrf2蛋白及mRNA表达下降；参附注射液干预后，心功能明显改善，铁代谢、脂质过氧化、抗氧化相关指标恢复；铁沉积量降低；线粒体结构和功能好转；炎性细胞浸润、纤维化程度减轻；心肌组织中p53、COX2蛋白及mRNA表达下降，GPX4、FTH1、SLC7A11、Nrf2蛋白及mRNA表达上升。参附注射液可以通过调节铁代谢，抑制铁死亡，减轻氧化应激损伤，从而改善心功能。

生物传感器是指通过分子探针对目标物识别并将其转化为可检测信号的转换器,在医药、疾病监测、环境等均有广泛的应用前景。聚多巴胺(PDA NPs)、Au NPs等纳米材料由于其独有的性质大大提升了生物传感器的适用性及检测过程中的灵敏度。本论文基于Au NPs和荧光聚多巴胺(FPDA NPs)等纳米材料构建了比色法与比率型荧光检测法等操作简便、灵敏度高的定量分析新方法,具体内容如下:肝素(Hep)作为生物体内一种不可缺少的天然的多糖,在抗凝血、新陈代谢等生理过程发挥着重要作用。Hep的应用较为广泛,在临床中作为抗凝剂,术后可用于医疗护理等。在第二章,开发了一种简便快捷的Au NPs的合成方法并进一步将其应用于Hep的分析检测。在2-吗啉乙磺酸(MES,p H=6.0)做还原剂、保护剂及缓冲溶液的多重角色下,于1 min内便可快速合成Au NPs。在此基础上,利用Au NPs聚集变色效应开发了用于Hep检测的纳米传感平台。Au NPs容易在高浓度氯化钠(Na Cl)的作用下而变色,Au NPs溶液由酒红色变蓝色。然而Hep的加入抑制了Na Cl引起的Au NPs的团聚,溶液呈现酒红色。通过溶液中Au NPs的颜色变化实现对Hep的定量分析检测。该纳米传感平台对Hep的检测具有良好的选择性和灵敏度。传感器的线性范围为0-1300μg?m L~(-1),检测限为3.1μg?m L~(-1)。此外,该检测方法成功用于人血清中Hep的检测,证明该纳米传感器在生物医学中具有较高的应用价值。四环素类抗生素(TCA)由于价格低廉、使用方便,从20世纪40年代首次合成至今已广泛用于治疗细菌感染等疾病。然而长期的使用TCA使得细菌的耐药性增加,从而产生不良反应。四环素类药物在进入人体内后,残留物会在体内聚集,引起肠胃、肾脏等的不适,因此,快速检测TCA对于环境和人体健康具有重要意义。在第三章,基于FPDA NPs和Eu MOF的荧光信号作为输出单元,构建比点击此处率型荧光传感器用于四环素类药物的分析检测。检测技术主要利用Eu~(3+)和四环素(TC)或土霉素(OTC)、HEPES缓冲溶液配位,生成具有红色荧光发射性能的Eu MOF,同时FPDA NPs的荧光受TCA的影响而下降这一原理用来检测TC和OTC,传感器具有良好的选择性和灵敏度。其中传感器对TC的检测范围是0～100μM,检测限为0.44μM,对OTC的检测范围是0～70μM,检测限为0.6μM。在此基础上,进一步验证了传感器在湖水、自来水等实际样品中的检测性能,实验结果表明该传感器在湖水、自来水中有着良好的检测性能,证明了在实际水质样本中的应用潜力。铈(Ce)是镧系金属之一,其主要的离子存在形式为Ce~(3+)和Ce~(4+)。Ce~(4+)具有良好的杀菌功效,但过量累计会破坏细胞结构对生物体有害。因此,探索一种快速检测Ce~(4Antibiotic-siderophore complex+)的方法是十分有必要的。L-抗坏血酸(AA)是一种生命体必须的物质,在人体中维持着生长和新陈代谢,而且能预防癌症和各类疾病。在医学中,A更多A的含量可用作人体是否健康的评定标准。在第四章,开发了一种基于调控Ce~(4+)纳米复合物的模拟氧化酶活性的比率型荧光传感器用于Ce~(4+)和AA的检测。Ce~(4+)可以与HEPES缓冲溶液及FPDA NPs通过配位作用形成FPDA NPs-Ce~(4+)-HEPES纳米复合物,该纳米复合物具有模拟氧化酶活性,可以大幅度增强对底物邻苯二胺(OPD)的氧化能力。OPD被氧化之后生成发射黄色荧光的2,3-二氨基吩嗪(DAP)的能力,同时FPDA NPs的荧光被Ce~(4+)有效淬灭。而AA可以将Ce~(4+)还原成Ce~(3+),形成的PDA NPs-Ce~(3+)-HEPES纳米复合物不具有催化氧化OPD活性,Ce~(3+)也不具有对FPDA NPs的荧光淬灭性能。通过DAP和FPDA NPs的荧光强度比值变化实现对Ce~(4+)和AA的高灵敏分析检测。该传感器用于检测Ce~(4+)的线性范围为0-600μM,检测限为96.2 n M,用于检测AA的线性范围0～150μM,检测限为2.23μM。为了进一步探索该传感器的实际应用价值,分别于自来水、湖水中检测Ce~(4+),橙汁和人血清中检测AA,结果表明该方法在实际样品检测中具有潜在的发展前景。

目的卤乙酰胺(Haloacetamides,HAcAms)是饮用水中发现的一类含氮的新非受控消毒副产物(Disinfection by-products,DBPs),因其细MLN4924 NMR胞毒性和遗传毒性极强,且远超受控的三卤甲烷类和卤乙酸类DBPs而备受关注。前期研究表明水中某些HAcAms-DBPs是极强的氧化应激原,可诱导肝细胞损伤增强肝毒性。因氧化应激是非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)发生发展的重要影响因素,因此,探析现实暴露水平的HAcAms-DBPs混合暴露是否能引起NAFLD的主要表型及其可能机制,对认识HAcAms-DBPs在NAFLD中的作用有重要的公共卫生学意义。材料和方法本研究以上海市某自来水厂出厂水中HAcAms-DBPs现实暴露组份和浓度为基础,以人源性肝LO-2细胞为模型,研究现实暴露水平1、10、100和1000倍的HAcAms-DBPs模拟混配对LO-2细胞的毒性、铁死亡状况、氧化应激反应特征、脂质代谢与沉积及与重要机体防御核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2,NRF2)和过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)通路影响。利用CRISPR/Cas9技术分别构建NRF2稳定沉默(NRF2 knock-down,NRF2-KD)和PPARγ稳定沉默(PPARy knock-down,PPARγ-KD)的LO-2细胞,研究HAcAms-DBPs混合暴露引起肝细胞损伤和脂质沉积的作用基础与环节。结果上海某自来水厂出厂水中检出溴乙酰胺、氯碘乙酰胺、氯乙酰胺、溴碘乙酰胺、溴氯乙酰胺和溴二氯乙酰胺6种HAcAms-DBPs,总浓度为13.05μg/L。1-100倍现实暴露水平的HAcAms-DBPs对LO-2细胞无明显的细胞毒性,但100倍现实暴露浓度HAcAms-DBPs可引起LO-2细胞谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)分泌增加,诱导LO-2细胞活性氧(ROS)和脂质过氧化物(LPO)生成,激活NRF2通路介导的氧化应激反应和PPARγ表达。100倍现实暴露水平的HAcAms-DBPs可引起LO-2细胞脂质沉积和甘油三酯含量显著升高(P<0.05),增加细胞脂质从头合成通路中ATP柠檬酸裂解酶(ACL)等蛋白表达水平;而HAcAms-DBPs未能引起NRF2-KD和PPARγ-KD的LO-2细胞中脂质沉积,但对PPARy-KD的LO-2细胞中脂质从头合成通路的激活效应减弱。100倍GW-572016半抑制浓度现实暴露水平的HAcAms-DBPs可显著升高LO-2细胞内铁离子水平(P<0.05),并降低铁死亡标志蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)表达,引起细胞铁死亡,且HAcAms-DBPs低剂量混合暴露加剧了NRF2-KD细胞的铁死亡。结论 HAcAms-DBPs可经激活NRF2/PPARγ通路引起immunological ageing肝细胞脂质沉积和甘油三酯聚集,通过诱导铁死亡加剧肝损伤。因此,HAcAms-DBPs是NAFLD的重要风险因子。未来应进一步观察HAcAms-DBPs暴露对人群NAFLD影响。

目的：评估单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型中调控核因子E2相关因子2(Nrf2）/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4）信号通路抑制铁死亡及肾脏纤维化的作用，检测慢性肾脏病（CKD）患者肾脏组织相关铁死亡及纤维化指标的表达情况。方法：收集9例CKD患者及9例非CKD患者肾穿标本石蜡切片，免疫组化法检测GPX4、Nrf2和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。动物实验中，25只6～8周龄雄性C57BL/6小鼠采用简单随机抽样方法分为5组：假手术组、UUO模型组、UUO+liproxstatin-1(Lip-1；铁死亡抑制剂）组、UUO+selleck激酶抑制剂萝卜硫素（SFN;Nrf2激动剂）组、UUO+厄贝沙坦（IRB）组，每组5只。正常饲料喂养1周，后3组分别腹腔注射Lip-1(10 mg·kg~(-1)·d~(-1)）、SFN(25 mg·kg~(-1)·d~(-1)）和IRB(20 mg·kg~(-1)·d~(-1)）。取血清标本测定血清肌酐和尿素氮；肾脏组织石蜡包埋后行HE、Masson和Sirius red染色观察肾脏病理改变；Western blot、实时荧光定量PCR和免疫组化法检测小鼠肾脏组织Nrf2、GPX4、溶质载体家族7成员11(SLC7A11）、纤连蛋白（Fn）、I型胶原（ColS63845核磁-I）、α-SMA和NADPH氧化酶4(NOX4）的表达。结果：免疫组化结果显示，CKD患者肾脏组织石蜡切片GPX4和Nrf2表达低于非CKD患者，而α-SMA表达高于非CKD患者。动物实验中，与UUO组相比，3组用药组肾功能有改善，肾脏纤维化程度及相关指标表达减少；Lip-1和SFN用药组肾脏组织中Nrf2、GPX4和SLC7A11psychobiological measures表达水平高于UUO组（P<0.05),NOX4表达水平低于UUO组（P<0.05）。结论：CKD患者及UUO小鼠肾脏纤维化及铁死亡显著增加；调控Nrf2/GPX4信号通路可抑制铁死亡并有效减轻UUO小鼠肾脏纤维化。

目的：探讨眼部按摩护理在青光眼小梁切除术后患者中的应用效果。方法：选取2020年6月1日～2022年3月31日开展小梁切除术的303例(303眼)The fatty acid biosynthesis pathway青光眼患Compound 3者作为研究对象，开展回顾性分析，划分为观察组200例(200眼)和对照组103例(103眼),观察组实施眼部按摩护理，对照组实施常规护理干预。比较两组眼压、滤过泡分级、肿瘤坏死因子(TNF-α)、促红细胞生成素(EPO)及预后情况，分析TNF-α、EPO与眼压相关性及预后影响因素。结果：交互作用下，眼压、TNF-α、EPO水平均随着时点变化而变化(P<0.01);组内作用下，眼压均呈先下降、后上升的趋势(P<0.01),TNF-α、EPO水平均呈下降趋势(P<0.01);不同时点组间作用下，观察组眼压、TNF-α、EPO水平低于对照组(P<0.01);观察组滤过泡分级情况Ⅰ型46.00%、Ⅱ型44.50%、Ⅲ型10.00%、Ⅳ型4.50%,对照组Ⅰ型22.33%、Ⅱ型27.18%、Ⅲ型28.16%、Ⅳ型22.33%,差异有统计学意义(Z=-6.580,P<0.001);TNF-α、EPO、眼压均呈正相关关系，相关系数为0.471、0.370;TNF-α与EPO呈正相关关系，相关系数为0.522,差异有统计学意义(P<0.01);观察组并发症发生率低于对照组(P>0.05)。性别、干预方式、类型、受教寻找更多育程度、滤过泡分级、TNF-α水平、年龄、EPO是影响预后的因素。结论：眼部按摩护理可减轻青光眼小梁切除术后房水眼压，降低TNF-α水平，促进新陈代谢，改善患者预后。

补骨脂因含香豆素类、黄酮类和单萜酚类等化学成分，具有抗肿瘤、抗氧GSK J4使用方法化、抗菌、抗炎、调节雌激素水平、促进骨生长、神经保护等作用而广泛用于肾部疾病、脾胃病、肢体经络病、妇科病的治疗，是临床常用的传统“无毒”的补益类中药，但近年来，国家药品不良反应监测中心多次通报警示补骨脂相关制剂（如壮骨关节丸、仙灵骨葆胶囊、致康胶囊）引发的肝损伤问题，更有单味补骨脂引发肝损伤的临床病例报道，其肝损伤现象已成为当前行业研究的热点及难点，为补骨脂的临床安全用药带来极大挑战。课题组前期基于脂多糖模型证实了补骨脂具有特异质肝损伤的属性，并从体内外角度相互验证了补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚、补骨脂定或可通过调控PI3K-AKsevere alcoholic hepatitisT信号通路、NF-κB信号通路、NLRP3信号通路等引发MRTX1133研究购买肝损伤。该文通过对近年来补骨脂肝毒性的相关文献进行整理、归纳，探讨引起补骨脂肝毒性的主要毒理机制，并总结了配伍减毒和炮制减毒对减轻补骨脂肝毒性的重要意义，为补骨脂的临床安全用药提供数据支撑。

[摘要]目的通过网络药理学探讨二至丸治疗卵巢早衰（POF）的机制。方确认细节法 通过中药系统药理数据库与分析平台收集女贞子、墨旱莲的活性成分及作用靶点；使用蛋白质数据库获取标准蛋白名并转换靶点基因名；使用GeneCards、OMIM、DrugBank数据库收集POF疾病基因靶点与复方中药靶点取交集；对潜在靶点进行基因本体论分子功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；构建中药成分-靶点-通路图。利用AutoDockVina软件对关键活性成分与核心靶点进行分子对接验证。结果 通过拓Nucleic Acid Purification扑分析得到表皮生长因子受体（EGFR）、IL-6、肿瘤蛋白p53、丝裂原激活蛋白激酶14、重组人AKT1激酶、c-Fos蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1等7个核心靶点；通过KEGG富集分析共得到172条信号通路，二至丸可能通过IL-17、P13/Akt、EGFR、FoxO、HIF-1等信号通路对POF起治疗作用。核心成分-靶点的分子对接最小结合能均<-24.https://www.selleck.cn/products/INCB18424.html24 kJ·mol~(-1)，表明配体分子与受体蛋白对接良好。结论 二至丸可通过多种目标基因、分子通路治疗POF。

目的 观察老年膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis, KAM-2282供应商OA)的高频超声与MRI影像的特征，比较其诊断价值。方法 选择我院2020年2月至2022年2月收治的40例老年骨性关selleck抑制剂节炎患者共58个膝关节进行研究，所有患者均经关节镜检查确诊为KOA,对患者行高频超声检查及MRI检查，比较两种检查的影像学表现及检出率。结果 在KOA的非骨性病变中，滑膜增厚、髌上囊积液、关节软骨退行性变、软骨下Cytokine Detection骨破坏、半月板病变、髌下脂肪垫损伤、腘窝囊肿、骨质增生及关节周围韧带损伤检出率比较，二者差异无统计学意义(P>0.05),高频超声对关节内韧带损伤检出率低于MRI,对增厚滑膜血流检出率高于MRI,二者差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 高频超声和MRI检查在老年膝关节骨性关节炎中具有相近的诊断价值，在关节内韧带、滑膜血管检查中各具优势。高频超声是一种简单价廉的检查方式，可作为膝关节骨性关节炎的首选筛查方法。

目的:系统评价胰岛素注射致皮下脂肪增生的相关危险因素，为临床干预提供循证依据。方法:计算机检索中国知网、万方数据库、中国生物医学文献数据库、PubMed、the Cochrane Library、EMbase、Web of Science数据库，检索Barasertib研究购买时限从建库至2022年4月30日，收集公开发表的胰岛素注射致皮下脂肪增生相关因素的队列研究、病例对照研究及横断面研究。应用StaMass media campaignsta 16.0软件进行Meta分析。结果:共纳入20篇文献，涉及7 217例病人。Meta分析结果显示未正确轮换注射部位[OR=2.90,95%CI(2.12,3.99)]、针头重复使用[OR=1.15,95%CI(1.02,1.29)]、重复使用次数>5次[OR=2.38,95%CI(1.79,3.17)]、体质指数增高[WMD=0NN2211.78,95%CI(0.05,1.51)]、糖尿病病程[WMD=1.69,95%CI(0.01,3.37)]及注射胰岛素年限增加[WMD=1.12,95%CI(0.51,1.73)]、胰岛素日总剂量大[WMD=4.89,95%CI(2.60,7.17)]、针头长度≥8 mm[OR=1.34,95%CI(1.01,1.78)]、注射区域面积较小[OR=1.21,95%CI(1.01,1.46)]、胰岛素治疗方案[OR=1.75,95%CI(1.38,2.22)]等为胰岛素注射致皮下脂肪增生的相关因素。结论:现有证据表明，医务人员应对病人进行针对性教育并强化，尤其是面对年龄较大的胰岛素注射病人，应指导其正确轮换注射部位、一次性使用注射针头；其次针对体质指数过高、注射胰岛素年限较长、胰岛素注射日总剂量较大等高风险病人，应定期评估检查其注射区域皮肤情况，及时干预和治疗。

目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌的大部分,目前是全球癌症相关死亡的第三大原因。HCC发生在多年慢性肝病之后,基因组中的突变是癌症的致病和决定性特征。慢性肝病尤其是在肝硬化阶段,会导致突变的进行性积累,从而推动癌症的发展。因此,了解导致特定突变的原因以及它们如何相互作用导致癌症的发生发展是了解、预防和应对肝癌的核心问题。由TP53基因编码的p53蛋白是一种肿瘤抑制转录因子,可作为防止多种癌症发生和寻找更多发展的基因守护者。TP53基因在大约一半的人类癌症病例中发生突变。p53突变调节许多细胞过程,包括增殖、迁移、侵袭、存活、代谢、化疗抗性等,以促进肿瘤进展。值得注意的是,已有研究表明TP53突变与HCC的免疫微环境密切相关。CD8~+T细胞是免疫微环境中主要的杀伤细胞,在肿瘤抗原持续刺激、免疫抑制细胞抑制以及理化状态失衡等多种因素的影响下,CD8~+T细胞会逐渐退化为增殖能力减弱、效应细胞因子水平下降、抑制性受体表达增高的功能失调状态,称为CD8~+T细胞耗竭。对于p53突变促进肿瘤恶性生物学行为的研究,大部分集中在肿瘤细胞依赖于自主信号来发挥作用,然而如今越来越多的研究强调了p53突变参与调节肿瘤细胞分泌组学从而促进癌症进展,那么p53突变型肝癌细胞是否可以通过外泌体影响CD8~+T细胞耗竭以及具体机制值得探索。因此本研究首先明确了p53 R249S突变型肝癌细胞是否促进了CD8~+T细胞耗竭,其次探讨了外泌体是否参与p53 R249S突变型肝癌细胞对CD8~+T细胞耗竭的促进作用,最后寻找p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进CD8~+T细胞耗竭可能的机制,为肝癌的发生发展机制的探索提供新思路。研究方法:13-MA核磁.实验材料:人肝癌细胞系Hep3B和PLC/PRF/5、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6、C57BL/6小鼠。2.实验方法:(1)细胞培养:培养人肝癌细胞系Hep3B、PLC/PRF/5以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6。(2)病毒转染:在Hep3B细胞系中转染p53 R249S突变,在PLC细胞系中转染shp53,在Hepa1-6细胞系中转染p53 R249S突变。(3)Western blot:用于检测病毒转染效率、验证外泌体纯度、肝癌细胞中外泌体释放相关蛋白(RAB35、RAB27A、RAB27B、RAB10、SNAP23、VAMP3)水平、肝癌细胞、外泌体以及CD8~+T细胞中SHP2水平。(4)细胞共培养实验:将病毒转染后的人肝癌细胞与CD8~+T细胞共培养,用于后续流式分析。(5)小鼠皮下成瘤实验:用于研究p53 R249S突变对小鼠肿瘤重量、体积和生长速度的影响。(6)免疫组化:用于研究p53 R249S突变对小鼠肿瘤中CD8~+T细胞数量的影响。(7)差异超速离心:用于提取外泌体。(8)NTA:用于检测外泌体粒径分布。(9)透射电镜:用于观察外泌体粒径和形态。(10)外泌体-细胞共培养:将肝癌细胞提取的外泌体与CD8~+T细胞共培养,用于后续流式分析。(11)小鼠皮下成瘤及鼠尾静脉注射外泌体实验:用于研究p53 R249S突变肝癌细胞来源外泌体对小鼠肿瘤重量的体积的影响。(12)流式细胞术:用于检测细胞共培养、外泌体-细胞共培养、瘤体组织和脾脏中CD8~+T细胞中Gzm B~+、Perforin~+、PD-1~+和Tim-3~+水平。(13)免疫荧光:用于检测CD8~+T细胞对外泌体的摄取情况。(14)Real time PCR:用于检测肝癌细胞中SHP2的m RNA水平。(15)统计学分析:使用软件SPSS 22.0完成统计,所有数据使用均数±标准差的形式进行展示,并且所有实验均完成3次独立重复实验。柱状图量化及折线图由Prism 9(Graph Pad Software)完成。通过t检验和one-way ANOVA确定统计显著性,当P<0.05时,认为该数据具备统计学差异。3.实验方案3.1明确p53 R249S突变型肝癌细胞促进CD8~+T细胞耗竭(1)评估CD8~+T细胞耗竭情况:流式细胞术检测CD8~+T细胞中Gzm B~+、Perforin~+、PD-1~+和Tim-3~+,其中Gzm B~+CD8~+T细胞和Perforin~+CD8~+T细胞百分比下降、PD-1~+CD8~+T细胞和Tim-3~+CD8~+T细胞百分比升高提示CD8~+T细胞耗竭。(2)构建p53 R249S突变型肝癌细胞系:慢病毒转染技术分别在Hep3B人肝癌细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53 R249S作为实验组;在PLC人肝癌细胞系中转染PLKO作为对照组,转染shp53即p53敲除作为实验组。在Hepa1-6小鼠肝癌细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53 R249S作为实验组。(3)细胞共培养体系构建:将上述构建的人肝癌细胞系(p53 R249S突变型肝癌细胞与p53空载的肝癌细胞相互对比)分别与CD8~+T细胞共培养。(4)动物实验:利用构建的Hepa1-6小鼠肝癌细胞分别注入C57BL/6小鼠皮下进行成瘤。记录肿瘤体积大小和重量,评估肝癌组织中CD8~+T细胞浸润水平以及小鼠肿瘤组织和脾脏中CD8~+T细胞耗竭情况。3.2探究p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进CD8~+T细胞耗竭(1)外泌体的提取与验证:使用差异超速离心法提取细胞上清外泌体,并通过透射电子显微镜、NTA、western blot对外泌体纯度进行鉴定。(2)外泌体与细胞共培养体系构建:将收集的p53不同状态肝癌细胞来源的外泌体与CD8~+T细胞共培养,流式细胞术检测CD8~+T细胞耗竭情况。(3)动物实验:小鼠皮下成瘤模型,鼠尾静脉注射p53不同状态肝癌细胞来源的外泌体,记录肿瘤体积大小和重量,流式细胞术检测肿瘤与脾脏CD8~+T细胞耗竭情况。3.3探讨p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进CD8~+T细胞耗竭的具体机制(1)外泌体释放量实验:以p53 R249S突变型肝癌细胞和p53空载肝癌细胞相互比较,western blot检测外泌体释放相关蛋白表达。收集肝癌细胞释放的外泌体,NTA检测外泌体大小、释放量的变化。综合判断p53 R249S突变能否影响肝癌细胞的外泌体释放。(2)CD8~+T细胞摄取外泌体实验:将Di D染料标记的外泌体与CD8~+T细胞共培养,免疫荧光验证CD8~+T细胞对外泌体的摄取。(3)探究外泌体中引起CD8~+T细胞耗竭的关键内容物:蛋白组学分析筛选差异蛋白。western blot和PCR验证肝癌细胞及其分泌的外泌体中SHP2水平。将外泌体与CD8~+T细胞共培养,western blot验证CD8~+T细胞中SHP2水平。实验结果:1.体内外实验证明了p53 R249S突变型肝癌细胞促进CD8~+T细胞耗竭。2.体内外实验证明了p53 R249S突变型肝癌细胞释放的外泌体促进了CD8~+T细胞耗竭。3.p53 R249S突变对肝癌细胞外泌体的释放量和释放相关蛋白无影响,并且CD8~+T细胞能neurogenetic diseases够摄取不同来源外泌体,p53 R249S突变肝癌细胞可以释放携带SHP2的外泌体递送到CD8~+T细胞并促进其耗竭。结论:1.p53 R249S突变型肝癌细胞能够促进CD8~+T细胞耗竭。2.p53 R249S突变型肝癌细胞来源的外泌体促进CD8~+T细胞的耗竭。3.p53 R249S突变肝癌细胞可以通过释放携带SHP2的外泌体递送至CD8~+T细胞进而促进CD8~+T细胞耗竭。