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基于整合药理学和实验验证探讨健脾除痰解毒方（Jianpi Chutan Jiedu Decoction，JCJD）干预肺癌的作用机制。采用中医药整合药理学研究平台（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP）V2.0，检索并获取健脾除痰解毒方靶标及功能信息，以及肺癌疾病靶标及功能信息，借助中医关联网络挖掘平台构建“疾病-方剂”关联网络，并通过网络拓扑特征计算、自定义多维关联网络可视化（方剂-中药材-核心靶标-通路-疾病）以及基因本体（GO）功能和依托Reactome数据库的Pathway信息进行富organ system pathology集分析，发现健脾除痰解毒方干预肺癌的关键网络靶标及其作用机制。最后通过动物实验进一步验证整合药理学结果。结果共获得健脾除痰解毒方干预肺癌的核心靶标53个；GO富集分析得到生物过程有20种条目，细胞组分有11种条目，分子功能有20种条目；Reactome Pathway富集分析得到11个条目，主要涉及呼吸电子传递、TP53FUT-175调节代谢基因、细胞内受体的SUMO化、白细胞介素（IL）-4和IL-13通路等信号通路。动物实验结果显示与模型组比较，联合组肿瘤组织中乳酸含量明显下降（P＜0.05），联合组可明显上调肿瘤组织中磷酸酯酶与张力蛋白同源物（PTEN）蛋白平均光密度值（P＜0.05），降低丙酮酸激酶M2（PKM2）和己糖激酶2（HK2）蛋白平均光密度值（P＜0.05）；与模型组比较，联合组可明显上调肿瘤组织中肿瘤抑制蛋白（P53）、PTEN mRNA及蛋白表达（P＜0.01，P＜0.05），降低肿瘤组织中TP53诱导的糖酵解与凋亡调控因GSK126 MW子（TIGAR）、葡萄糖转运蛋白1 （GLUT1）、PKM2、HK2 mRNA及蛋白表达（P＜0.01）。综上，健脾除痰解毒方通过TP53调节代谢基因来下调葡萄糖代谢，从而抑制肺癌增殖。

柑橘(Citrus sinensis,L.Osbeck)是一种风味独特,富含多种人体所需营养物质的水果,食用方式主要是鲜食。柑橘采摘后极易遭受真菌侵染造成巨大的经济损失。指状青霉(Penicillium digitatum,P.digitatum)导致的绿霉病是柑橘各类真菌病害中最主要的一种。柑橘绿霉病的防控以使用化学杀菌剂为主,但杀菌剂的使用不仅污染环境、存有安全性隐患,而且会使果实本身产生耐药性,影响病害防控效果。通过外源激发子诱导果实抗病性来提升果实抗病能力是一种绿色安全的病害防控方法。在果实上接种外源激发子后,多种信号分子和代谢途径发生变化,其中许多抗病关键基因积极调控抗病功能,其编码的酶也发挥重要的作用。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine aminolyase,PAL)是苯丙烷代谢第一步催化反应的关键限速酶,控制着该途径中的碳通量,与多种具有抗逆功能的次生代谢产物合成相关。已有研究发现果实上的PAL积极响应多种激发子的处理,与抗病过程密切相关。但是具体果实中PAL基因的鉴定及其参与调控果实采后病害的功能和相关机理的研究目前还很缺乏。因此,本研究对柑橘PAL基因家族成员进行了鉴定和生物信息学分析,探究了具体CsPALs对柑橘绿霉病的调控作用和CsPALs调控苯丙烷途径与初生代谢的相关机制。主要研究内容及研究结果如下:(1)从柑橘的全基因组中鉴定到了4个PAL基因家族成员,将其命名为CsPAL1-CsPAL4。通过理化性质、基因结构、蛋白结构、蛋白序列及系统进化关系分析发现:4个CsPALs的编码序列在2100 bp左右,蛋白约有720个氨基酸,分子大小约为7800 Da,都是更多酸性、具有亲水性的稳定蛋白;蛋白的三级结构都类似“海马状”;CsPALs基因和蛋白的结构十分保守,CsPALs蛋白序列中都含有完整的三联体酶活性中心,暗示它们都具有催化活性;CsPAL1、CsPAL2、CsPAL4与拟南芥中的At PALs相似度高。(2)在柑橘果实上接种盔形毕赤酵母(Pichia galeiformis,P.galeiformis)、壳寡糖(Oligochitosan,COS)和水杨酸(Salicylic acid,SA)都能够诱导果实的抗病性。通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)测定柑橘上4个CsPALs的表达量发现外源激发子处理果实后,4个CsPALs的表达量在不同的时间点显著上调,表明CsPALs积极响应抗病反应,可能具有调控绿霉病抗病性的功能。(3)亚细胞定位试验表明4个CsPALs蛋白都定位于细胞质中。分别在柑橘果实上瞬时过表达4个CsPALs并接种P.digitatum后,瞬时过表达CsPABioactive materialLs组柑橘果实的发病率和病斑直径显著低于对照组,其中CsPAL1和CsPAL3瞬时过表达诱导柑橘果实绿霉病抗病性的效果强于CsPAL2和CsPAL4。(4)对瞬时过表达CsPALs后的柑橘果实样品进行转录组测序。Gene Ontology(GO)注释发现四个过表达CsPALs组生物学过程(Biological process,BP)中注释到较多的都是细胞过程(Cellular process)、代谢过程(Metabolic process)和生物调节(Biological regulation)基因,在细胞组成(Cellular component,CC)中较多的都是细胞部分(Cell part)和膜部分(Membrane part)基因,在分子功能(Molecular function,MF)中较多的都是催化活性(Catalytic activity)基因。KEGG分析表明过表达CsPALs组果实中的苯丙烷代谢途径(Phenylpropanoid biosynthesis)都显著富集,其中与木质素合成相关基因儿茶酚-O-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)和肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因的表达水平显著下调,与类黄酮生物合成相关基因查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)基因的表达水平显著上调。另外,瞬时过表达组果实中糖代谢和莽草酸途径部分基因也都显著上调表达。(5)进一步通过实时荧光定量PCR、气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和氨基酸自动分析仪等方式测定了各组果实中的相关基因表达量,糖、酸和氨基酸等物质含量。结果发现,CsPALs在柑橘果实上瞬时过表达后,苯丙烷代谢上游的肉桂酸-4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)活性显著增强,木质素合成相关基因(COMT和CAD)表达水平和木质素含量下降。相反,黄酮类合成相关基因CHS和查尔酮异构酶(Chalcone isomerase genes,CHI)基因的表达水平和类黄酮、总酚含量上升。蔗糖的合成和分解代谢、葡萄糖代谢被激活,途径中重要的基因表达量和酶活性增强,各种糖和酸的含量发生不同程度的变化。莽草酸途径中重要基因更多也显著上调表达,促进了各类游离氨基酸的积累。综上所述,本研究从柑橘基因组中鉴定到了4个CsPALs,成员之间较为保守,都积极响应外源激发子的处理,且具有提高柑橘果实绿霉病抗病性的功能,具体的调控机制包括:促进苯丙烷代谢途径中类黄酮和总酚的合成而并非木质素的合成;激活蔗糖和葡萄糖代谢途径,不同程度改变糖和酸的含量;激活莽草酸途径,促使各类游离氨基酸积累。本研究从分子生物学角度开展了CsPALs基因功能的研究,丰富了非模式植物上PAL参与调控抗病性的分子机制,为外源处理提高柑橘抗病性提供了科学依据,也为从新角度解决柑橘采后病害问题奠定了理论基础。

近年来,国家对人民的身心健康问题愈加重视。掌malaria vaccine immunity握青藏高原地区主要疾病的发展趋势和影响趋势对提高该地区的健康水平具有重要作用。因此有关该领域相关材料的翻译实践有极其重要的现实意义。本翻译实践活动以科技类文本《青藏高原主要疾病变化趋势及影响因素分析》的英译为实践对象,并基于彼得·纽马克的文本类型理论,探讨科技类文本在翻译实践中的困难及应对困难所采取的翻译方法和技巧。源文Z-VAD-FMK说明书本根据实地考察和实验数据向大众介绍了青藏高原传染病和地方病的现状、流行趋势以及影响因素,最终提出了解决建议。根据文本类型理论,该文本属于以信息型文本。在翻译时,译者不仅要确保信息的真实性和准确性,还要将译文的可读性考虑在内。因此,译者使用了交际翻译和语义翻译两种翻译方法,并从词法和句法两个层面探讨了该类文本的翻译技巧。在词法层面,译者主要关注原文的语言风格和句子形式,主要运用了词性转换、增译、省译和加注的翻译技巧;在句法层面,译者采用了分译、语态转换和移位的翻译技巧,实现句子的流畅通顺。最后总结了翻译实践中遇到的问题、不足以及今后工作学习中需要完善的知识及翻译手段和方法。通过本翻译实践,译者增进了对文本类型理论的理解,同时对交际翻译和语义翻译如何指Staurosporine研究购买导实践有了更深的认知。此外,本翻译实践的完成还增加了译者对青藏高原疾病的了解,也希望本翻译实践给该领域的文本翻译提供一些参考。

目的 探讨前列舒通胶囊辅助治疗瘀阻型前列腺增生症的临床效果。方法 选取2018年6月—2021年6月肇庆市高要区中医院收治的瘀阻型前列腺增生患者86例作为研究对象，按随机数字表法分为对照组与研究组，每组43例。对照组予以非那雄胺治疗，研究组在对照组治疗基础上加用前列舒通胶囊，比较2组的治疗总有效率、临床症状改善情况以及相关指标变化情况。结果 研究组的治疗总有效率为90.70%，显著高于对照组的hepatic impairment72.09%(P<0.05)；治疗后，2组患者尿频、尿急、尿等待、排尿不尽等临床症状评分均有所下降，且研究组的评分低于对照组（P<0.05）；与治疗前比较，治疗后2组患者的国际前列腺症状selleckchem CH-223191评分（IPSS评分）、前列腺体积（PV）、膀胱残余尿量（Rv）均明显降低，最大尿流率（Qmax）明显提高，且研究组的指标改善程度优于对照组（P<0.05）。结论 对于瘀阻型前列腺增生症，患者采用前列舒通胶囊更多治疗可有效提高疗效，改善临床症状与前列腺情况，提高最大尿流率，值得推广。

目的 探讨肝脏局灶性结节增生（FNH）的磁共振成像（MRI）可能误诊原因并进行病理对照分析，以加深认识。方法 回顾性分析2015年1月至2023年1月期间浙江省丽水中心医院经病理证实的21例FNH患者资料，2名评估者在不知晓病理结果的情况下共同评估病灶的MRI征象（包括病灶一般情况、平扫信号、增强扫描强化表现及周围组织伴随征象）并做出诊断，对评估结论达成一致意见；以病理结果为金标准，对selleckchem误诊病例进行病理对照及误诊原因分析Pathology clinical。结果 21例肝脏FNH中的13例患者共13个病灶被误诊，其中被误诊为肝细胞癌4例，肿块型肝内胆管细胞癌1例，转移瘤1例，孤立性纤维瘤3例，上皮样血管平滑肌脂3-MA molecular weight肪瘤2例，肝细胞腺瘤2例。病理对照分析：2例MRI上见“假包膜征”的病灶在镜下无明显假包膜；而3例镜下存在假包膜的病灶却未能识别出MRI“假包膜征”。3例MRI上见“局部坏死”，但本组13例镜下均无局部缺血坏死表现。2例MRI上被评估为存在“脂肪变性征”的病灶在镜下均存在较明显的脂肪细胞积聚；MRI上无“脂肪变性征”者在镜下也无明显脂肪变性。11例病灶在镜下可见瘢痕，但在MRI中13例病灶均未能识别“延迟强化瘢痕”。结论 肝脏FNH的误诊原因主要有：中央瘢痕缺失或瘢痕的形态/信号/强化不典型、病灶出现肝细胞癌征象“脂肪变性”、误判存在肝细胞癌征象“假包膜征”；此外，病灶外生性生长与肝外其他脏器紧贴、“评估者受临床病史的影响”可能也会导致误诊。

目的：比较经尿道等离子前列腺剜除术（PKEP）和经尿道等离子前列腺切除术（PKRP） 2种术式治疗良性前列腺增生（BPH）的临床疗效，为BPH的治疗方式选择提供依据。方法：收集60例因下尿路症状（LUTS）就诊且门诊初诊为BPH的患者的临床资料，在患者知情同意的情况下将患者随机分为PKEP组（采用PKEP进行治疗）和PKRP组（采用PKRP进行治疗），每组各30例。观察2组患者术前年龄、体质量、体质量指数（BMI）、总前列腺特异抗原（tPSA）水平、红细胞比容（HCT）、血红蛋白（Hb）水平、术前和术后钠离子水平、前列腺体积、中叶Trichostatin A使用方法突入程度、并发症（高血压、糖尿病和呼吸系统疾病）发生率和口服5α还原酶抑制剂百分率，手术时间、术中出血量、切除组织体积、切除速率、切除效率，术后总住院时间、留置尿管时间、膀胱冲洗时间、术前和术后生活质量（QOL）评分及国际前列腺症状评分（IPSS），并比较2组患者术后不良反应发生情况。结果：2组患者术前年龄、体质量、BMI、tPSA水平、术前HCT、术前Hb水平、术前钠离子水平、前列腺体积和中叶突入程度比较差异无统计学意义（P>0.05）;2组患者并发症（高血压、糖尿病和呼吸系统疾病）发生率和口服5α还原酶抑制剂百分率比较差异无统计学意义（P>0.05）;PKRP组患者术中出血量、切除组织体积、切除速率和切除效率高于PKRP组（P<0.05）;2组患者总住院时间、术后留置尿管时间和术后膀胱冲洗时间比较差异无统计学意义（P>0.05）;2组患者术前和术后钠离子水平、QOL评分和IPSS评分比较差异无统计学意义（P>0.寻找更多05）;2cutaneous immunotherapy组患者术前和术后各自组内QOL评分及IPSS评分比较差异有统计学意义（P<0.05）;PKEP组患者出现尿失禁1例，PKRP组患者出现尿失禁2例，未出现其他手术相关并发症。结论：2种术式疗效和安全性相似，均可获得满意的手术效果；PKEP术中患者出血量较少，腺体切除量、切除效率和切除速率较高，是治疗BPH的较好方法。

目的 回顾性分析附加侧板联合自体单采富血小板血浆（PRP）与更换髓内钉改行钢板固定治疗股骨骨折髓内固定后骨不连的临床疗效。方法 选取2019年6月—2022年6月本院骨科收治的股骨骨折髓内钉固定后骨不连患者30名，其中男26例，女4例；年龄20～58岁，平均为（36.8±7.1）岁。实验组13例患者保留髓内钉，骨折端附加侧板固定，术中自体髂骨混合PRP植于骨缺损部位，术后14d、28d于骨不连部位注射自体PRP 10mL/（人）次。对照组17例患者取出髓内钉selleck，改行锁定加压钢板固定，术中自体髂骨植骨。随访观察比较2组患者围手术期情况和骨折临床愈合情况。结果 30例患者均获得完整随访，随访时间12～33个月，平均（15.2±3.5）个月；两组手术时间（min）、术中出血量（mL）、术后引流量（mL）分别为drugs: infectious diseases95.7±47.2 vs.167.6±71.5、292.3±147.2 vs.686.9±238.9、102.8±67.5 vs.166.2±87.3，均有统计学差异（P <0.05），住院时间（d）为10.3±5.2 vs.12.5±6.8，无统计学差异（P>0.05）；骨折临床愈合时间（月）为5.36±1.27 vs.7.63±1.57(P <0.05)；术后6、9个月时愈合率分别为92.3%(12/13) vs.52.9%(9/17)(P <0.05),100%(13/13) vs.82.4%(14/17)(P>0.05)。结论 附加侧板联合术中及术后使用自体单采PRP治疗股骨骨折髓内selleck产品固定后骨不连操作简便、术程短、出血少，且愈合快，是可供临床选择的理想治疗方案。

目的 探讨circROBO1对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响及其机制。方法 体外传代培养视网膜母细胞瘤细胞Y79。取传2代、对数生长期、生长状态良好的Y79细胞，随机分为si-circROBO1组、si-controlParasitic infection组，分别转染si-circROBO1、si-control。转染6 h，继续培养24 h，收集细胞，采用RT-qPCR法检测circROBO1表达，采用CCK-8法检测细胞活力，采用细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力。通过CircInteractome在线网站预测circROBO1与miR-217的结合位点，并采用双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀实验验证两者的靶向调控关系。结果 si-cVP-16说明书ircROBO1组circROBO1相对表达量显著低于si-control组（P<0.05）。si-circROBO1组细胞活力、克隆形成率均显著低于si-control组（P均<0.05）。经CircInteractome在线网站预测，circROBO1序列中可能存在两个与miR-217结合的位点。经双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀实验验证，共转染野生型circROBO1和miR-217可降低Y79细胞荧光素酶活性，并且miR-217主要富集在野生型circROBO1 MS2bs载体转染的Y79细胞中。结论 circROBO1确认细节可能通过靶向调控miR-217促进视网膜母细胞瘤细胞增殖。

对注浆粘结锚杆各种荷载试验的位移稳定判定方法研究表明：(1)锚固体与地层界面蠕变遵循蠕变机理，判断锚头位移稳定本tumour biology质上就是判定界面蠕变是否稳定；(2)荷载较小时界面发生稳定蠕变，超过临界荷载后发生蠕变破坏，完整破坏过程可分为初始、持续及加速三个阶段，判稳不能采用初始阶段数据、应主要依据持续阶段的蠕变特性；(3)蠕变破坏形式约2/3锚杆为突变型，1/3为缓变型，对应着3类蠕变曲线形态；(4)用于判稳的位移阈值不应小于0.1mm，单元时长不应短于10min，位移增量不能直接用于判稳；(5)判稳应定性判断蠕变速率总体上在减速，应确定定量指标使速率维持在较低水平从而使位移收敛；(6)主要应依据具有位移与时间双重属性的参数判稳，单元时长位MK-1775细胞培养移增量的判稳准确度较高，而蠕变率2.0mm任何情GSK126况下都适用；(7)以蠕变率2.0mm为内在原则的推荐判稳方法，适用于各种应用场合及各种类型的注浆粘结锚杆，适用于各种荷载试验及快速法等试验加卸载方法。

背景和目的:根据国际糖尿病联合会(IDF)统计,约有4.63亿成年人患糖尿病,预计到2045年,全球糖尿病总人数将达到7亿~([1])。因此,进一步开发糖尿病防治靶点显得尤为重要。Ⅰ型糖尿病是由T细胞介导的胰岛β细胞破坏,导致胰岛素绝对缺乏所致的自身免疫性疾病。II型糖尿病是由遗传因素和不良代谢环境导致的进行性胰岛β细胞损伤。目前,移植供体严重短缺和免疫排斥反应等是糖尿病临床治疗面临的瓶颈问题。为了解决上述问题,人们从干细胞治疗、免疫治疗、体外生成胰岛素样细胞治疗和纳米材料治疗等多方面进行了探索,以期寻找到有效的胰岛β细胞替代方案。比如:移植大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化产生的胰岛素样细胞(insulin-producing cells,IPCs)在改善血糖和恢复残存胰岛细胞功能方面显示出一定的效果,表明移植干细胞来源IPCs对于糖尿病的治疗具有较好的应用前景。为了获得具有免疫抑制功能且稳定表达胰岛素的IPCs,克服糖尿病免疫介导的胰岛细胞破坏,人们尝试了多种免疫抑制疗法,但均未取得理想的治疗效果。而静电纺丝纤维作为纳米级支架能够有效的模拟细胞外基质环境,为细胞的粘附、生长和分化提供必要载体。课题组前期工作发现负载Zn T8_((107-115))和HLA-A2多肽二聚体的聚多巴胺改性明胶聚乳酸静电纺丝纤维复合材料(PLLA/G-p DA-p MHC)能通过释放二聚体诱导免疫耐受和促进干细胞分化,为细胞的生长构造独立的排列空间,在诱导细胞表型转换和增加细胞数量方面具有显著优势。PLLA/G-p DA-p MHC被认为可能通过调节免疫和促进干细胞分化实现双重功能。目前研究表明,糖尿病高糖(high glucose,HG)环境中IPCs细胞存活率低成为阻碍其发展的重大挑战。移植后细胞死亡可能是限制IPCs移植治疗效果的主要因素。虽然,已有实验认为IPCs移植后发生的细胞凋亡可能与IPCs治疗失败有关,但利用特异性凋亡抑制剂等措施并未见完全改善移植后的细胞死亡现象,提示可能还存在着其他形式的程序性细胞死亡。我们查阅相关文献发现一种新形式调节性细胞死亡机制,铁死亡可能是HG环境诱导胰岛β细胞死亡的主要途径之一,在糖尿病及相关并发症中发挥着重要作用。虽然,有研究发现铁死亡在糖尿病胰岛β细胞死亡过程中发挥重要调控作用,但关于铁死亡对移植后IPCs损伤的调控作用及机制却鲜有报道。鉴于铁死亡机制的复杂性,需要利用生物信息学方法更为全面的分析铁死亡相关信号通路与移植后IPCs损伤的关系。在生理水平上,细胞内可变铁池稳态在细胞代谢、增殖和死亡过程中发挥至关重要的调控作用。由于可变铁池内的铁离子催化活性不受限制,其浓度的增加所引发的氧化作用能够直接损伤DNA、蛋白质和脂质,进而导致细胞死亡。研究认为NCOA4介导的铁蛋白自噬是细胞维持可变铁池稳态的重要途径,NCOA4在细胞可变铁池浓度过低的情况下可与铁蛋白结合,并递送至自噬溶酶体降解以向胞浆释放铁离子;而当细胞中可变铁池水平过高时,NCOA4选择性的与HERC2结合被泛素化及降解,从而降低铁蛋白自噬的活性。提示从NCOA4入手有望为阐明HG环境中铁蛋白自噬介导的可变铁池失衡诱导干细胞来源IPCs的死亡机制提供新思路。综上,本研究以PLLA/G-p DA-p MHC支架为基础构建BMSCs向IPCs分化的培养体系,获得具有免疫抑制功能且稳定分泌和表达胰岛素的IPMedical errorCs,进一步通过HG培养液模拟糖尿病高血糖环境,结合生物信息学分析方法,阐明HG环境诱导IPCs的损伤机制,旨在为降低干细胞来源IPCs移植后的细胞死亡率,提高IPCs细胞治疗效果提供新靶点。研究方法:1.IPCs细胞分化体系的构建(1)为了构建具有免疫耐受功能的IPCs细胞分化体系,对PLLA/G-p DA-p MHC支架进行改性和理化性质测试:FTIR测定化学组成、结构及形貌、接触角测量仪及含水量分析检测亲水性;利用ELISpot检测分化体系对CD8~+T细胞IFN-γ分泌能力的影响;CCK-8实验检测淋巴细胞增殖能力变化;LDH释放实验检测淋巴细胞对靶细胞的特异性杀伤效应。(2)为了获得具有免疫抑制功能且稳定分泌和表达胰岛素的IPCs,分离提取大鼠BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面标志分子表达;扫描电子显微镜观察BMSCs在PLLA/G-p DA-p MHC支架上的生长状态;以PLLA/G-p DA-p MHC支架为基础构建BMSCs向IPCs分化的培养体系,利用Western blot和q PCR实验检测IPCs细胞Pdx-1、Glut-2、Insulin、Pax-4的m RNA和INSULIN蛋白表达水平变化;ELISA法检测胰岛素分泌情况。2.HG诱导IPCs铁死亡机制的研究(1)利用生物学信息方法对GEO数据库中移植前与移植后60-120天胰岛细胞的基因表达进行对比分析;对差异表达基因进行KEGG信号通路富寻找更多集分析;通过蛋白质-蛋白质相互作用及基因相关性分析铁死亡相关信号通路差异表达基因之间的相互作用关系及相关性系数,初步确定铁死亡与移植后胰岛细胞损伤的相关性。(2)为了确定铁死亡是HG环境下IPCs细胞死亡的主要途径,采用含25m M葡萄糖培养液培养IPCs,模拟体内高血糖环境;采用铁死亡抑制剂(Ferrostatin1,Fer-1)、坏死性凋亡抑制剂(Necrostatin1,Nec-1)、凋亡抑制剂(Z-VAD)对IPCs进行预处理,CCK-8方法检测细胞活力变化。(3)为了明确HG环境通过上调可变铁池浓度诱导IPCs铁死亡,采用铁离子螯合剂去铁胺(deferoxamine,DFO)预处理IPCs;利用CCK-8法检测细胞活力变化;流式细胞术检测IPCs细胞脂质过氧化水平;流式细胞仪检测细胞内可变铁池浓度变化;q PCR和Western blot检测铁死亡标志分子GPX4和XCT的m RNA水平和蛋白水平变化;MDA检测试剂盒检测细胞MDA水平变化。(4)为了阐明HG环境通过上调细胞铁蛋白自噬水平提高IPCs可变铁池浓度,采用自噬抑制剂(chloroquine,CQ)预处理IPCs,流式细胞仪检测细胞内可变铁池浓度变化;Western blot检测铁死亡和自噬标志分子LC3、p62、TFRC和Ferritin的蛋白表达水平变化;MDA检测试剂盒检测细胞内MDA水平变化。(5)为了进一步明确HG环境通过NCOA4介导的铁蛋白自噬提高可变铁池浓度,采用sh RNA和过表达质粒在IPCs中敲低NCOA4和过表达NCOA4,Western blot检测NCOA4的敲低和过表达效率,以及在HG环境下敲低和过表达NCOA4对Ferritin蛋白表达的影响;通过流式细胞仪检测可变铁池浓度变化和脂质过氧化水平变化。(6)为了确定HG环境下NCOA4对IPCs胰岛素合成和分泌的影响,在敲低和过表达NCOA4的前提下,Western blot检测HG环境下胰岛素蛋白表达水平,并通过ELISA法检测培养上清中胰岛素分泌水平变化。实验结果:1.FTIR结果显示Zn T8_((107-115))/HLA-A2多肽二聚体被负载于PLLA/G-p DA支架,表明PLLA/G-p DA-p MHC构建成功,且具有更高效的亲水性。免疫学检测发现PLLA/G-p DA-p MHC支架能够显著抑制CD8~+T细胞IFN-γ的分泌、淋巴细胞增殖以及淋巴细胞对靶细胞的杀伤效应。表明成功构建具有免疫抑制功能的PLLA/G-p DA-p MHC支架材料。2.流式细胞检测显示分离培养的BMSCs中CD29、CD44、CD90和CD105表达阳性,而CD34和CD45表达阴性,表明分离纯化BMSCs具有正常的表面特异性标记;扫描电子显微镜观察和CCK-8活力分析发现PLLA/G-p DA-p MHC支架具有更好的生物相容性;q PCR结果显示PLLA/G-p DA-p MHC支架构建的分化体系能够促进IPCs中Pax-4、Pdx-1、Glut-2和Insulin m RNA表达,同时促进INSULIN蛋白表达;与对照组IPCs比较,PLLA/G-p DA-p MHC支架能够更显著的促进IPCs分泌胰岛素。表明PLLA/G-p DA-p MHC支架能够更有效的促进BMSCs向IPCs分化。3.KEGG信号通路富集分析发现移植前后胰岛细胞差异表达基因主要富集在铁死亡、谷胱甘肽代谢、自噬等信号通路;PPI和相关性分析发现上述通路差异表达基因存在显著的相互作用及相关性,尤其NCOA4与自噬相关基因Atg7、Ulk2、gd、Nfe2l2等具有显著的相关性。初步表明铁死亡可能在移植后胰岛细胞损伤过程中发挥重要的调控作用。4.流式细胞术检测发现,HG处理的IPCs细胞内可变铁池浓度和脂质过氧化水平呈时间依赖性显著增加;q PCR和Western blot结果表明HG处理后的IPCs细胞铁死亡标志分子GPX4和XCT在转录和蛋白水平表达均下调;细胞内MDA水平显著升高;铁离子螯合剂(DFO)能够显著逆转上述现象;与其他处理组比较,铁死亡抑制剂(Fer-1)预处理能够有效降低HG环境对IPCs的损伤作用。进一步明确铁死亡是HG环境诱导IPCs损伤的主要途径。5.Western blot结果显示HG处理后IPCs内TFRC和p62的蛋白表达水平呈时间依赖性降低,而Ferritin和LC3蛋白表达水平呈时间依赖性升高;自噬抑制剂氯喹(CQ)能够逆转HG介导的TFRC蛋白表达下调和Ferritin蛋白表达的上调;流式细胞仪检测结果和MDA检测结果发现CQ能够逆转HG诱导的可变铁池浓度和MDA水平的升高。表明HG处理是通过激活铁蛋白自噬诱导IPCs铁死亡。6.Western blot结果显示HG处理后NCOA4蛋白表达水平显著升高,敲低或过表达NCOA4能够抑制或促进HG介导的Ferritin蛋白降解;同时,敲低NCOA4增强HG诱导的脂质过氧化水平升高。表明NCOA4是HG环境下调控IPCs铁蛋白自噬的关键分子。7.Western blot和ELISA检测结果显示敲低NCOA4能够逆转HG环境介导的胰岛素合成和分泌的降低,而过表达NCOA4加重胰岛素合成和分泌的降低;同时,抑制铁死亡能够恢复IPCs胰岛素的分泌;q PCR检测发现敲低NCOA4或过表达NCOA4能够抑制或促进HG诱导的Pdx-1 m RNA水平的降低。表明NCOA4通过调控铁蛋白自噬影响HG环境下IPCs的成熟。结论:1.利用PLLA/G-p DA-p MHC支架促进了BMSCs分化成为具有免疫抑制功能且稳定表达和分泌胰岛素的IPCs。2购买Crizotinib.铁死亡是调控HG环境中IPCs细胞存活率下降的主要途径。3.NCOA4介导的铁蛋白自噬参与调控了HG环境诱导的IPCs铁死亡过程。4.抑制NCOA4通路有望成为预防IPCs细胞损伤、防治糖尿病的重要靶点。