研究背景及目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球第三大最常见的癌症,中国结直肠癌的发病率和死亡率呈上升趋势,目前结直肠癌的发病率居我国常见恶性肿瘤的第三位,死亡率位居第五位。结直肠癌发病机制复杂,并且具有高度异质性,早期结直肠癌无特异性症状,多数患者发现时已经是中晚期。目前针对结直肠癌首选以外科手术切除为主的综合治Entinostat供应商疗,其中靶向治疗是重要的辅助手段。但靶向药物的效果并不尽人意,患者中位生存期并未有效延长。因此,探寻结直肠癌发生发展的分子机制,寻找更为有效的分子靶点,将有助于开发新的靶向治疗药物。p53基因是人类肿瘤中最常见的突变基因之一,参与多种细胞生物学行为,其在细胞周期调控和细胞凋亡中的作用已得到广泛的证实。研究表明,p53可以引起一些基因如p21的激活,而这些级联反应的下游效应与诱导细胞周期停滞或凋亡有关。DNA损伤广泛存在于细胞的生长、分裂和增殖过程中,经常由各种内外因素损伤导致,如电离辐射、紫外线等物理因素,烷化剂、亚硝胺盐等化学因素,病毒感染等生物因素。细胞对DNA损伤的反应有两种方式,即DNA损伤修复与DNA损伤诱导的细胞自噬和凋亡。如果修复功能有缺陷,DNA损伤就可能造成两种结果:一是细胞死亡;二是发生基因突变,或进而恶性转化为肿瘤细胞。p53 和 DNA 损伤调节基因 1(p53 and DNA damage-regulated gene 1,PDRG1)是最新发现的癌基因,能编码133个氨基酸的小蛋白,且与数据库中的任何已知蛋白质都没有相似性。研究表明,PDRG1在多种人类肿瘤中异常高表达,如肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌和子宫癌等。其可影响多种细胞生命活动,包括促进细胞增殖转移、抑制细胞凋亡、阻滞细胞周期等,从而参与多种肿瘤的发生发展。因此,PDRG1被认为是这些肿瘤的潜在生物标志物。然而,PDRG1对结直肠癌细胞生物学行为的影响及机制尚不明确。因此,探讨PDRG1在结直肠癌增殖和转移过程中的作用和分子机制,对于结直肠癌的生物标志物筛选、分子诊断和靶向治疗将具有重要意义。本研究分为三个部分:(1)应用生物信息学分析和免疫组织化学实验检测PDRG1在结直肠癌组织中的表达水平。同时结合临床病理资料和生存数据信息,探究PDRG1与结直肠癌患者临床病理特征及患者生存的相关性。(2)通过免疫印迹实验检测PDRG1在人正常结直肠上皮细胞系和各种结直肠癌细胞系中的蛋白水平。在结直肠癌细胞SW620和HT29中构建稳定沉默PDRG1的慢病毒细胞系,利用CCK-8、集落形成、transwell、划痕、流式等实验检测沉默PDRG1对结直肠癌细胞增殖、转移、凋亡和周期的影响。(3)利用生物信息学分析筛选PDRG1的下游信号通路,通过免疫印迹实验探究其分子机制。随后通过回复实验进一步确认。构建裸鼠荷瘤模型及肺转移模型,检测PDRG1体内对结直肠癌生长和转移以及动物生存的影响。第一部分 PDRG1在结直肠癌组织中的表达及临床意义研究目的检测PDRG1在结直肠癌组织中的表达水平及其与结直肠癌患者临床病理特征及患者生存的相关性。研究方法利用GEPIA和TCGA数据库分析结直肠癌组织和正常结直肠组织中PDRG1的mRNA水平。利用TCGA数据库分析PDRG1与结直肠癌临床病理分期和患者生存的相关性。收集2015年1月至2015年12月在徐州医科大学附属医院接受了结直肠癌根治性手术患者的结直肠癌组织和与其配对的癌旁正常组织制备组织芯片,标本具有完整临床信息,包括性别、年龄、肿瘤分化、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况、pTNM分期等临床病理参数,以及婚姻、居住地和手术日期等。免疫组化检测结直肠癌组织和对应癌旁正常组织中PDRG1的蛋白水平,并分析其与患者临床病理特征及生存的相关性。利用TCGA数据库分析直肠癌中PDRG1表达与免疫细胞浸润的关系。研究结果生物信息学分析显示PDRG1在结肠癌组织中mRNA水平明显增高,且与临床病理分期(P=0.003)和患者生存(P=0.011)相关。结直肠癌组织芯片结合患者临床病理特征结果显示:PDRG1蛋白在结直肠癌患者组织中高表达,与患者肿瘤大小(P<0.05)、TNM分期(P<0.01)、远处转移(P=0.039)及肿瘤浸润深度(P=0.015)呈正相关,与患者总生存(P<0.001)和无病生存(P<0.05)均相关。PDRG1与结直肠癌免疫细胞浸润相关。研究结论我们的研究发现PDRG1在结直肠癌中高表达,且与临床病理分期和患者生存相关,表明PDRG1在该肿瘤中可能发挥癌基因的作用。进一步研究PDRG1在结直肠癌患者中的可能临床意义,发现PDRG1的表达水平与患者肿瘤大小、TNM分期、远处转移、肿瘤浸润深度、总生存和无病生存均相关。由此说明,PDRG1可能作为一种潜在的生物标志物,参与并促进结直肠癌的发生发展。第二部分 PDRG1对结直肠癌细胞生物学行为的影响研究目的检测沉默PDRG1对结直肠癌细胞增殖、转移、凋亡和周期等细胞生物学行为的影响。研究方法1、通过免疫印迹实验检测PDRG1在人正常结直肠上皮细胞系和结直肠癌细胞系中的蛋白水平。2、利用慢病毒构建稳定沉默PDRG1的结直肠癌细胞系。3、利用CCK-8和集落形成实验检测沉默PDRG1对结直肠癌细胞增殖的影响。4、利用transwell和划痕实验检测沉默PDRG1对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响。5、利用流式细胞实验检测沉默PDRG1对结直肠癌细胞凋亡和周期的影响。研究结果1、PDRG1 在结直肠癌细胞 SW480、SW620、HT29、HCT116、DLD1 和 LoVo 中蛋白水平明显高于正常结直肠上皮细胞FHC,且SW620和HT29细胞中PDRG1蛋白表达最高。2、通过shPDRG1可明显降低结直肠癌细胞SW620和HT29中PDRG1的表达水平。3、沉默PDRG1可明显抑制结直肠癌细胞SW620和HT29的增殖能力。4、沉默PDRG1可显著抑制结直肠癌细胞SW620和HT29的侵袭和迁移能力。5、沉默PDRG1可诱导结直肠癌细胞SW620和HT29的凋亡和G1/S期细General Equipment胞周期阻滞。研究结论1、PDRG1在结直肠癌细胞中蛋白水平明显高于正常结直肠上皮细胞。2、PDRG1在结直肠癌细胞中作为一个癌基因,沉默PDRG1可以抑制细胞增殖和迁移、诱导细胞凋亡和G1/S期细胞周期阻滞。第三部分 PDRG1调控结直肠癌生长和转移的分子机制研究研究目的检测PDRG1调节结直肠癌细胞增殖、转移、凋亡和周期等细胞生物学行为的分子机制。研究方法1、通过生物信息学分析对PDRG1进行富集,筛选其可能调控的下游信号通路。2、利用免疫印迹实验检测沉默PDRG1后结直肠癌细胞中凋亡和周期相关蛋白的表达水平。3、利用荧光素酶报告基因、染色质免疫沉淀实验检测PDRG1对p21的调控机制。4、在沉默PDRG1的结直肠癌细胞中进一KD025使用方法步敲减p21,利用免疫印迹、CCK-8和transwell实验检测PDRG1调节结直肠癌细胞增殖和转移是否与细胞周期有关。5、构建裸鼠荷瘤模型,分析沉默PDRG1对体内肿瘤生长的影响。6、构建裸鼠肺转移模型,分析沉默PDRG1对结直肠癌细胞肺转移和荷瘤小鼠生存的影响。研究结果1、PDRG1主要富集到周期和凋亡相关信号通路。2、沉默PDRG1可明显促进凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 7和cleaved-caspase 9 的蛋白表达,并抑制周期相关蛋白 cyclin B1、cyclin E2、cyclin D1、CDK2的蛋白表达,同时促进p21的蛋白表达,但对p27无明显调控。3、PDRG1可以结合p21启动子抑制其转录。4、敲减p21可以明显恢复沉默PDRG1减弱的结直肠癌细胞增殖和转移能力。5、沉默PDRG1可显著抑制小鼠体内肿瘤的生长。6、沉默PDRG1可抑制小鼠体内结直肠癌细胞的肺转移,并延长荷瘤小鼠的生存期。研究结论1、PDRG1可通过抑制p21转录调控结直肠癌细胞的生长和转移。2、敲低PDRG1在体内可抑制肿瘤的生长及转移。