１．１ 材料
１．１．１ 动物 雄性ＳＰＦ 级ＳＤ 大鼠（７～８ 周龄，体质量（２４０±２０）ｇ），购自北京唯尚立德生物科技有限公司，生产许可证号为 ＳＣＸＫ（京）２０１８－００４４，动物质量合格证号为 ＺＳ－２０２０－０６１７，大鼠饲养于通风良好的实验室普通清洁环境（温度２２～２５ ℃，相对湿度５０％ ～ ７０％），所有大鼠均可自由获得食物和水，适应性饲养 １周。本研究经北京朝阳急诊抢救中心伦理委员会批准。
１．１．２ 主要药品、试剂及仪器 夏枯草黄酮（原料药，纯度为９９．９５％，批号为 Ｃ１０７８－１９）购自陕西天瑞生物技术有限公司，将夏枯草黄酮和生理盐水配制成浓度为６．１２５，１２．２５０，２４．５００ ｍｇ／ｋｇ 的混悬液；ＲｈｏＡ 通路抑制剂（Ｙ－２７６BMN 673３２）（批号为Ｓ１５４１）购自美国 Ｓｅｌｌｅｃｋ
公司；大鼠肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）（批号为 ＳＹＩＮ－ ０２７８６）、白细胞介素－１β（ＩＬ－１β）（批号为 ＳＹＩＮ－０２１８７）酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）试剂盒购自上海双赢生物科技有限公司；苏 木精－伊 红 （ＨＥ）染 色试剂盒 （批 号为Ｃ０１０５Ｍ）、一步法原位末端标记（ＴＵＮＥＬ）细胞凋亡检测试剂盒（批号为 Ｃ１０８６）、４′，６－二脒基－２－苯基吲哚
（ＤＡＰＩ）染色液（批号为 Ｃ９５１７３）购自上海碧云天生物技术有限公司；兔 抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－３
（Ｃａｓｐａｓｅ－３）（批 号 为 ａｂ１８４７８７）、ＲｈｏＡ （批 号 为 ａｂ１８９４９４）、ＲＯＣＫ（批号为ａｂ２１０４９８）、甘油醛－３－磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）（批号为ａｂ２０１７９６）单克隆抗体、山羊抗兔二抗（批号为ａｂ１５００７７）购自英国ａｂｃａｍ 公司；电子压痛仪（型号为 ＹＬＳ－３Ｅ）购自天津诺雷信达科技有限公司；足底热测痛仪（型号为 ＢＷ－Ｐｌａｎｔａｒ３９０）购自美国ＩＩＴＣ 公司；酶标仪（型号为 ＨＢＳ－１０９６Ａ）购自深圳市良谊实验室仪器有限公司；荧光显微镜（型号为ＤＭ２５００）购自德国 ＬＥＩＣＡ 公司；凝胶成像系统（型号为 Ｇｅｌ－Ｄｏｃ）购自美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司。
１．２ 方法
１．２．１ 模型构建 参照文献［７］的方法进行造模，随机选取６０只大鼠，３％戊巴比妥钠腹部麻醉，仰卧位固定，无菌条件下，眼科剪沿右后膝关节前侧纵向切开皮 肤组织，暴露关节腔，切断前交叉副韧带、内侧副韧带， 摘除内侧半月板，操作过程中避免软骨损伤。另取１２只大鼠仅剪开皮肤暴露关节腔，作为假手术组。手术完成后，消毒并对关节囊和皮肤进行缝合，之后放于笼中，自由活动。术后每只大鼠肌内注射４０万单位青霉素，１ 次／ｄ，连 续 ３ ｄ，预 防关节感染。 关节炎指数
（ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＩｎｄｅｘ，ＡＩ）评分≥４分，则视为造模成功［８］，本次实验中所有 ＯＡ 模型均构建成功。
１．２．２ 分组及给药 造模１周后，ＯＡ 大鼠随机分为 ＯＡ 组、夏枯草黄酮低、中、高剂量组、Ｙ－２７６３２ 组，每组１２只。假手术组和 ＯＡ 组大鼠均给予生理盐水灌胃，夏 枯 草 黄 酮 低、中、高 剂 量 组 分 别 给 予６．１２５， １２．２５０，２４．５００ ｍｇ／ｋｇ 夏枯草黄酮灌胃［９］，Ｙ－２７６３２组给５ｍｇ／ｋｇ的 Ｙ－２７６３２灌胃［１０］，各组灌胃体积均是 １０ ｍＬ／ｋｇ，１次／ｄ，连续８周。PD0325901
１．２．３ 大鼠压痛阈值、热痛阈值检测 末次给药后 ２４ｈ，大鼠用圆桶固定，电子压痛仪扁型头压向大鼠患侧后足背，大鼠鸣叫或挣扎时的压力值即为压痛阈值。大鼠置于透明有机玻璃箱内，足底热测痛仪置于大鼠患侧足底中央，打开仪器计时，大鼠鸣叫或抬腿回避时所用时间即为热痛阈值，测定时间不超过２０ｓ，温度不超过３０ ℃。压痛阈值、热痛阈值每只大鼠均测量 ３次，取平均值。
１．２．４ 组织取材及保存 ３％戊巴比妥钠腹部麻醉大鼠，腹 主动脉取血，离 心，收 集上清至新离心管中，
－８０ ℃保存。颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下取大鼠右侧膝关节股骨髁关节，固 定于 ４％ 多聚甲醛中２４ｈ，１０％乙二胺四乙酸脱钙液脱钙 ８ 周，脱钙完成后，弃脱钙液，清水漂洗３ｈ。切出股骨髁关节软骨， 分为两部分，一部分梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡组织包埋；另一部分保存于－８０ ℃ 冰箱，用于后续蛋白免疫印迹实验检测。
１．２．５ ＥＬＩＳＡ 法检测大鼠血清 ＴＮＦ－α及ＩＬ－１β水平
ＥＬＩＳＡ试剂盒对大鼠血清ＴＮＦ－α及ＩＬ－１β水平进行检测，实验严格按照试剂盒说明书进行操作。
１．２．６ ＨＥ 染色法观察大鼠关节软骨形态变化 全自动切片机对石蜡标本进行４μｍ 切片，ＨＥ 染色试剂盒染色，透明，封片，显微镜下观察大鼠关节软骨形态变 化 。 每 张 切 片 随 机 选 取 ５ 个 视 野 拍 照 ， 参 照Ｍａｎｋｉｎ’ｓ关节软骨病理评分标准［１１］，根据大鼠软骨组织病理改变情况对大鼠进行评分，Ｍａｎｋｉｎ’ｓ评分越高表示软骨组织病理损伤越严重。
１．２．７ ＴＵＮＥＬ法检测大鼠软骨细胞凋亡情况 全自动切片机对石蜡组织进行４μｍ 切片，常规脱蜡至水，不含ＤＮＡ 酶的蛋白酶Ｋ 工作液处理１５ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗，加入 ＴＵＮＥＬ 反应液，ＰＢＳ 配置的３％ 过氧化氢溶液中 ３７ ℃孵育２０ ｍｉｎ，ＰＢＳ 漂洗，加５０μＬ ＴＵＮＥＬ 检测液
（绿色），ＤＡＰＩ染核，３７ ℃遮光孵育６０ ｍｉｎ；ＰＢＳ 漂洗，
抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察，随机选取５个视野，计数凋亡细胞，取平均值。
１．２．８ 蛋 白 免 疫 印 迹 法 检 测 大 鼠 软 骨 组 织 中 Ｃａｓｐａｓｅ－３、ＲｈｏＡ、ＲＯＣＫ 蛋白表达 取－８０ ℃ 冰箱中保 存 的 大 鼠 软 骨 组 织，研 磨 成 粉，装 至 预 冷 的１．５ ｍＬ离心管中，加入蛋白裂解液，冰上裂解３０ ｍｉｎ， ４ ℃，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，转移上清液至新离心管中，ＢＣＡ 蛋白试剂盒Navitoclax检测蛋白浓度。之后进行凝胶电泳，电 泳 结 束 后，转 膜，封 闭，分 别 加 入 兔 抗 鼠Ｃａｓｐａｓｅ－３、ＲｈｏＡ、ＲＯＣＫ、ＧＡＰＤＨ 一抗稀释液（均是１∶５００ 稀释），４ ℃孵育过夜，ＴＢＳＴ 洗膜，加入山羊抗兔二抗稀释液（１∶１０００稀释），室温孵育１ｈ，ＴＢＳＴ 洗膜。蛋白凝胶成像系统成像，ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ６．０ 图像软件分析蛋白条带灰度值。