乳房炎是制约奶牛养殖业发展的主要疾病之一,由于其常用的抗生素治疗方法存在药物残留和病菌耐药性等诸多安全隐患,因此迫切需要寻找应对奶牛乳房炎的新治疗措施。植物提取物富含生物活性成分,具有极大的药用潜力,能够作为抗生素替代物防治奶牛乳房炎。菊科植物黄花蒿广泛分布于内蒙古荒漠化草原地区,具有抗炎、抗氧化等多种功效。课题组前期研究结果表明,黄花蒿提取物能够有效预防大肠杆菌性奶牛乳房炎,并降低乳中体细胞数,但黄花蒿乙醇提取物(AAE)对于大肠杆菌性奶牛乳房炎的防控机理研究未见报道。因此,本论文探讨了AAE能否通过调控CD36表达进而改善LPS诱导下奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)的炎症损伤和紧密连接破坏,以期为寻找降低奶牛乳房炎发病率的抗生素替代物提供参考依据。本论文主要包括六个试验:试验1:AAE对LPS诱导损伤bMECs活力及结构的影响。研究添加不同浓度AAE对LPS诱导下bMECs细胞活力、细胞凋亡、细胞结构及超微结构的影响,筛选AAE适宜的添加浓度和作用时间。AAE中共鉴定出321种活性成分,包括56种酚酸、48种黄酮类、40种有机酸、18种生物碱、16种萜类、12种木脂素和香豆素、2种醌类和129种其他化合物。添加3-48μg/m L AAE在3至48 h内无明显毒性,其中3、6和12μg/m L的AAE预处理3 h时显著提高了细胞活力,且呈剂量依赖性。进一步构建LPS诱导炎症损伤模型,10μg/m L LPS显著降低bMECs存活率,引发细胞凋亡,损伤细胞结构和超微结构。在LPS刺激前,用3、6和12μg/m L AAE预保护bMECs后细胞活力显著升高,凋亡率点击此处显著降低,细胞结构和超微结构受损程度减轻,其中12μg/m L AAE预保护3 h时的效果最为明显。试验2:AAE对LPS诱导损伤bMECs紧密连接的影响。在试验1的基础上,采用免疫荧光、RT-PCR及western blotting技术进一步探究了AAE对LPS诱导损伤bMECs紧密连接蛋白的保护作用。经10μg/m L LPS处理12 h后,occludin、ZO-1、claudin-1荧光信号强度明显减弱,基因和蛋白表达水平也显著下降,说明紧密连接蛋白结构受损BMS-354825说明书。3、6、12μg/m L AAE预处理3 h后明显改善了LPS对紧密连接的负面影响,逐渐增强了紧密连接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1荧光强度,上调了其mRNA和蛋白表达量,保护了紧密连接完整性。试验3:基于转录组分析AAE对LPS诱导损伤bMECs的保护作用。采用RNA-seq技术挖掘了AAE预处理作用下LPS诱导损伤bMECs中的差异基因及差异信号通路,探索了AAE防治乳房炎的调控靶点。通过对LPS诱导损伤bMECs进行转录组深度测序,10μg/m L LPS可通过引起CD36等基因及NF-κB、MAPK等信号通路差异变化,调控TNF-α、IL-6、IL-8等炎症介质的转录,从而造成bMECs炎性损伤。进一步分析发现,在LPS诱导bMECs损伤之前,进行AAE预处理能通过上调细胞生长发育等相关基因水平,抑制炎症响应等方面的基因表达,缓解炎症进程。试验4:AAE对LPS诱导损伤bMECs炎症反应的保护作用。通过RT-PCR和western blotting技术对RNA-seq筛选出的CD36、NF-κB、MAPK等差异基因及信号通路进行验证,以揭示AAE缓解bMECs炎症反应的分子机制。3、6、12μg/m L AAE预处理能以剂量依赖性方式有效减轻LPS刺激下bMECs的炎症反应程度,降低CD36mRNA和蛋白表达量,抑制NF-κB(IKBα、p65)和MAPK(p38、JNK、ERK)信号通路蛋白活性及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表达,其中12μg/m L AAE预处理抗炎保护作用最佳,提示CD36可能参与了AAE对LPS诱导下bMECs炎症反应的调控过程。试验5:基于CD36过表达研究了AAE的抗炎损伤机制。在试验4的基础上,以差异基因CD36为研究对象,通过腺病毒转染构建CD36过表达模型,研究AAE能否通过调控CD36抑制炎症反应,缓解LPS诱导下细胞生长抑制和紧密连接破坏。在CD36正常表达bMECs中,12μg/m L AAE可显著抑制LPS诱导下CD36表达以及NF-κB和MAPK信号通路活性,降低炎症因子水平,从而改善bMECs炎症损伤程度。过表达CD36后,10μg/m L LPS能显著激活NF-κB和MAPK信号通路,并诱导下游IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的高效表达,而bMECs活力和紧密连接蛋白受到更明显的抑制作用。但CD36过表达部分减弱了12μg/m L AAE对LPS诱导bMECs炎症反应的抑制作用,以及对细胞活力和紧密连接的保护作用,说明AAE对于LPS诱导损伤bMECs的保护机制与CD36相关联。试验6:基于CD36干扰研究了AAE的抗炎损伤机制。在试验5 CD36过表达基础上,进一步采用CD36-si RNA技术,探讨了CD36是否在AAE抗炎保护机制中发挥了核心调控作用。在进行CD36-si处理后,添加或未添加LPS处理并未明显影响细胞活力及occludin、ZO-1、claudin-1 mRNA和蛋白表达量,而12μg/m L AAE也并未表现出明显的预保护效果。CD36干扰阻碍了LPS作用下bMECs NF-κB和MAPK信号通路的活化,未显著影响TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA表达水平,同时也在一定程度上消除了AAE对于LPS诱导下NF-κB和MAPKheart infection信号通路及炎症因子的抑制作用。综上所述,本论文探讨了AAE对LPS诱导炎症损伤bMECs的预保护机制。AAE能通过调控CD36表达量,抑制LPS刺激下bMECs NF-κB通路IκBα和p65,以及MAPK通路ERK、JNK、p38磷酸化,减少TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA水平,进而保护细胞活力和紧密连接。因此,AAE能保护bMECs免受LPS引发的炎症损伤和紧密连接破坏,对奶牛乳房炎具有一定的预防作用。