【目的】心血管疾病是全球居民的首要死亡原因,Vaginal dysbiosis其主要的病理基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)。NLRP3炎性小体介导的焦亡通路是AS的重要发病机制之一,血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)焦亡促使斑块纤维帽变薄、坏死核心扩大,增加了斑块的不稳定性。核因子E-2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是氧化应激的主要调节因子,通过调控活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的产生从而抑制了NLRP3炎性小体介导的焦亡通路。目前临床上治疗AS的药物主要是他汀类药物,部分患者即使在规范、足量使用他汀类药物后,仍存在明显的心血管残留风险,因此寻找安全、有效的药物尤为重要。天然植物在抗AS治疗中显示了良好的治疗潜力,基及树(Carmona microphylla(Lam.)G.Don.),在海南本地被广泛用于治疗感染性疾病、心脑血管疾病。前期课题组研究结果显示,基及树水提物可抑制人肝肿瘤HepG_2细胞中的脂质蓄积,降低高脂血症模型小鼠血脂水平,但其是否具有抗AS作用目前尚无报道,因此本研究创新性探究基及树水提物抗AS作用及机制。基于此,我们提出本研究的科学假说:基及树水提物具有抗AS的作用,其潜在机制可能通过激活Nrf2,进而抑制NLRP3炎性小体介导的平滑肌细胞焦亡。围绕这一假说,本研究首先利用ApoE~(-/-)小鼠构建AS模型,观察基及树水提物对ApoE~(-/-)小鼠血脂、动脉粥样硬化斑块的影响;其次,采用网络药理学预测基及树水提物抗AS的分子机制;最后,采用棕榈酸钠(Palmitic acid,PA)诱导平滑肌细胞建立细胞焦亡模型探讨基及树水提物对潜在分子机制的调控作用,并通过干扰或过表达关键基因的表达,进一步验证基及树水提物抗AS的分子机制和关键作用靶LY294002分子量点。【方法】1.基及树水提物对ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块的影响(1)采用高脂饮食喂养ApoE~(-/-)小鼠16周建立AS模型,根据干预措施进行分组:模型组、基及树水提物高剂量组(600 mg/kg)、基及树水提物低剂量组(300 mg/kg),阿托伐他汀钙片组(10 mg/kg),普通饮食喂养ApoE~(-/-)小鼠作为对照组,每组12只,共计60只。高脂饲料喂养第8周时,开始予药物灌胃8周。实验结束时检测各组小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平;采用油红O染色、H&E染色观察小鼠主动脉及主动脉根部斑块病理情况。(2)ELISA法检测小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-18表达水平;WST-1法检测小鼠血清SOD水平,TBA法检测小鼠血清MDA水平,钼酸铵法检测小鼠血清CAT水平,微板法检测小鼠血清GSH-P_X表达水平。(3)采用RT-qPCR、Western Blot检测细胞焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β基因及蛋白表达水平,免疫荧光染色检测小鼠主动脉NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平。2.基于网络药理学和分子对接预测基及树水提物抗动脉粥样硬化的作用机制(1)采用UHPLC-MS检测基及树水提物化合物,借助中药系统药理学平台(TCMSP)检索基及树水提物的主要成分,明确其有效成分及靶点。采用DisGeNET和Gene Cards数据库检索AS疾病靶点,取交集获得的靶点为AS核心靶点。将基及树水提物化合物靶点及AS核心靶点取交集得到重叠基因,通过STRING数据库构建蛋白互作(PPI)网络。采用Metascape数据库进行重叠基因基因本体功能(GO)与京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。(2)利用Cytoscape软件构建网络靶点图,借助Cytohuba插件筛选排名前10位的hub基因,CytoNCA插件筛选排名前10位的基及树水提物核心化合物。运用分子对接将上述10个核心化合物与核心蛋白靶点进行分子对接。3.基及树水提物抗动脉粥样硬化机制研究(1)采用AS模型小鼠分析基及树水提物对Nrf2、HO-1、NQO1基因及蛋白表达水平的影响。(2)采用不同浓度棕榈酸钠(PA)损伤小鼠主动脉平滑肌细胞(MOVAS)建立细胞焦亡模型,将其分为对照组、模型组(PA诱导损伤)、基及树高剂量组(80μg/m L)、基及树低剂量组(40μg/m L)。CCK-8法检测细胞存活率,筛选PA损伤MOVAS的最佳造模浓度及时间。乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞损伤情况、细胞划痕检测细胞迁移能力、EdU染色检测细胞增殖情况、DCFH-DA特异性探针检测ROS水平。(3)采用RT-qPCR、Western Blot检测细胞抗氧化因子Nrf2、HO-1、NQO1及细胞焦亡NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β基因和蛋白的表达水平;免疫荧光检测细胞Nrf2、NLRP3蛋白表达水平。(4)构建Nrf2干扰及过表达质粒,检测敲除或过表达Nrf2后,基及树水提物对上述抗氧化分子Nrf2、HO-1、NQO1和细胞焦亡分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β表达水平的影响。【结果】1.基及树水提物对ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块的研究结果(1)基及树水提物改善AS模型小鼠的血脂水平。血脂检测结果显示,与模型组相比,基及树水提物高、低剂量组、阿托伐他汀组明显降低AS模型小鼠血清TC、TG、LDL-C含量和升高HDL-C含量(P<0.05)。(2)基及树水提物减少AS模型小鼠动脉粥样硬化斑块面积。主动脉大体及根部油红O染色、H&E染色结果显示,基及树水提物高、低剂量组及阿托伐他汀组主动脉根部红染区域及斑块面积减少(P<0.05)。(3)基及树水提物下调AS模型小鼠血清炎症因子,上调抗氧化因子的表达。ELISA结果显示基及树水提物高、低剂量组及阿托伐他汀组小鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-18的表达水平明显更低(P<0.05);与阿托伐他汀相比,基及树水提物高剂量组降低IL-1β、TNF-α、IL-18的表达水平更为显著(P<0.05),IL-6水平降低但无统计学差异(P>0.05);此外,基及树水提物高、低剂量组、阿托伐他汀的治疗升高了小鼠血清CAT、SOD、GSH-P_X表达水平,降低了MDA表达水平(P<0.05),且以基及树水提物高剂量效果显著(P<0.05)。(4)基及树水提物抑制AS模型小鼠焦亡相关分子的表达。RT-qPCR、Western Blot检测结果显示基及树水提物高、低剂量、阿托伐他汀明显降低焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β基因及蛋白的表达水平(P<0.05),同时免疫荧光结果也证实了基及树水提物对小鼠主动脉组织NLRP3、Caspase-1蛋白的表达水平有明显的抑制效果(P<0.05),且以基及树水提物高剂量效果显著(P<0.05)。2.基于网络药理学和分子对接预测基及树水提物抗动脉粥样硬化机制的结果(1)采用UHPLC-MS初步筛查基及树水提物化合物,经过TCMSP数据库检索及筛选后,基及树水提物化合物包含41个核心成分、133个靶点,AS靶点1588个,基及树与AS的重叠靶点共有71个。上述重叠靶点导入STRING数据库生成PPI网络图,共有71节点,893条边。(2)采用Cytohuba插件筛选前10位的hub基因,分别为TP53、CASP3、IL6、JUN、VEGFA、HIF1A、MYC、CTNNB1、AKT1。CytoNCA插件筛选排名前10位的基及树水提物核心化合物,分别为分别为丹参新酮、川陈皮素、非瑟酮、芦荟大黄素、金黄紫堇碱、甜橙黄酮、毛蕊异黄酮、驴食草酚、四氢小檗碱、刺桐特灵碱。KEGG富集的信号通路主要涉及脂质与动脉粥样硬化通路、HIF-1信号传导途径、NF-kappa B信号传导途径、胰岛素抵抗、坏死性凋亡等通路,其中脂质与动脉粥样硬化通路富集结果最为显著。分子对接结果显示上述10个核心化合物与脂质与动脉粥样硬化通路中的Nrf2蛋白具有良好的结合位点。3.基及树水提物抗动脉粥样硬化机制研究结果(1)基及树水提物通过增加抗氧化因子的表达,发挥抗氧化作用。体内实验中Nrf2在AS模型小鼠主动脉中低表达,基及树水提物高、低剂量组、阿托伐他汀组提高Nrf2、HO-1、NQO1基因及蛋白的表达水平(P<0.05)。与阿托伐他汀相比,基及树水提物高剂量组升高上述抗氧化因子表示水平更为显著(P<0.05)。(2)基及树水提物改善平滑肌细胞活力。体外实验中,随着PA浓度增加和作用时间延长,MOVAS细胞活力降低、细胞形态改变,根据CCK-8结果选取PA 300μM、作用24 h为造模浓度及时间。与模型组相比,基及树水提物预给药组可以改善MOVAS细胞存活率(P<0.05)、迁移能力(P<0.05)、增殖能力(P<0.05)、减少ROS水平(P<0.05),且以高剂量组显著(P<0.05);(3)基及树水提物可显著逆转PA诱导损伤的MOVAS细胞Nrf2、HO-1、NQO1表达水平,发挥抗氧化作用。RT-qPCR、Western Blot检测结果显示,PA诱导损伤MOVAS细胞中Nrf2、HO-1、NQO1基因及蛋白的表达水平明显下调(P<0.05),基及树水提物高、低剂量预处理可以显著抑制这些变化;免疫荧光结果也证实了基及树更多水提物高、低剂量组可以升高Nrf2的表达水平(P<0.05)。(4)基及树水提物可下调细胞焦亡相关分子的表达,发挥抗焦亡作用。RT-qPCR、Western Blot检测结果显示,PA诱导损伤的MOVAS细胞焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β基因及蛋白的表达水平明显上调(P<0.05),基及树水提物高、低剂量预处理后,上述焦亡相关分子的表达显著下降;免疫荧光结果也证实了基及树水提物高、低剂量组可以抑制NLRP3蛋白的表达水平(P<0.05)。(5)基及树水提物抗焦亡作用与激活Nrf2有关。敲除Nrf2后,削弱了基及树水提物对NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β细胞焦亡分子的抑制作用(P<0.05);而Nrf2过表达后,增强了基及树水提物抗细胞焦亡的作用,NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】(1)基及树水提物可以改善脂质代谢,减少主动脉斑块形成。(2)基及树水提物通过降低炎症和焦亡因子表达水平,改善氧化应激状态,发挥抗AS作用。(3)网络药理学结果显示基及树水提物抗AS作用具有多成分、多靶点特性。(4)基及树水提物抗AS的机制可能与激活Nrf2及下游抗氧化因子HO-1、NQO1,进而抑制NLRP3炎性小体介导的平滑肌细胞焦亡通路有关。