多聚磷酸盐激酶(Polyphosphate kinases,PPK)因其底物聚磷酸廉价易得,已参与到许多生物催化反应中,为ATP消耗反应提供能量。在本研究中,为得到更高酶活的PPK酶,对PPK酶进行胞外胞内高通量筛选,结合理性设计突变改造PPK酶。基于该突变酶,构建了ATP再生系统,偶联谷胱甘肽双功能酶Gsh AB生产谷胱甘肽,增强ATP再生能力来提高谷胱甘肽产量,降低催化成本,并对生产体系进行优化,实现高效生产谷胱甘肽。主要结果如下:(1)根据PPK的分类及进化树分析,在大肠杆菌中克隆表达了七种不同来源的多聚磷酸盐激酶,研究底物poly P磷酸盐链的长度和浓度对PPKs的酶活影响。结果表明七种PPK酶对底物六偏磷酸钠poly P_6的催化能力最好,磷酸盐浓度越高,对PPK的酶活抑制作用越强;来源哈氏纤维细菌的Ch PPK比酶活最高,为30.26±2.08 U·mg~(-1),是七种PPK酶利用底物poly P_6再生ATP的最佳生物催化剂。(2)易错PCR构建Ch PPK突变体文库,结合胞外胞内高通量筛选法以及定点突变,最终筛选到双突变体Ch PPK_(D82N-K103E)的相对酶活提高到430.2%,展现最高的催化能力。分子对接发现,关键位点D82和K103残基分别位于底物poly P_6通道和ADP通道的入口,并与底物的磷酸基团形成离子相互作用,突变后,N82和E103仍扩大了底物通道腔来提高Ch PPK的催化活性。通过RMSD和RMSF的分析发现,D82N和K103E的突变提高了分子结Medical service构灵活性,促进了底物(poly P_6和ADP)与活性口袋之间的相互作用。(3)在突变酶Ch PPK_(D82N-K103E)与Gsh AB偶联的EB13全细胞催化体系中,添加5m M ATP,40 h内可将50 m M底物转化产生14.2±1.2 m M的谷胱甘肽,可以达到EB11(表达Gsh AB酶)全细胞催化C59体系(给予100 m M ATP)的91.6%的效果,比未突变的Ch PPK与Gsh AB偶联的催化产量提高了59.6%。对催化体系的缓冲液、菌体量、补料时间和底物浓度优化后,40 h时EB13菌株可以将50 m M底物转化生成34Staurosporine临床试验.1±2.6 m M的谷胱甘肽,底物半胱氨酸转化率为68.2%;而当底物浓度为100 m M时,40 h时谷胱甘肽产量最高,为51.5±1.3 m M,底物半胱氨酸转化率为51.5%。(4)为进一步提高谷胱甘肽生产过程中的转化率,将菌株EB11、EB12、EB13破碎细胞后以无细胞裂解液的形式催化谷胱甘肽的生产。Ch PPK_(D82N-K103E)与Gsh AB偶联,添加5 m M ATP,即可获得高效的ATP再生效率,8 h内可将50 m M底物转化产生27.1±1.9 m M的谷胱甘肽,比未突变的Ch PPK与Gsh AB偶联的催化产量提高了51.4%。对催化体系的缓冲液、菌体量、补料时间和底物浓度优化后,8 h时EB13菌株可以将50 m M底物转化生成46.2±1.4 m M(14.2±0.4 g·L~(-1))的谷胱甘肽,底物半胱氨酸转化率最高,为92.4%;当底物浓度为100 m M时,8 h时谷胱甘肽产量最高,为67.5±1.7 m M(20.7±0.5 g·L~(-1)),底物半胱氨酸转化率为67.5%。