伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是α-疱疹病毒亚科的成员,其基因组转录按照严格的级联调控方式进行,即立即早期基因最先转录,随后早期基因和晚期基因依次转录。PRV只有一个立即早期基因即IE180基因,当病毒感染后IE180基因是第一个被转录、翻译的基因,IE180蛋白能够激活下游基因的转录,因此是病毒复所必需的,也成为研究抗PRV药物的重要靶点。白藜芦醇(Resveratrol,Res)是一种天然存在的非黄酮类多酚化合物,具有抗病毒、抗炎和神经保护等药理活性。前期研究发现了白藜芦醇主要抑制了PRV早期复制阶段。基于此,本研究一方面从PRV IE180基因的转录水平、蛋白表达水平以及蛋白转录激活功能研究了白藜芦醇抗PRV作用,同时结合分子对接技术模拟白藜芦醇与PRV IE180蛋白结合,获得互相结合的氨基酸位点并进行验证,从直接抑制病毒的角度揭示了白藜芦醇抗病毒机制,为寻找抗PRV靶点药物奠定基础。另一方面,鉴于PRV是一种高度嗜神经病毒,感染后可造成神经系统的炎症。因此,本研究通过建立PRV感染小鼠模型,评价白藜芦醇对其疗效以及对脑组织损伤的保护作用,从调节机体的角度揭示白藜芦醇间接抗病毒作用及其机制,为白藜芦醇的临床应用奠定基础。主要的研究内容及结果如下:1.白藜芦醇对PRV立即早期基因、早期基因及相关基因mRNA表达水平的影响PRV基因组转录按照严格的级联调控方式进行,即立即早期基因IE180最先转录,随后早期基因和晚期基因依次转录,IE180蛋白是激活下游基因的转录所必需的。因此本研究采用RT-PCR的方法检测白藜芦醇对PRV立即早期基因(IE180)、早期基因(EP0、US1和UL54)和病毒复制所必需基因(UL5、UL8、UL9、UL29、UL30、UL42和UL52)mRNA表达水平的影响。结果:(1)在PRV感染后,白藜芦醇对立即早期基因IE180的mRNA表达水平无显著影响。(2)在PRV感染后,白藜芦醇抑制了早期基因和病毒复制所必需基因的mRNA表达水平。结论:白藜芦醇对PRV IE180基因的转录无影响,可通过抑制PRV早期基因和病毒复制所必需基因的转录,使得病毒的复制受阻。这提示了白藜芦醇可能是通过影响PRV IE180蛋白的表达,从而使得下游基因转录受阻,进而抑制病毒的复制。2.白藜芦醇对PRV IE180蛋白表达及细胞内定位的影响PRV IE180基因的成功转录并翻译成蛋白质对PRV复制至关重要。因此,本研究以PRV DNA为模板扩增出IE180基因片段,构建了p IE180重组质粒。采用Western blot方法检测在PRV感染和过表达p IE180重组质粒这两种情况下,白藜芦醇对PRV IE180蛋白表达的影响,并通过间接免疫荧光方法观察白藜芦醇对PRV感染后PRV IE180蛋白在细胞内定位的影响。结果:(1)经过测序比对成功地构建了p IE180重组质粒。(2)在PRV感染后,白藜芦醇分别作用4 h、6 h和8 h,发现对PRV IE180蛋白表达无显著影响;另外,在过表达p IE180重组质粒情况下,白藜芦醇分别作用4 h、6 h和8 h,也发现对PRV IE180蛋白过表达无显著影响。(3)PRV感染后,白藜芦醇抑制了PRV IE180蛋白在细胞核中的分布。结论:白藜芦醇对PRV IE180蛋白的表达无影响,可降低了IE180蛋白在细胞核的分布,提示了白藜芦醇抑制PRV的复制可能是通过影响IE180蛋白的转录激活功能来实现的。3.白藜芦醇对PRV IE180蛋白转录激活功能的影响PRV IE180基因在病毒感染细胞之后能够迅速大量地转录并翻译成蛋白质,其具有激活下游早期基因和晚期基因转录的功能。因此,本研究以PRV DNA为模板扩增出早期基因(TK)启动子序列,构建p GL3-TK重组质粒,随后采用双荧光素酶报告基因系统和RT-PCR方法检测了白藜芦醇对PRV IE180蛋白转录激活功能的影响。结果:(1)经过测序对比成功地构建了p GL3-TK重组质粒。(2)共同转染p IE180和p GL3-TK重组质粒,且以p RL-TK质粒作为内参对照,结果发现PRV IE180蛋白能够激活早期基因启动子,而白藜芦醇处理后,PRV IE180蛋白激活早期基因启动子的能力降低,且呈剂量依赖性。(3)转染p IE180重组质粒,促进早期基因mRNA表达,而白藜芦醇处理后抑制早期基因mRNA表达。结论:白藜芦醇通过抑制PRV IE180蛋白转录激活功能,使其激活早期基因启动子的活性降低,导致早期基因转录无法进行,最终抑制了病毒的复制。4.白藜芦醇与PRV IE180蛋白分子对接以及结合位点的突变验证为了寻找白藜芦醇抗PRV作用的靶点,本研究首先对PRV IE180蛋白进行结构分析,随后采用Discovery Studio 2016软件模拟白藜芦醇与PRV IE180蛋白分子对接获得结合位点,并通过定点突变、双荧光素酶报告基因系统和RT-PCR的方法验证白藜芦醇与PRV IE180蛋白的结合位点。结果:(1)PRV IE180蛋白结构主要由无规则卷曲的集群组成,其结构与单纯疱疹病毒的转录因子ICP4相似,且经过同源建模获得稳定的PRV IE180蛋白模型,并适用于分子对接。(2)经过分子对接技术获得白藜芦醇与PRV IE180蛋白的结合位点,分别是第601位的苏氨酸(Thr)、第603位的丝氨酸(Ser)和第606位的脯氨酸(Pro)。(3)将上述三个结合位点分别进行点突变为丙氨酸(Ala),经测序比对均突变成功,并分别命名为p IE180~(Thr601Ala)、p IE180~(Ser603Ala)和p IE180~(Pro606Ala)重组质粒。(4)分别将p IE180、p IE180~(Thr601Ala)/p IE180~(Ser603Ala)/p IE180~(Pro606Ala)重组质粒与p G3L-TK重组质粒共同转染,p RL-TK质粒为内参对照,结果发现p IE180~(Thr601Ala)/p IE180~(Ser603Ala)/p IE180~(Pro606Ala)重组质粒能够激活早期基因启动子,且白藜芦醇处理后依然能激活早期基因启动子。此外,转染p IE180~(Thr601Ala)/p IE180~(Ser603Ala)/p IE180~(Pro606Ala)重组质粒后,白藜芦醇对早期基因mRNA表达水平无影响。结论:白藜芦醇抗PRV作用靶点是PRV IE80蛋白的第601位苏氨酸(Thr),第603位丝氨酸(Ser)和第606位脯氨酸(Pro),与这三个氨基酸结合后PRV IE180蛋白转录激活功能受到抑制,从而阻断其激活下游早期基因转录,导致病毒的复制无法进行,最终达到抗病毒作用。5.白藜芦醇对小鼠早期感染PRV的效果评价体外研究表明白藜芦醇抑制了PRV IE180蛋白转录激活功能,使得下游基因的转录受阻,从而阻断病毒的复制。接下来,采用滴鼻的方式建立PRV感染小鼠模型,通过病毒载量、病毒重新激活分析、病毒相关基因mRNA表达水平以及免疫组化等实验系统地评价了白藜芦醇抗PRV感染的效果。结果:(1)PRV以80μL 1×10~6TCID_(50)的剂量感染小鼠24 h,白藜芦醇对小鼠的体重及脏器系数均无显著影响。(2)PRV感染后,白藜芦醇降低了脑组织和脊髓中的病毒载量。(3)PRV感染后,存留于脑组织、脊髓和三叉神经的病毒能够重新感染PK-15细胞,而白藜芦醇处RSL3纯度理的小鼠,其离体脑组织、脊髓和三叉神经感染PK-15细胞的能力降低。(4)PRV感染后,白藜芦醇对立即早期基因IE180的mRNA表达水平无影响,可抑制了早期基因的mRNA表达。(5)PRV感染后,白藜芦醇减少了PRV在脑组织中的分布。结论:白藜芦醇具有良好的抗PRV效果,其主要通过降低了脑组织和脊髓中病毒载量,阻断了病毒的重新激活能力,抑制早期基因的mRNA表达水平,减少了PRV在脑组织分布,从而发挥抗PRV作用。6.白藜芦醇对PRV感染小鼠所致脑组织损伤的保护作用PRV是一种高度嗜神经病毒,感染后可引发脑组织炎症,因此本研究采用免疫组化、HE/Nissl/TUNEL染色、RT-PCR以及ELISA等方法检测了白藜芦醇对PRV感染小鼠脑组织损伤的影响。结果:(1)PRV感染后,白藜芦醇降低了脑组织中伊文思蓝的含量,且抑制了MMP-2、MMP-9的表达,促进了ZO-1的表达。(2)白藜芦醇缓解了由PRV感染引起的脑组织损伤病理变化,尼氏小体形态和数量恢复到正常水平,神经元凋亡也减少。(3)PRV感染后,白藜芦醇降低了促炎因子(IL-6、TNF-α)和趋化因子(CCL3、MCP-1和CXCL10)的分泌;促进了抗炎因子(IL-4和IL-10)和神经营养因子(TGF-β和GNDF)的释放。结论:白藜芦醇对PRV感染所致脑组织损伤具有保护作用,其主要是通过下调MMP-2和MMP-9的表达,上调ZO-1的表达,从而改善了血脑屏障的通透性;同时改善了脑组织的病理损伤,并调节机体促进抗炎因子和神经营养因子的释放,抑制促炎因子和趋化因子分泌,缓解了PRV感染引发的脑组织损伤,发挥了抗PRV作用。7.白藜芦醇对PRV感染原代小胶质细胞和神经元的影响小胶质细胞是存在于中枢神经系统中的一种固有免疫细胞,其对中枢神经系统内稳态中起着重要的作用。本研究首先分离获得原代小胶质细胞和神经元,通过CCK-8、间接免疫荧光、流式细胞术和ELISA等方法检测了白藜芦醇对PRV感染的原代小胶质细胞及神经元的影响。结果:(1)通过间接免疫荧光方法证实成功地获得了原代小胶质细胞和神经元。(2)白藜芦醇浓度小于30μg/m L时对原代小胶质细胞存活率无显著影响。(3)PRV感染原代小胶质细胞后,白藜芦醇促进原代小胶质细胞由M1型向M2型转化,并使其分泌抗炎因子。(4)采用Transwell小室建立原代小胶质细胞-神经元共同培养体系,PRV感染原代小胶质细胞后,发现白藜芦醇能够抑制神经元的凋亡,并且下调了神经元培养液中促炎因子的含量,上调了抗炎因子的含量。结论:白藜芦醇能够调节原代小胶质细胞的极化,使其由M1型转向M2型,并发挥其抗炎以及神经保护作用,减少了对神经元的损伤,从而缓解了PRV感染造成的脑组织炎症。综上所述,白藜芦醇对PRV感染具有良好的抗病毒作用Antibiotic de-escalation,其作用机制主要体现在两个方面:一是直接作用于病毒,白藜芦醇不影响PRV IE180基因的转录水平和蛋白表达水平,可抑制了其转录激活功能,使其无法激活下游早期基因的转录。进一步研究发现白藜芦醇与PRV IE180蛋白的氨基酸(Thr601、Ser603和Pro606)结合,使得PRV IE180蛋白在细胞核内转录激活功能受到抑制而阻断了下游基因的转录,导致病毒的复制无法进行,最终达到抗病毒效果。二是间接作用于机体,首先白藜芦醇能够降低PRV感染小鼠脑组织和脊髓中病毒载量,减少PRV在脑组织分布;其次白藜芦醇能够抑制MMP-2、MMP-9的表达,促进ZO-1的表达,改善了血脑屏障的通透性,并调节机体促进抗炎因子和神经营养因子的释放,抑制促炎因子和趋化因子分泌,发挥抗炎作用,缓解了脑组织的病理损伤,最后在细胞水平上白藜芦醇通过调控脑组织中小胶质细胞的表型,使其由M1型向M2型转化,Roxadustat分子量最后由M2型小胶质细胞发挥其抗炎和神经保护作用,从而缓解了由PRV感染引起的神经炎症反应,进而达到抗病毒保护脑组织的作用。