糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最常见的并发症之一,主要表现为不同程度的蛋白尿、高血压和肾功能进行性下降。DKD发病机制复杂,近年研究发现,除糖代谢紊乱、肾脏血流动力学改变等因素外,固有免疫通路的激活及其引起的炎症反应也有重要作用。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat pyrin 3 domain,NLRP3)作为固有免疫系统的重要成员之一,可识别糖尿病状态下组织细胞受到损伤后所产生的损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs),通过凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain,ASC)招募并激活半胱天冬酶1(Caspase-1),促进白介素 1β(Interleukin 1β,IL-1β)和白介素 18(Interleukin 18,IL-18)前体产生成熟的炎症因子,从而引发炎症反应。足细胞为肾小球滤过屏障的重要组成部分,足细胞损伤和功能障碍在DKD中至关重要。研究发现,糖尿病状态下足细胞内NLRP3信号通路的激活可导致足细胞损伤,促进DKD发生发展。近年研究发现,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)对DKD有一定的治疗作用,但由于其安全性、免疫排斥反应和伦理等问题,导致其临床应用有一定局限性。MSCs分泌的外泌体(MSCs-Exo)除了具有MSCs的生物学功能外,还可以在一定程度上避免MSCs的不良反应,或许比MSCs具有更大的临床应用潜力。因此,深入研究MSCs-Exo对足细胞和DKD的保护作用及机制,或可为临床DKD的治疗提供新思路。研究目的1.明确MSCs-Exo对高糖(High glucose,HG)等损伤因子作用下的足细胞和DKD肾组织的保护作用。2.明确MSCs-Exo对HG状态下足细胞和DKD肾组织中NLRP3通路的作用。3.探讨MSCs-Exo对HG状态下足细胞和DKD肾组织中NLRP3通路的作用机制。研究方法1.MSCs-Exo对足细胞和DKD肾组织的保护作用以及对NLRP3通路的影响1.1 MSCs-Exo提取、鉴定和标记应用超速离心法从MSCs上清中提取外泌体获得MSCs-Exo,通过蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)、纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)、透视电镜(Transmission electron microscopy,TEM)方法检测其标志蛋白(CD81,CD63,TSG101)表达、粒径大小和粒径形态。应用PKH-67染料标记MSCs-Exo,观察MSCs-Exo在足细胞和小鼠体内的定位情况。1.2 HG等损伤因子对足细胞的影响以及MSCs-Exo对足细胞的保护作用体外培养足细胞,分别应用不同浓度的HG、糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)刺激足细胞并与MSCs-Exo共培养,应用CCK8和流式细胞术检测足细胞的活性和凋亡情况。HG刺激足细胞并与MSCs-Exo共培养24h后,免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测足细胞内肌动蛋白(F-actin)的表达和排列情况;超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium,DHE)检测足细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;线粒体膜电位检测试剂盒检测足细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)变化。1.3 MSCs-Exo对HG状态下足细胞NLRP3通路的作用体外培养足细胞,应用HG刺激足细胞并与MSCs-Exo共培养,24h后,实时荧光定量聚合酶链反应(Real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、WB检测各组细胞NLRP3及其下游信号蛋白Caspase-1、ASC、IL-1β和炎症因子IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α的表达情况。1.4 MSCs-Exo对DKD生理指标和肾组织中NLRP3通路的作用将10周雄性Ⅱ型DKD模型鼠(db/db鼠)作为实验组,随机分为3组:DKD组、MSCs-Exo注射组(DKD+Exo组)、胰岛素治疗组(DKD+Ins组),同周龄雄性db/m小鼠作为正常对照组(Con组)。按分组情况处理4周后,检测体重、血糖、24小时尿蛋白等指标;苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)、IF、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、过碘酸雪夫氏(Periodic acid Schiff,PAS)和Masson染色观察肾小球发生的病理改变;TEM观察肾小球足突、基底膜等超微结构的改变;ELISA、RT-qPCR、WB检测肾组织中炎症因子、NLRP3及其下游信号蛋白的表达情况。2.MSCs-Exo对足细胞和DKD肾组织NLRP3通路的作用机制2.1确定MSCs-Exo中对足细胞和DKD肾组织NLRP3发挥作用的miRNA为探讨MSCs-Exo对足细胞和DKD肾组织NLRP3的作用机制,我们对MSCs-Exo中的生物活性物质进行分析,应用生物信息学方法预测MSCs-Exo中表达量排名前十位的miRNA的靶基因,寻找出MSTofacitinib细胞培养Cs-Exo中可能对足细胞NLRP3发挥作用的目的miRNA。双荧光素酶报告基因检测验证挑选出的目的miRNA与NLRP3 mRNA 3’UTR的靶向调控作用。2.2 MSCs-Exo中miR-22-3p对足细胞活性的影响应用miR-22-3p抑制物(Inhibitor)和模拟物(Mimic)转染MSCs后提取外泌体,分别获得低表达miR-22-3p的MSCs-Exo(Exo-K)和高表达miR-22-3p的MSCs-Exo(Exo-M)以用于后续细胞和动物实验。CCK8检测MSCs-Exo中miR-22-3p表达高低对足细胞活性的影响。2.3 MSCs-Exo中miR-22-3p对HG状态下足细胞NLRP3通路的作用体外培养足细胞,应用HG刺激足细胞并分别与Exo-K和Exo-M共培养,24h后,ELISA检测各组足细胞炎症因子的表达情况;RT-qPCR、WB检测各组足细胞NLRP3及其下游信号蛋白mRNA和蛋白水平的表达情况。2.4 MSCs-Exo中miR-22-3p对DKD及肾组织中NLRP3的作用将10周雄性db/db鼠随机分为4组:糖尿病肾病对照组(DKD组)、MSCs-Exo注射组(DKD+Exo 组)、Exo-Scram 注射组(DKD+Exo-Scram 组)、Exo-K 注射组(DKD+Exo-K组)。4组小鼠按分组情况处理4周后,检测血糖、体重、24小时尿蛋白等指标;HE、IF、IHC、PAS和Masson染色观察肾小球发生的病理改变;TEM观察肾小球足突、基底膜等超微结构的改变;ELISA、RT-qPCR、WB检测肾组织中炎症因子、NLRP3及其下游信号蛋白的表达情况。研究结果1.MSCs-Exo可保护HG状态下足细胞和DKD且对NLRP3通路有抑制作用1.1 MSCs-Exo可减轻HG、AGEs、TNF-α对足细胞的损伤作用MSCs-Exo经NTA、TEM以及WB检测鉴定合格,共聚焦显微镜观察发现PKH-6Preclinical pathology7染料标记的MSCs-Exo可被足细胞摄取。CCK8发现MSCs-Exo可改Dinaciclib化学结构善HG、AGEs、TNF-α引起的足细胞活性降低。流式细胞术显示,MSCs-Exo可缓解由HG、AGEs、TNF-α引起的足细胞凋亡。MSCs-Exo还可减轻HG状态下足细胞骨架蛋白F-actin的病理改变,降低足细胞内ROS,提高足细胞MMP水平。1.2 MSCs-Exo可抑制HG状态下足细胞NLRP3通路的激活ELISA、RT-qPCR、WB检测显示HG可使足细胞内NLRP3通路激活,炎症因子IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α表达增多;NLRP3及其下游信号蛋白Caspase-1、ASC、IL-1β以及上清液中活化裂解因子Cl Caspase-1 p20、Cl IL-1β p17的表达增加。IF显示HG还可导致足细胞裂孔膜结构蛋白Nephrin表达减少,足细胞损伤蛋白Desmin表达增加。MSCs-Exo则可抑制HG状态下NLRP3通路的激活,减轻上述炎症因子和NLRP3通路炎症蛋白的表达。1.3 MSCs-Exo可保护DKD小鼠肾脏且对肾组织中NLRP3通路有抑制作用MSCs-Exo与胰岛素注射4周后检测发现,与DKD组相比,MSCs-Exo、胰岛素可以使小鼠血糖、尿蛋白、体重、肾肥大指数等指标降低。ELISA、RT-qPCR、WB检测显示,MSCs-Exo、胰岛素注射组小鼠体内NLRP3通路活化明显被抑制,炎症因子表达减少,NLRP3及其下游信号蛋白表达均减少;HE、IF、IHC、PAS、Masson染色显示肾小球糖原沉积、纤维化、炎症细胞浸润等减少;TEM显示由DKD导致的肾小球基底膜增厚、足突脱落以及融合均得到改善。2.MSCs-Exo对HG状态下足细胞和DKD内NLRP3作用机制研究2.1 MSCs-Exo 中 miR-22-3p 可靶向调控 NLRP3miR-22-3p是MSCs-Exo中表达量排名第三位的miRNA,生物信息学方法预测NLRP3是miR-22-3p的靶基因。双荧光素酶报告基因检测验证miR-22-3p可靶向调控NLRP3 mRNA的3′-UTR,因此我们假设MSCs-Exo可通过其所携带的miR-22-3p调控NLRP3,对足细胞和DKD发挥保护作用。2.2 miR-22-3p可增强MSCs-Exo对足细胞活性的保护作用应用 miR-22-3p Inhibitor、Mimic 转染 MSCs 后分别获得低表达 miR-22-3p的 MSCs-Exo(Exo-K)和过表达 miR-22-3p 的 MSCs-Exo(Exo-M)。CCK8 发现,与MSCs-Exo相比,Exo-K对足细胞活性的保护作用减弱,Exo-M对足细胞活性的保护作用增强。2.3 miR-22-3p可增强MSCs-Exo对HG状态下足细胞NLRP3通路的抑制作用ELISA、RT-qPCR、WB 等检测显示,miR-22-3p 缺乏使 MSCs-Exo 对 HG 状态下足细胞内NLRP3通路的抑制作用降低;过表达miR-22-3p则使MSCs-Exo对HG状态下足细胞内NLRP3通路的抑制作用增强。2.4 miR-22-3p缺乏在一定程度上减弱MSCs-Exo对DKD肾组织中NLRP3的抑制作用与MSCs-Exo注射组DKD小鼠相比,低表达miR-22-3p使MSCs-Exo对DKD小鼠的治疗作用在一定程度上受到抑制,主要表现为血糖有所升高;MSCs-Exo对DKD小鼠肾组织中NLRP3的抑制作用有所减弱,肾组织中NLRP3的mRNA和蛋白水平均有所回升。结论1.MSCs-Exo可缓解HG、AGEs等糖尿病状态下常见的刺激因子对足细胞的损伤,提高足细胞活性,减轻足细胞凋亡,对足细胞有保护作用。2.MSCs-Exo可抑制由HG引起的足细胞NLRP3介导的固有免疫通路的激活,抑制NLPP3下游信号通路蛋白的活化,抑制炎症反应。体内实验中,MSCs-Exo可缓解DKD小鼠的肾脏损伤,保护肾功能,抑制肾组织中NLRP3信号通路的激活。3.MSCs-Exo抑制NLRP3的可能机制:MSCs-Exo中的miR-22-3p可靶向足细胞和肾组织中的NLRP3基因,下调NLRP3的表达水平,从而抑制NLRP3固有免疫通路的激活,减轻炎症反应。4.本研究发现MSCs-Exo通过其携带的miR-22-3p靶向抑制足细胞和DKD肾组织中NLRP3,从而抑制NLRP3通路的激活及其所介导的炎症反应,或可为临床DKD的治疗提供新的理论基础。