大豆作为一种豆科植物,能够与土壤中的根瘤菌建立共生关系形成共生根瘤,并通过固氮作用将空气中的氮气转化为氨,为大豆生长提供充足的氮素。大豆与根瘤菌共生结瘤是一个极其复杂且精细的过程。然而,这个过程很容易受到各种非生物胁迫的影响,导致根瘤发生失败。氯吡嘧磺隆(Halosulfuron-methyl,HSM)是一种磺酰脲类除草剂,被广泛用于防除玉米、水稻、小麦、甘蔗等作物田的阔叶杂草和莎草科杂草。大豆作为后茬作物以及间套种作物,极容易受到HSM残留的影响,导致大豆产生药害。研究已经发现氯吡嘧磺隆在土壤中的残留能够抑制大豆与根瘤菌共生结瘤。然而,这个现象背后隐藏的分子机制仍然不清楚。已有研究发现E3泛素连接酶在非生物胁迫响应以及豆科植物共生结瘤过程中发挥关键作用,但E3泛素连接酶是否参与氯吡嘧磺隆胁迫抑制大豆结瘤过程仍然还不清楚。本研究通过组学、生理生化以及分子生物学方法揭示了E3泛素连接酶在氯吡嘧磺隆胁迫抑制大豆结瘤中的调控机制。主要研究结果如下:1.HSM(0.01、0.05和0.5 mg/L)胁迫显著降低了大豆叶绿素和类胡萝卜素含量,严重影响了叶绿素a荧光强度,并显著增加了谷胱甘肽、过氧化氢、丙二醛含量和抗氧化酶活性。另外,HSM胁迫显著抑制了大豆叶片中参与三羧酸循环(TCA循环)的主要酶的活性,包括α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶、苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶。蛋白组学结果显示,HSM胁迫下大豆叶片中参与叶绿素合成、光合作用系统和TCA循环的多种蛋白质水平显著降低。此外,代谢组学结果显示,HSM胁迫下大豆叶片中参与TCA循环的关键中间代谢产物含量也显著降低。上述结果表明,HSM胁迫主要通过破坏光合作用系统、抑制叶绿素合成、阻断TCA循环有效运转和引起氧化损伤对大豆产生毒性作用。2.在0.01 mg/L HSM胁迫下,大豆结瘤数量显著降低38%。进一步对0.01 selleck激酶抑制剂mg/L HSM胁迫下大豆与根瘤菌共生结瘤过程进行转录组学分析。结果显示,参与类黄酮合成和植物激素信号转导的差异表达基因显著下调。这与本研究中HSM胁迫下共生过程中类黄酮化合物含量和植物激素含量的降低一致。0.01mg/L HSM胁迫7天后,接种根瘤菌的大豆根系中IAA、ABA、ZR、JA和GA3含量显著降低了56%、59%、74%、57%和55%,而类黄酮化合物含量下降了42%。另外,参与共生结瘤过程信号通路的多个基因的表达受到显著抑制,特别是结瘤因子受体(NFR5A)和共生信号通路基因(NSP1),分别下调了9.0和7.9倍。结果表明,HSM可能通过抑制共生过程中根系黄酮类化合物合成、破坏共生过程中植物内源激素平衡、破坏大豆根瘤菌的共生信号转导以及阻断共生过程中激素信号传导来抑制大豆结瘤。3.为了进一步揭示HSM抑制大豆结瘤的分子机制,我们通过酵母双杂交实验筛选到一个与共生信号通路基因GmNSP1互作的E3泛素连接酶,GmSNE3(KAH1261024.1)。酵母回转、双分子荧光互补(BIFC)以及Pull-down结果显示GmSNE3能够与GmNSP1在体外和体内相互作用。另外,qRT-PCR分析显示GmSNE3在根瘤中的表达量显著低于茎、叶和根,并且GmSNE3在大豆与根瘤菌共生过程中始终保持在较低的表达水平。上述结果表明,GmSNE3可能在大豆根瘤的形成中起到负调控作用。4.HSM胁迫4和7天后,大豆根系中GmSNE3的表达量显著上调3.3倍和2.2倍,并且过表达GmSNE3显著降低大豆植株56.1%的结瘤量。另外,qRT-PCR分析显示GmSNE3过表达植株根系中GmNSP1下游重要结瘤基因(GmNIN、GmERN1、GmENOD40)的表达量显著下调。此外,HSM胁迫下,GmNSP1下游重要结瘤基因(GmNIN、GmERN1、GmENOD40)的表达量也表现medical journal出显著下调的结果。上述结果表明,HSM胁迫抑制大豆结瘤是通过GmSEN3与GmNSP1相互CP-690550体内实验剂量作用来抑制GmNSP1下游基因的表达造成。5.生理生化分析表明,GmSNE3具有E3泛素连接酶活性。进一步研究发现,GmSNE3能够介导GmNSP1蛋白的泛素化降解,并且HSM胁迫能够促进GmNSP1蛋白的泛素化降解。这些结果揭示了E3泛素连接酶在调控HSM胁迫抑制大豆结瘤中的分子机制:HSM胁迫通过诱导GmSNE3来增强GmNSP1的泛素化降解,进而使GmNSP1不能对其下游重要结瘤基因进行调控,最终导致结瘤减少。综上所述,本研究鉴定到一个与共生结瘤关键蛋白GmNSP1互作的E3泛素连接酶(GmSNE3),并揭示了其在HSM胁迫抑制大豆结瘤中的调控作用。研究发现HSM胁迫通过诱导GmSNE3促进GmNSP1的泛素化降解,进而抑制GmNSP1对下游靶标基因的调控,最终导致大豆结瘤减少。研究结果为除草剂胁迫抑制共生结瘤的分子机制提供了新的认识,为氯吡嘧磺隆除草剂的环境风险评估和科学使用提供依据,为开发耐氯吡嘧磺隆除草剂大豆提供基因资源,以及为氯吡嘧磺隆残留污染下培育高效共生结瘤大豆提供重要的目标基因和理论基础,对提升大豆产量和品质以及发展绿色可持续农业具有重要意义。